两亲性蛋白—聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的新用途

摘要

本发明公开了两亲性蛋白—聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的新用途。本发明所公开的新用途为如下1)或2)或3)所述的物质在使油相物质和水相物质相溶中的应用：1)聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP；2)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与其他蛋白质组成的组合物；3)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与表面活性剂组成的组合物。该两亲性蛋白能有效乳化柴油、润滑油、大豆食用油等各种油类物质以及氯仿等有机溶剂。相同浓度下，该两亲性蛋白的乳化能力和乳化稳定性均明显优于传统的化工类表面活性剂和商品化的洗涤剂。

权利要求

1.如下1）或2）或3）所述的物质在使油相物质和水相物质相溶中的应用：

1）聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP；

2）由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与其他蛋白质组成的组合物；

3）由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与表面活性剂组成的组合物；

所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述2）中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述其他蛋白质的质量比为1：

1；

所述3）中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述表面活性剂的质量比为1：

1；

所述其他蛋白质为牛血清蛋白；

所述表面活性剂为吐温20；

所述油相物质为如下中的至少一种：石化油、食用油和疏水性有机溶剂；

所述水相物质为水。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述石化油为柴油或润滑油；

所述食用油为大豆油；

所述疏水性有机溶剂为氯仿。

3.一种使油相物质和水相物质相溶的方法，包括如下步骤：将如下a）或b）或c）所述的物质与水相物质和油相物质混合，再振荡，然后再静置，得到油相物质和水相物质相溶层，即使油相物质和水相物质相溶；

a）聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP；

b）由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与其他蛋白质组成的组合物；

c）由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与表面活性剂组成的组合物；

所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述b）中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述其他蛋白质的质量比为1：

1；

所述c）中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述表面活性剂的质量比为1：

1；

所述混合的方法为先将所述a）中所示蛋白、所述b）中所示组合物或所述c）中所示组合物与所述水相物质混合，得到的混合物记作混合物ⅰ，再将所述混合物ⅰ与所述油相物质混合；

所述油相物质为如下中的至少一种：石化油、食用油和疏水性有机溶剂；

所述水相物质为水；

所述其他蛋白质为牛血清蛋白；所述表面活性剂为吐温20；

所述石化油为柴油或润滑油；

所述食用油为大豆油；

所述疏水性有机溶剂为氯仿；

所述混合物ⅰ的浓度为如下1）或2）或3）所示：

1）所述混合物ⅰ为将所述a）中所示蛋白与所述水相物质混合得到的混合物时，所述混合物ⅰ中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为10μg/ml-1000μg/ml；

2）所述混合物ⅰ为将所述b）中所示组合物与所述水相物质混合得到的混合物时，所述混合物ⅰ中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为250μg/ml；所述其他蛋白质的浓度为250μg/ml；

3）所述混合物ⅰ为将所述c）中所示组合物与所述水相物质混合得到的混合物时，所述混合物ⅰ中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为250μg/ml；所述表面活性剂的浓度为250μg/ml；

所述油相物质与所述混合物ⅰ的体积比为：1:1；

所述振荡为旋涡振荡或超声振荡；

所述旋涡振荡的振荡速度为1300rpm，振荡时间为120秒；

所述超声振荡的输出功率为80W，振荡时间为30秒；

所述静置是在避光、25℃下静置2天-150天。

4.聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP在制备高分子材料颗粒中的应用；

所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述高分子材料为聚乳酸。

5.一种制备高分子材料颗粒的方法，包括以下步骤：（1）将聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与水相物质混合，得到的混合物记作混合物Ⅰ；

（2）将高分子材料溶解在油相物质中，得到的混合物记作混合物Ⅱ；

（3）将混合物Ⅰ与混合物Ⅱ混合，再振荡，得到的混合物记作混合物Ⅲ；

（4）除去混合物Ⅲ中的油相物质，即得到高分子材料颗粒；

所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述混合物Ⅰ中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为1000μg/ml；

所述混合物Ⅱ中所述高分子材料的浓度为50mg/ml；

所述混合物Ⅰ与混合物Ⅱ混合的体积比为20:1；

所述高分子材料为聚乳酸；

所述油相物质为氯仿；

所述振荡为超声振荡；所述超声振荡的输出功率为200W，振荡时间为5分钟；

除去氯仿的方法为将所述混合物Ⅲ放置在通风橱中搅拌。

6.一种使油相物质和水相物质相溶的组合物，为如下1）或2）所示：

1）由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与其他蛋白质组成的组合物；

2）由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与表面活性剂组成的组合物；

所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述1）中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述其他蛋白质的质量比为1：

1；

所述2）中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述表面活性剂的质量比为1：

1；

所述其他蛋白质为牛血清蛋白；

所述表面活性剂为吐温20。

说明书

两亲性蛋白—聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的新用

途

技术领域

[0001] 本发明涉及两亲性蛋白-聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的新用途。 背景技术

[0002] 生物表面活性剂是一大类通过微生物得到两亲性小分子物质(Mulligan等，Environ Pollut，133(2005)，183-98；Khire 等，Adv Exp Med Biol，672(2010)，146-57；Morita等，Biotechnol Appl Biochem，53(2009)，39-49)，一般包括低分子量的糖脂、脂肽、磷脂、中性类脂等和高分子量的含脂聚合物，如脂多糖(glycolipids)、脂蛋白(lipopeptides或lipoproteins)、多糖-蛋白-脂肪酸复合物等(Syldatk等，Z NaturforschC，40(1985)，61-7；Ogawa等，Biosci Biotechnol Biochem，64(2000)，2466-8；
Morita等，J Biosci Bioeng，104(2007)，78-81；Wicke等，J Nat Prod，63(2000)，621-6)。 [0003] 它们的分子结构由两部分组成，一部分是疏油亲水的极性基团，如单糖、聚糖、氨基酸和磷酸基等，另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等。正是由于具有这种既亲油又亲水的两亲性分子结构，生物表面活性剂才能显著降低界面张力，或吸附在界面上形成紧密的定向排列来改变界面的亲水/亲油性能，使油/水两相得以很好的分散。其中最为代表的是糖脂类(Mata-Sandoval等，Microbiol Res，155(2001)，249-56；Guilmanov 等，Biotechnol Bioeng，77(2002)，
489-94；)。

[0004] 疏水蛋白(hydrophobin)是一类由丝状真菌特异产生的分泌型小分子蛋白质，能有效降低水表面张力，辅助基内菌丝脱离水相环境进而形成气生结构(Nakari-Setala等，Eur J Biochem，235(1996)，248-55；Askolin 等；Nakari-Setala 等，Appl MicrobiolBiotechnol，57(2001)，124-30；Linder 等，Biomacromolecules，2(2001)，511-7)。最近的研究表明，疏水蛋白由于其特殊的结构，能乳化油脂，自身是蛋白质，对人体没有毒害作用，可作为生物表面活性运用与食品、化妆品中(Valo等，ACS Nano，4(2010)，
1750-8；Zhang 等，Biotechnol Bioeng，104(2009)，582-9；Linder 等，Protein Sci，
11(2002)，2257-66；Kisko 等，Langmuir，25(2009)，1612-9；Lumsdon 等，Colloids Surf BBiointerfaces，44(2005)，172-8)。

[0005] 聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoic acids，简称PHA)是许多微生物在非平衡生长条件下合成的一种细胞内碳源和能源的贮藏性聚合物(Anderson等，Microbial Rev.，54(1990)450-472；Lee等，Biotech.Bioeng.，49(1996)1-14)。

[0006] 研究发现，自然条件下的PHA在细菌体内 是以不溶性脂肪颗粒(granule)的形 式存在。PHA分子形成疏水核心，颗粒表面包裹着一层特殊的单层膜结构，由颗粒结合蛋白(PhaP/Phasin)、调控蛋白(PhaR)、PHA合成酶(PhaC)、PHA降解酶(PhaZ)和单层磷脂膜等组成(Steinbüchel等，Can.J.Microbiol.41(1995)94-105；York等，J.Bacteriol.183(2001)2394-2397)。

[0007] 在不同的微生物中发现的PhaP蛋白也存在着微小差异。如，PhaPAh来自Aeromonas hydrophila，约12.6kDa；PhaPRe来自Ralstonia eutropha，约24kDa；PhaPWe来自Wautersia eutropha strain H16，有192个氨基酸残基，约20kDa；PhaPRr来自Rhodococcus ruber，约14kDa；以及其他的。但是主要的两亲性结构与功能都一致，并都来自于PHA颗粒表面。(Tian等，FEMS Microbiol Lett，244(2005)19-25；Yabuuchi等，Microbiol Immunol，39(1995)897-904；Potter 等，Microbiology，150(2004)2301-11；Pieper-Furst 等，J Bacteriol，177(1995)2513-23)

[0008] 调控蛋白，PhaR也表明出存在两种结合区域，DNA结合区域和颗粒结合区域(Maehara等，J.Bacteriol.184(2002)3992-4002)。DNA结合区域可以特异性的结合到phaP基因和phaR基因上游富含TGC的区域，从而调控PhaP蛋白和其自身的表达。而疏水的颗粒结合区域能通过疏水作用结合在PHA颗粒表面。和PhaP一样，通过PhaR和其他疏水材料的体外结合试验表明PhaR的疏水性结合是非特异性的(Yamashita等，Biomacromolecules，7(2006)2449-2454)。

[0009] PHA合酶，PhaC是PHA生物合成过程中的关键酶。PhaC之间的差异最终导致PHA的组分和比例。能够用羟基脂肪酸(HA)的辅酶A硫酯作为底物，催化HA脱去辅酶A聚合成为PHA。2000年的统计结果表明，已经从44种微生物中克隆得到了54个不同的PHA合酶基因，并且得到了其中44个PHA合酶的一级结构。近几年，有更多的PHA合酶基因被克隆出来。目前的研究支持PhaC存在亚基结构的假说，但是其两亲性的研究未曾设计到。

[0010] PHA解聚酶，PhaZ起着将PHA大分子降解成小分子寡聚体的作用(Jendrossek等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，46(1996)451-463；Briese 等，J.Environ.Polym.Degrad.，2(1994)75-87)。根据降解酶的定位，可以将其分为胞内降解酶和胞外降解酶两种，两种降解酶在一级序列上有明显的不同。胞内降解酶在PHA颗粒的表面上被发现，胞外降解酶被分泌到细胞外。当细胞处于碳源缺乏的环境中时，在胞内降解酶的作用下，储存的PHA被动用，为细胞生长提供碳源，从这个意义上说，胞内降解酶对于提高细胞在逆境中的生存能力有重要意义(Ruiz等，Appl.Environ.Microbiol.，67(2001)225-230)。胞外降解酶可以降解环境中存在的PHA为细胞提供碳源。同时有研究表明，PhaZ在体外具有极强的抗外界理化环境压力的能力。

发明内容

[0011] 本发明的一个目的是提供两亲性蛋白-聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的新用途。

[0012] 本发明所提供的提供的新用途为如下1)或2)或3)所述的物质在使油相物质和水相物质相溶中的应用：

[0013] 1)聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP；

[0014] 2)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与其他蛋白质组成的组合物； [0015] 3)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与表面活性剂组成的组合物。 [0016] 所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列可以如序列表中序列1所示；

[0017] 所述2)中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述其他蛋白质的质量比可以为1∶1；

[0018] 所述3)中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述表面活性剂的质量比可以为1∶1；

[0019] 所述其他蛋白质为牛血清蛋白；

[0020] 所述表面活性剂为吐温20；

[0021] 所述油相物质可以为如下中的至少一种：石化油、食用油和疏水性有机溶剂； [0022] 所述水相物质为水；

[0023] 所述石化油为柴油或润滑油；

[0024] 所述食用油为大豆油；

[0025] 所述疏水性有机溶剂为氯仿。

[0026] 本发明的另一个目的是提供一种使油相物质和水相物质相溶的方法。 [0027] 本发明所提供的使油相物质和水相物质相溶的方法，包括如下步骤：将如下a)或b)或c)所述的物质与水相物质和油相物质混合，再振荡，然后再静置，得到油相物质和水相物质相溶层，即使油相物质和水相物质相溶；

[0028] a)聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP；

[0029] b)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与其他蛋白质组成的组合物； [0030] c)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与表面活性剂组成的组合物。 [0031] 所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列可以如序列表中序列1所示；

[0032] 所述b)中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述其他蛋白质的质量比为1∶1；

[0033] 所述c)中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述表面活性剂的质量比为1∶1；

[0034] 所述混合的方法为先将所述a)中所示蛋白、所述b)中所示组合物或所述c)中所示组合物与所述水相物质混合，得到的混合物记作混合物i，再将所述混合物i与所述油相物质混合；

[0035] 所述油相物质可以为如下中的至少一种：石化油、食用油和疏水性有机溶剂； [0036] 所述水相物质为水；

[0037] 所述其他蛋白质可以为牛血清蛋白，但不限于牛血清蛋白；所述表面活性剂可以为吐温20；

[0038] 所述石化油为柴油或润滑油；

[0039] 所述食用油为大豆油；

[0040] 所述疏水性有机溶剂为氯仿；

[0041] 所述混合物i的浓度为如下1)或2)或3)所示：

[0042] 1)所述混合物i为将所述a)中所示蛋白与所述水相物质混合得到的混合物时，所述混合物i中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为10μg/ml-1000μg/ml或200μg/ml-1000μg/ml或400μg/ml-1000μg/ml或200μg/ml-400μg/ml或100μg/ml-200μg/ml或50μg/ml-100μg/ml或10μg/ml或50μg/ml或100μg/ml或200μg/ml或400μg/ml或500μg/ml或1000μg/ml；

[0043] 2)所述混合物i为将所述b)中所示组合物与所述水相物质混合得到的混合物时，所述混合物i中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为250μg/ml；所述其它蛋白的浓度为250μg/ml；

[0044] 3)所述混合物i为将所述c)中所示组合物与所述水相物质混合得到的混合物时，所述混合物i中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为250μg/ml；所述表面活性剂的浓度为250μg/ml；

[0045] 所述油相物质与所述混合物i的体积比为：1∶1；

[0046] 所述振荡为旋涡振荡器或超声振荡；

[0047] 所述旋涡振荡的振荡速度为1300rpm，振荡时间为120秒；

[0048] 所述超声振荡的输出功率为80W，振荡时间为30秒；

[0049] 所述静置是在避光、25℃下静置2天-150天或2天或30天或150天。

[0050] 聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP在制备高分子材料颗粒中的应用也属于本发明的保护范围。

[0051] 所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列可以如序列表中序列1所示；

[0052] 所述高分子材料为聚乳酸。

[0053] 本发明的又一个目的是提供一种制备高分子材料颗粒的方法。

[0054] 本发明所提供的制备高分子材料颗粒的方法，包括以下步骤：

[0055] (1)将聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与水相物质混合，得到的混合物记作混合物I；

[0056] (2)将高分子材料溶解在油相物质中，得到的混合物记作混合物II； [0057] (3)将混合物I与混合物II混合，再振荡，得到的混合物记作混合物III； [0058] (4)除去混合物III中的油相物质，即得到高分子材料颗粒。

[0059] 所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的氨基酸序列可以如序列表中序列1所示；

[0060] 所述混合物I中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP的浓度为1000μg/ml； [0061] 所述混合物II中所述高分子材料的浓度为50mg/ml；

[0062] 所述混合物I与混合物II混合的体积比为20∶1；

[0063] 所述高分子材料为聚乳酸；

[0064] 所述油相物质为氯仿；

[0065] 所述振荡为超声振荡；所述超声振荡的输出功率为200W，振荡时间为5分钟； [0066] 所述除去氯仿的方法为将所述混合相放置在通风橱中搅拌。

[0067] 本发明的又一个目的是提供一种使油相物质和水相物质相溶的组合物。 [0068] 本发明所提供的使油相物质和水相物质相溶的组合物，为如下1)或2)所示： [0069] 1)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与其他蛋白质组成的组合物； [0070] 2)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与表面活性剂组成的组合物； [0071] 所述1)中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述其他蛋白质的质量比为1∶1；

[0072] 所述2)中所述聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP与所述表面活性剂的质量比为1∶1；

[0073] 所述其他蛋白质为牛血清蛋白；

[0074] 所述表面活性剂为吐温20。

[0075] 本发明所提供的两亲性蛋白-聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP安全可靠，分子量小，完全由天然的氨基酸组成，在蛋白降解的因素的作用下，可完全降解成氨基酸。存在疏水区域(或亲油区域)与亲水区域，疏水区域与油相结合，亲水区域与水相结合，起到隔离油水两相，乳化油相的能力。该两亲性蛋白能有效乳化柴油、润滑油、大豆食用油等各种油类物质以及氯仿等有机溶剂。相同浓度下，该两亲性蛋白的乳化能力和乳化稳定性均明显优于传统的化工类表面活性剂和商品化的洗涤剂。该两亲性蛋白还可以作为一种在高温处理后不失去原有的强两亲性的蛋白类生物小分子，可以 用于乳化需要加热处理的液态疏水性油相。

附图说明

[0076] 图1为重组表达质粒pWDX-phaP的构建图。

[0077] 图2为重组表达质粒pWDX-phaP的DNA电泳图。其中，泳道M为1kb DNAmarker，泳道P为阳性克隆菌液的PCR扩增产物。

[0078] 图3为融合表达PhaP的E.coli BL21(DE3)全蛋白和纯化后的PhaP的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道M：蛋白marker，泳道1：没有添加IPTG诱导表达的菌体全蛋白，泳道2-4：添加IPTG诱导表达PhaP的菌体全蛋白，泳道5：纯化后的PhaP。

[0079] 图4为不同混合方式下不同浓度PhaP乳化大豆食用油形成的微乳颗粒微观结构的比较。其中A为浓度为1000μg/ml的PhaP蛋白水溶液涡旋振荡120秒的微乳颗粒微观结构；B为浓度为100μg/ml的PhaP蛋白水溶液涡旋振荡120秒的微乳颗粒微观结构；C为浓度为1000μg/ml的PhaP蛋白水溶液超声振荡30秒的微乳颗粒微观结构；D为浓度为100μg/ml的PhaP蛋白水溶液超声振荡30秒的微乳颗粒微观结构。

[0080] 图5为利用PhaP作为表面活性剂制备的高分子材料颗粒。

具体实施方式

[0081] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0082] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0083] 实施例1、两亲性的蛋白质的原核表达以及纯化

[0084] 利用基因工程的方法将两亲性的蛋白质重组后，在微生物中过量表达。分离纯化得到纯度高的蛋白样品。使用两亲性蛋白是Aeromonas hydrophila中的PhaPAh。将其在原核或真核过量表达，并用his标签亲和纯化。

[0085] 具体操作如下：

[0086] (1)重组表达质粒pWDX-phaP的构建

[0087] 质粒载体为pPI:EGFP(公众可从清华大学获得，记载过该质粒的非专利 文 献 是：Wang ZH，Wu HN，Chen J，Zhang J，Yao YC.Chen GQ.2008.A novel self-cleavingphasin tag for purification of recombinant proteins based on hydrophobicpolyhydroxyalkanoate nanoparticles.Lab Chip 8.1957-1962.)，含有可以编码PhaPAh的基因。首先除去载体上原有的Ssp DnaB mini intein和EGFP；以质粒pPI:EGFP为模板，用引物P1-up/down进行PCR获得除Ssp DnaB mini intein和EGFP以外的大片段。然后用DNA限制性内切酶Nde I和DNA连接酶将PCR产物连接成一个新的环状质粒。以得到的新的环状质粒为模板，用引物P2-up/down进行PCR向PCR产物插入His标 签，用DNA限制性内切酶Nco I以及DNA连接酶将PCR产物连接成一个新的环状重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自天根生化科技有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定。通过琼脂糖DNA电泳分析的结果见图2，从图中可见，阳性克隆菌液的PCR扩增产物介于6kb和7kb之间，与预计的理论值6257bp基本一致。提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果如下：

[0088] 在重组质粒的T7启动子下游插入了序列表中序列2所示的基因片段，经序列分析证明与公布的PhaP蛋白的编码基因序列完全一致。说明该重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pWDX-phaP(见图1)。序列表中序列2编码如序列表中序列1所示的PhaP蛋白的氨基酸序列，序列表中序列1由116个氨基酸组成(包含起始氨基酸Met，缩写为M)。以上PCR扩增所需引物见表1。

[0089] 表1构建pWDX-PhaP的引物

[0090]

[0091] (2)用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)原核表达系统生产重组蛋白

[0092] 将步骤(1)构建的重组质粒pWDX-phaP导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自天根生化科技有限公司)中，涂抹抗性平板(含氨苄100μg/ml)筛选阳性菌落。挑取一个阳性菌落，加入200ml LB液体培养基中(含氨苄100μg/ml)，37℃振荡培养至OD600为0.5-0.8，加入终浓度为0.3mM-0.5mM的IPTG，16℃过夜诱导表达融合蛋白，获得诱导后菌液。同时设不加IPTG的菌液为空白对照。

[0093] (3)通过超声波的方法裂解菌体，并利用His标签亲和层析纯化PhaP [0094] 将步骤(2)的菌液进行离心，转速为8000rpm，离心2-3分钟，弃上清，将菌体重悬于binding buffer溶液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑(imidazole)，pH＝7.9)，冰浴，超声破碎细胞。以11000rpm的转速离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。将细胞粗提物倒入处理好的His标签亲和层析纯化柱(美国，默克)，依次加入binding buffer、wash buffer(0.5M NaCl，60mM Tris-HCl，20mM imidazole， pH＝7.9)和elute buffer(0.5M NaCl，1M Tris-HCl，20mM imidazole，pH＝7.9)，收集最后得到的液体。

[0095] (4)利用超滤操作除去溶液中多余的盐分

[0096] 将步骤(3)纯化得到的液体加入超滤管(美国，Miliipore，型号为3k Dα)至最大限额，5000rpm离心1小时后，保留超滤管内管中残余液体。加入超纯水至超滤管最大限额，继续离心，反复上述操作5次。超滤管内管中液体为除去多余盐分的PhaP蛋白溶液。 [0097] (5)利用冷冻干燥技术得到纯的固体粉末状PhaP

[0098] 将步骤(4)得到的除去多余盐分的PhaP蛋白溶液在-80℃冷冻，结冰后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥24小时。得到白色固体粉末状PhaP蛋白。

[0099] 称取少量的固体粉末状PhaP蛋白溶解于超纯水中，并同未表达PhaP的E.coliBL21(DE3)全蛋白和融合表达PhaP的E.coli BL21(DE3)全蛋白一同进行SDS-PAGE检验。蛋白电泳结果见图3。从图中可见，PhaP加上融合表达的His标签分子大小为约14k Da，与文献报道分子量一致。

[0100] 实施例2、两亲性蛋白乳化柴油的能力和乳化层稳定性

[0101] 将表面活性剂的水溶液与各种油相物质混合于同样规格的玻璃小瓶中。混合方式主要有利用涡旋振荡器振荡和利用超声仪短时超声处理。静置一段时间后，观察记录油层(oil layer)、乳化层(emulsion layer)和水层(water layer)的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值(Emulsion Index)。乳化值计算公式如下：

[0102] 乳化值＝乳化层/(油层+乳化层+水层)×100％ (1)

[0103] 其中，所有层总高是指油层、乳化层和水层三层的总高度。但有时水层或油层在乳化后可能消失，则总高为余下两层(layers)的高度之和。乳化值越大，说明乳化能力越强。 [0104] 两亲性的蛋白质与相同浓度的传统化工类表面活性剂、商品化洗涤剂以及牛血清蛋白用于乳化柴油能力的比较。两亲性蛋白为上述实施例1制备的PHA颗粒结合蛋白PhaP(或称Phasin)；传统化工类表面活性剂分别为高纯的十二烷基磺酸钠(美国，Biosharp，纯度≥95.0％)、油酸钠(中国，华大化工，纯度≥95.0％)和吐温20(中国，展晨生物，纯度≥98.0％)，商品化洗涤剂为洗洁精(中国，立白洗洁精)；油相为柴油(中国，中石化)。

[0105] 利用具体操作如下：

[0106] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的500μg/ml，同样将十二烷基磺酸钠、油酸钠、吐温20、商品化洗涤剂和牛血清蛋白配制成500μg/ml的浓度。 [0107] 2)分别取0.5ml的两亲性蛋白水溶液与0.5ml柴油混合于玻璃小瓶中，同时， 分别取0.5ml上述其他表面活性剂水溶液与0.5ml柴油混合于同样规格的玻璃小瓶中，在室温下，利用涡旋振荡器最大限度(约1300转每秒)振荡120秒。

[0108] 3)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，观察并记录油层(oil layer)、乳化层(emulsion layer)和水层(water layer)的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值(Emulsion Index)。

[0109] 4)以混合后静置第2天、第30天和第150天的乳化值变化作为乳化稳定性的研究依据。

[0110] 结果：

[0111] 静置第2天，以十二烷基磺酸钠和PhaP为表面活性剂的样品有明显的乳化层；以油酸钠、吐温20、商品化洗涤剂和牛血清蛋白为表面活性剂的样品没有明显的乳化层。 [0112] 十二烷基磺酸钠产生的乳化层比PhaP产生的乳化层少。表明PhaP乳化柴油的能力明显，比传统的化工类表面活性剂的乳化能力强。

[0113] 同为蛋白质的牛血清蛋白，未能乳化柴油。说明只有具有双亲性的蛋白质(或多肽)才能作为表面活性剂，用于乳化柴油。

[0114] 静置第30天，十二烷基磺酸钠产生的乳化层明显减少，PhaP产生的乳化层没有变化。说明PhaP不但具有很强的乳化柴油的能力，还具有很强的乳化层稳定性。 [0115] 静置第150天，十二烷基磺酸钠产生的乳化层较静置第30天的乳化层减少，而PhaP产生的乳化层依然没有明显变化。进一步说明PhaP不但具有很强的乳化柴油的能力，还具有很强的乳化层稳定性。

[0116] 不同表面活性剂乳化柴油的乳化值见表2。

[0117] 表2 不同表面活性剂乳化柴油的乳化值

[0118]

[0119]

[0120] 实施例3、不同浓度的两亲性的蛋白质水溶液乳化柴油的能力比较

[0121] 不同浓度的两亲性的蛋白质水溶液乳化等量的柴油将有不同的现象，油相为柴油(中国，中石化)。

[0122] 具体操作如下：

[0123] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和1000μg/ml七个浓度等级。 [0124] 2)分别取0.5ml的蛋白水溶液与0.5ml柴油混合于同样规格的玻璃小瓶中，利用涡旋振荡器最大限度(约1300rpm)振荡120秒。

[0125] 3)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，静置第2天观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0126] 结果：

[0127] 相同体积的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和1000μg/ml七个浓度等级的PhaP蛋白水溶液乳化柴油的结果为：高浓度的样品(200μg/ml、400μg/ml和1000μg/ml PhaP)有明显的乳化层和水层(水相)，中浓度(50μg/ml和
100μg/ml PhaP)有明显的乳化层和油层(油相)，而低浓度(10μg/ml PhaP)存在油层、乳化层和水层。

[0128] 不同浓度的PhaP蛋白水溶液乳化柴油的乳化值见表3。

[0129] 表3 不同浓度的PhaP蛋白水溶液乳化柴油的乳化值

[0130]

[0131] 从表3可见，相同体积的PhaP蛋白水溶液，浓度越高，乳化柴油的乳化值越高。 [0132] 实施例4、两亲性的蛋白质乳化润滑油能力和乳化稳定性

[0133] 两亲性的蛋白质与传统化工类表面活性剂、商品化洗涤剂以及牛血清蛋白用于乳化润滑油能力的比较。两亲性的上述实施例1制备的PHA颗粒结合蛋白PhaP；传统化工类表面活性剂分别为高纯的十二烷基磺酸钠、油酸钠和吐温20，商品化洗涤剂为洗洁精(中国，立白洗洁精)；油相为润滑油(美国，美孚)。

[0134] 具体操作如下：

[0135] 将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的500μg/ml，同样将十二烷基磺酸钠、油酸钠、吐温20、商品化洗涤剂和牛血清蛋白配制成500μg/ml的浓度。 [0136] 分别取0.5ml的PhaP蛋白水溶液(或其他表面活性剂)与0.5ml润滑油混合于玻璃小瓶中，同时，分别取0.5ml上述其他表面活性剂水溶液与0.5ml润滑油混合于同样规格的玻璃小瓶中，利用涡旋振荡器最大限度(约1300rpm)振荡120秒。

[0137] 将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0138] 混合后静置第2天、第30天和第150天的乳化值变化作为乳化稳定性的研究依据。

[0139] 结果：

[0140] 静置第2天，只有以PhaP为表面活性剂的样品有明显的乳化层；以十二烷基磺酸钠、油酸钠、吐温20、商品化洗涤剂和牛血清蛋白为表面活性剂的样品没有明显的乳化层。 [0141] 同为蛋白质的牛血清蛋白，未能乳化润滑油。说明只有具有双亲性的蛋白质(或多肽)才能作为表面活性剂，用于乳化润滑油。

[0142] 静置第30天，PhaP产生的乳化层没有变化。说明PhaP不但具有很强的乳化乳化润的能力，还具有很强的乳化层稳定性。

[0143] 不同表面活性剂乳化润滑油的乳化值见表4。

[0144] 表4 不同表面活性剂乳化润滑油的乳化值

[0145]

[0146]

[0147] 从表4可见，PhaP乳化润滑油的乳化值明显高于十二烷基磺酸钠、油酸钠、吐温20、商品化洗涤剂和牛血清蛋白乳化润滑油的乳化值，说明PhaP乳化润滑油的能力明显比传统的化工类表面活性剂和牛血清蛋白乳化润滑油的能力强。

[0148] 实施例5、不同浓度的两亲性的蛋白质水溶液乳化润滑油的能力比较。 [0149] 不同浓度的两亲性的蛋白质水溶液乳化等量的润滑油将有不同的现象，油相为润滑油(美国，美孚)。

[0150] 具体操作如下：

[0151] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、1000μg/ml七个浓度等级。 [0152] 2)分别取0.5ml的PhaP蛋白水溶液与0.5ml润滑油混合于同样规格的玻璃小瓶中，利用涡旋振荡器最大限度(约1300rpm)振荡120秒。

[0153] 3)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，静置第2天观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0154] 结果：

[0155] 相同体积的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和1000μg/ml七个浓度等级的PhaP乳化润滑油。高浓度的样品(200μg/ml、400μg/ml和1000μg/mlPhaP)只有明显的乳化层和水层(水相)，中浓度(50μg/ml和100μg/ml PhaP)和低浓度(10μg/ml PhaP)存在油层、乳化层和水层。

[0156] 润滑油中添加了其他的成分，比柴油等燃油更加粘稠。所以PhaP乳化润滑油的能力与乳化柴油相比较，能力较弱。

[0157] 不同浓度的PhaP蛋白水溶液乳化润滑油的乳化值见表5。

[0158] 表5 不同浓度的PhaP蛋白水溶液乳化润滑油的乳化值

[0159]

[0160] 从表5可见，相同体积的PhaP蛋白水溶液，浓度越高，乳化润滑油的乳化值越高。 [0161] 实施例6、不同浓度的两亲性的蛋白质乳化大豆食用油的能力比较

[0162] 不同浓度的两亲性的蛋白质乳化等量的大豆食用油将有不同的现象，油相为大豆食用油(中国，金龙鱼)。

[0163] 具体操作如下：

[0164] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、1000μg/ml七个浓度等级。 [0165] 2)分别取0.5ml的PhaP蛋白水溶液与0.5ml大豆食用油混合于同样规格的玻璃小瓶中，利用涡旋振荡器最大限度(1300rpm)振荡120秒。

[0166] 3)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，静置第2天观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0167] 结果：

[0168] 相同体积 的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、1000μg/ml七个浓度等级的PhaP乳化大豆食用油。高浓度的样品(200μg/ml、400μg/ml和1000μg/ml PhaP)只有明显的乳化层和水层(水相)，中浓度(50μg/ml和100μg/ml PhaP)和低浓度(10μg/ml PhaP)存在油层、乳化层和水层。

[0169] 不同浓度的PhaP蛋白水溶液乳化大豆油的乳化值见表6。

[0170] 表6 不同浓度的PhaP蛋白水溶液乳化大豆油的乳化值

[0171]

[0172]

[0173] 从表6可见，相同体积的PhaP蛋白水溶液，浓度越高，乳化大豆油的乳化值越高。 [0174] 实施例7、不同的混合方式对两亲性的蛋白质乳化油相的能力的比较。 [0175] 不同的油相与水相的混合方式可以影响乳化的效果。两亲性蛋白选择PhaP，油相选择食用大豆油(中国，金龙鱼)。具体操作如下：

[0176] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和1000μg/ml七个浓度等级。 [0177] 2)分别取0.5ml的PhaP蛋白水溶液与0.5ml大豆食用油混合于同样规格的玻璃小瓶中，分别用涡旋振荡器最大限度(1300rpm)振荡120秒和用超声仪短时超声处理(输出功率为80W)30秒。

[0178] 3)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，静置第2天观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0179] 结果：

[0180] 不同的振荡方式下PhaP蛋白水溶液乳化大豆油的乳化值见表7。

[0181] 表7不同的振荡方式下PhaP蛋白水溶液乳化大豆油的乳化值

[0182]

[0183] 从表7可见，相同体积的0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml 和1000μg/ml七个浓度等级的PhaP蛋白水溶液乳化大豆食用油，相同的浓度等级对比，使用超声处理的样品的乳化效果明显好于涡旋振荡器的振荡效果。表明PhaP作为表面活性剂乳化油脂的混合方式对乳化的效果有直接影响。

[0184] 实施例8、不同的浓度的两亲性的蛋白质形成的微乳颗粒微观结构的比较 [0185] 不同的浓度的两亲性的蛋白可以导致产生大小不同的微乳颗粒。两亲性蛋白选择PhaP，油相选择食用大豆油(中国，金龙鱼)。具体操作如下：

[0186] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的100μg/ml和1000μg/ml两个浓度等级。

[0187] 2)分别取0.5ml的PhaP蛋白水溶液与0.5ml大豆食用油混合于同样规格的玻璃小瓶中，分别用涡旋振荡器最大限度(约1300rpm)振荡120秒和用超声仪短时超声处理30秒(输出功率为80W)。

[0188] 3)将制备好的样品放置在避光恒温下静置，静置第2天时吸取乳化层中的乳化液，涂抹在玻璃片表面。光学显微镜下观察。

[0189] 结果：

[0190] 微乳颗粒微观结构的观察见图4，直径大小见表8。从结果中可见，高浓度的PhaP促进体积更小、比表面积更大的油珠的产生；剧烈的混合(超声仪振荡)乳化过程能促进产生更多的更小、比表面积更大的油珠。

[0191] 表8 不同浓度的PhaP乳化得到的微乳颗粒大小

[0192]

[0193] 实施例9、利用两亲性蛋白作为表面活性剂制备高分子材料颗粒

[0194] 具体操作如下：

[0195] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的1000μg/ml的蛋白水溶液，作为水相。

[0196] 2)将聚乳酸(poly(L-lactide)，简称PLA)材料(重均分子量为100,000，购自美国NatureWorks公司)溶解于氯仿(50mg/ml)中，作为混合油相。

[0197] 3)将水相与混合油相以体积比为20∶1的比例混合后，在冰浴条件下超声振荡(输出功率为200W)5分钟。

[0198] 4)将样品放置在通风橱中搅拌除去氯仿。

[0199] 5)电子扫描电镜观察样品。

[0200] 结果：

[0201] 电镜观察结果见图5。从图中可见，PhaP能有效地附着在有PLA/有机溶剂氯仿混合油珠的表面，并维持油珠稳定。除去氯仿后，PLA材料结晶后行成规则的颗粒。 [0202] 实施例10、两亲性蛋白在乳化液态疏水性油相的高温处理

[0203] 具体操作如下：

[0204] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的500μg/ml的蛋白水溶液。 [0205] 2)将0.5ml PhaP蛋白水溶液放置在95℃高温下处理一个小时，然后将PhaP水溶液冷却至室温，在室温下分别将其与0.5ml的柴油、润滑油和食用大豆油混合乳化处理。另在室温下分别将0.5ml的PhaP溶液先与0.5ml的柴油、润滑油和食用大豆油混合乳化处理后，再放置在95℃高温下处理一个小时。

[0206] 3)通过对柴油、润滑油和食用大豆油的乳化能力来检测PhaP的耐热性。将制备好的样品放置在避光恒温下静置，静置第2天观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0207] 结果：

[0208] 经高温处理的PhaP蛋白水溶液乳化油相的乳化值见表9。

[0209] 结果表明，所有样品均有明显的乳化层，且不同操作过程乳化油相的乳化值相近，说明PhaP的乳化能力和乳化层稳定不受加热处理的影响。

[0210] 表9 经高温处理的PhaP蛋白水溶液乳化油相的乳化值

[0211]

[0212] 实施例11、两亲性蛋白降低水的表面张力

[0213] 两亲性蛋白选用PhaP，用超纯水、高纯的十二烷基磺酸钠和牛血清蛋白作为对照。 [0214] 具体操作如下：

[0215] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成需要的500μg/ml和1000μg/ml，同样将十二烷基磺酸钠和牛血清蛋白配制成500μg/ml的浓度。

[0216] 2)分别用干净干燥的微量注射器将1ul的超纯水、PhaP、十二烷基磺酸钠和牛血清蛋白溶液滴在疏水材料聚羟基丁酸酯(简称PHB)和透明胶带(成分为双向拉伸聚丙烯，Biaxially Oriented Polypropylene，简称BOPP)的膜表面。

[0217] 3)测的各种溶液液滴的接触角。

[0218] 结果：

[0219] 各种溶液液滴的接触角见表10。

[0220] 表10 各种溶液液滴的接触角

[0221]

[0222] 从表10可见，相同浓度的PahP和十二烷基磺酸钠溶液，都能降低水的表面自由能，PhaP更明显。同为蛋白质的牛血清蛋白表现出的效果不明显。同时，PhaP的浓度直接影响水的表面自由能：浓度越高，水的表面自由能降低越明显。

[0223] 实施例12、两亲性的蛋白质与传统化工类表面活性剂混合液乳化润滑油和柴油的能力

[0224] 两亲性的蛋白质和传统化工类表面活性剂的混合液与相同的浓度的传统化工类表面活性剂用于乳化润滑油和柴油的能力的比较。两亲性蛋白选择PhaP；传统化工类表面活性剂为高纯的吐温20；油相分别为润滑油(美国，美孚)和柴油(中国，中石化)。 [0225] 具体操作如下：

[0226] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成浓度为500μg/ml的PhaP蛋白水溶液，将吐温20用超纯水配制成浓度为500μg/ml的吐温20水溶液，将上述两种溶液按体积比1∶1混合，配制成两亲性的蛋白质和吐温20均为250μg/ml的浓度的混合表面活性剂水溶液。

[0227] 2)取0.5ml混合表面活性剂水溶液与0.5ml润滑油(或柴油)混合于玻璃小瓶中，同时，取0.5mlPhaP蛋白水溶液与0.5ml润滑油(或柴油)混合于同样规格的玻璃小瓶中，取0.5ml吐温20水溶液与0.5ml润滑油(或柴油)混合于同样规格的玻璃小瓶中，利用涡旋振荡器最大限度(约1300rpm)振荡120秒。

[0228] 3)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过上述公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0229] 4)混合后静置第2天的乳化值变化作为乳化稳定性的研究依据。

[0230] 结果：

[0231] PhaP蛋白为表面活性剂的样品和混合表面活性剂的样品乳化润滑油和柴油均有明显的乳化层；而以吐温20为表面活性剂的样品没有明显的乳化层。

[0232] PhaP与吐温20的混合液乳化润滑油和柴油的乳化值见表11。

[0233] 表11 PhaP与吐温20的混合液乳化润滑油和柴油的乳化值

[0234]

[0235] 表11的结果表明，混合表面活性剂乳化柴油和润滑油的乳化值相近，且都大于以吐温20为表面活性剂乳化柴油和润滑油的乳化值。表明PhaP混合了其他的表面活性剂后依然有乳化柴油和润滑油的能力，同时表明含有PhaP的混合表面活性剂比传统的化工类表面活性剂的乳化能力强。

[0236] 实施例13、两亲性的蛋白质与普通蛋白质混合液乳化润滑油和柴油的能力 [0237] 两亲性的蛋白质与普通蛋白质混合液与相同浓度的传统化工类表面活性剂用于乳化润滑油和柴油的能力的比较。两亲性蛋白选择PhaP；普通蛋白质为牛血清蛋白；传统化工类表面活性剂分别为高纯的吐温20；油相分别为润滑油(美国，美孚)和柴油(中国，中石化)。

[0238] 具体操作如下：

[0239] 1)将纯的两亲性的蛋白质PhaP用超纯水配制成浓度为500μg/ml的PhaP蛋白水溶液，将吐温20用超纯水配制成浓度为500μg/ml的吐温20水溶液，将牛血清蛋白用超纯水配制成浓度为500μg/ml的牛血清蛋白水溶液，将上述PhaP蛋白水溶液和牛血清蛋白水溶液按体积比1∶1混合，配制成两亲性的蛋白质和牛血清蛋白均为250μg/ml的浓度的混合蛋白质水溶液。

[0240] 2)取0.5ml混合蛋白质水溶液与0.5ml润滑油(或柴油)混合于玻璃小瓶中，同时，取0.5ml PhaP蛋白水溶液与0.5ml润滑油(或柴油)混合于同样规格的玻璃小瓶中，取0.5ml吐温20水溶液与0.5ml润滑油(或柴油)混合于同样规格的玻璃小瓶中，取0.5ml牛血清蛋白水溶液与0.5ml润滑油(或柴油)混合于同样规格的玻璃小瓶中，利用涡旋振荡器最大限度(约1300rpm)振荡120秒。

[0241] 3)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，观察并记录油层、乳化层和水 层的高度。并通过上述公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0242] 4)混合后静置第2天的乳化值变化作为乳化稳定性的研究依据。

[0243] 结果：

[0244] PhaP为表面活性剂的样品和混合混合蛋白的样品乳化润滑油和柴油有明显的乳化层；以吐温20为表面活性剂的样品乳化润滑油和柴油没有明显的乳化层。 [0245] 以纯的牛血清蛋白为表面活性剂的样品未能乳化柴油和润滑油，没有明显的乳化层，表明在混合蛋白中乳化作用的是PhaP，也表明只有具有双亲性的蛋白质(或多肽)才能作为表面活性剂，用于乳化柴油和润滑油。

[0246] 以上不同表面活性剂乳化润滑油和柴油乳化值见表12。

[0247] 表12 PhaP与牛血清蛋白的混合液乳化润滑油和柴油的乳化值

[0248]

[0249] 表12的乳化值结果表明，混合蛋白乳化柴油和润滑油的乳化值相近。且大于以吐温20为表面活性剂和以牛血清蛋白为表面活性剂乳化柴油和润滑油的乳化值。表明PhaP混合了其他的蛋白类物质后依然有乳化柴油和润滑油的能力，其他蛋白质对PhaP的乳化能力没有明显的干扰，表明混合了其他蛋白和PhaP的混合蛋白也可作为表面活性剂，并表明含有PhaP的混合蛋白比传统的化工类表面活性剂的乳化能力强。

[0250] 实施例14、含有两亲性的蛋白质的细胞提取液乳化润滑油和柴油的能力 [0251] 含有两亲性的蛋白质的细胞提取液与不含有此两亲性的蛋白质的细胞提取液和相同浓度的纯的两亲性蛋白质、传统化工类表面活性剂用于乳化润滑油和柴油的能力的比较。两亲性蛋白选择PhaP；细胞提取液为E.coli BL21(DE3)的细胞裂解液，含有核酸、脂类、膜蛋白等各种细胞组织和成分；传统化工类表面活性剂为高纯的吐温20；油相分别为润滑油(美国，美孚)和柴油(中国，中石化)。

[0252] 具体操作如下：

[0253] 1)用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(中国，天根公司)原核表达系统生产重组蛋 白。取一个单菌落或2ml新鲜的培养菌，加入200ml LB液体培养基中(含氨苄100μg/ml)，37℃振荡培养至OD600为0.5-0.8，加入终浓度为1.5mM-0.5mM的IPTG，同时空白对照不加IPTG，16℃过夜诱导表达融合蛋白。

[0254] 2)通过超声波的方法裂解菌体，得到细胞裂解液。将IPTG诱导表达过夜的菌液进行8000转每秒离心2-3分钟，弃上清，将菌体重悬于超纯水中，冰浴，超声破碎细胞。11000转每秒离心30分钟，上清即为澄清的细胞提取液。同时对不加IPTG诱导表达的菌液进行相同处理得到不含有PhaP的细胞提取液。

[0255] 3)利用G-250考马斯亮蓝(中国，天根)定量两种细胞提取液的总蛋白含量，配制成总蛋白浓度为500μg/ml，的细胞提取液，含有PhaP的为细胞提取液A，不含有PhaP的为细胞提取液B。

[0256] 4)利用SDS-PAGE确定细胞提取液A中PhaP占总蛋白的含量。

[0257] 5)分别取3ml的细胞提取液A(或细胞提取液B或纯的PhaP或吐温20)与3ml润滑油(或柴油)混合于玻璃小瓶中，利用涡旋振荡器最大限度(约1300rpm)振荡120秒。其中纯的PhaP的浓度与细胞提取液A中PhaP的浓度相同。细胞提取液A的PhaP含量占细胞提取液总蛋白的35～40％，即细胞提取液A中PhaP的浓度为175～200μg/ml。纯PhaP样品中PhaP浓度为200μg/ml。

[0258] 6)将制备好的样品放置在避光25℃恒温下静置，观察并记录油层、乳化层和水层的高度。并通过公式(1)计算得到相关的乳化值。

[0259] 7)混合后静置第2天的乳化值变化作为乳化稳定性的研究依据。

[0260] 结果：

[0261] 含有PhaP的细胞提取液乳化润滑油和柴油的乳化值见表13。

[0262] PhaP样品、细胞提取液A和细胞提取液B的样品乳化柴油和润滑油均有明显的乳化层；而吐温20为表面活性剂的样品乳化柴油和润滑油均没有明显的乳化层。表明细胞提取液有乳化柴油和润滑油的能力。这是因为细胞提取液中自身含有大量的脂类物质和两亲性小分子，如膜蛋白、脂蛋白、磷脂、胆固醇等。上述物质均有微弱的两亲性，具有较弱的乳化柴油和润滑油的能力。细胞提取液A的乳化层明显多于细胞提取液B的乳化层，细胞提取液A样品的乳化值明显大于细胞提取液B的乳化值。表明相比细胞提取液中上述的小分子物质，PhaP的两亲性更强，能更有效的乳化柴油和润滑油。细胞提取液A样品的乳化值与PhaP样品的乳化值基本相同。表明PhaP混合了其他的非蛋白类物质(如核酸、磷脂等)后依然有乳化柴油和润滑油的能力，这些非蛋白类物质对PhaP的乳化能力没有明显的干扰。也表明不需要高纯的PhaP前提下，可以使用上述方法得到的含有PhaP细胞提取液乳化油相。可减少纯化成本和时间。

[0263] 表13 含有PhaP的细胞提取液乳化润滑油和柴油的乳化值

[0264]