一种将萝卜染色体导入甘蓝的方法

摘要

本发明公开了一种将萝卜d染色体导入甘蓝的方法，其是通过甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝进行有性杂交，将萝卜d染色体导入到甘蓝，同时利用分子标记检测及细胞镜检方法，选择含萝卜d染色体的甘蓝植株，创建携带萝卜d染色体的甘蓝新种质。本发明以甘蓝型油菜作为萝卜d染色体的载体，通过它与甘蓝的杂交将萝卜d染色体传递给甘蓝，避免了甘蓝与萝卜之间的直接杂交，这种芸薹属内的杂交比芸薹属与萝卜属之间的属间杂交更容易成功。并且只有1对萝卜染色体与甘蓝基因组整合，可以避免用整个萝卜基因组杂交引起的更多遗传累赘，因此还可以提高目标性状的转移和选择效率。这种方法为远缘杂交利用提供了一条新的思路。

权利要求

1.一种将萝卜d染色体导入甘蓝的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：(1)利用甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系为母本，甘蓝为父本进行人工蕾期杂交授粉，结合子房培养，得到转育一代；

(2)利用RAPD分子标记检测和细胞镜检鉴定转育一代，选择含有萝卜d染色体且根尖细胞染色体数目为29的单株，与甘蓝进行回交转育，结合子房培养，得到转育二代；

(3)利用RAPD分子标记检测转育二代，选择含有萝卜d染色体的植株，再利用细胞镜检，选择含有萝卜d染色体且根尖细胞染色体数目为19～29，形态学鉴定为甘蓝的单株，继续与甘蓝进行回交转育，结合子房培养，得到转育三代；

(4)利用RAPD分子标记检测转育三代，选择含有萝卜d染色体的植株，再利用细胞镜检，选择含有萝卜d染色体且根尖细胞染色体数目为19或20，形态学鉴定为甘蓝的单株，即为携带有萝卜d染色体的甘蓝；

所述甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系保藏编号为：CGMCC No.3569；

所述步骤(1)子房培养的培养基配方为：

1/2MS、10g/L肌醇、100mg/L烟酸、100mg/L VB6、1g/L VB1、1.5mg/L IAA、50g/L蔗糖，pH＝5.8；

所述RAPD分子标记检测为：利用萝卜d染色体的RAPD标记OPF07-363bp、OPG19-488bp中的一个检测，有上述标记中任意一个的植株为含有萝卜d染色体植株；

所述RAPD分子标记OPF07、OPG19的引物序列如下所示：OPF07：5′-CCGATATCCC-3′；OPG19：5′-GTCAGGGCAA-3′。

2.根据权利要求1所述的将萝卜d染色体导入甘蓝的方法，其特征在于，所述细胞镜检是利用显微镜镜检待检植株根尖细胞染色体数目。

说明书

一种将萝卜染色体导入甘蓝的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种甘蓝的培育方法，具体地说是将萝卜d染色体导入甘蓝的方法，属于甘蓝远缘杂交利用领域。

背景技术

[0002] 远源杂交是指亲缘关系疏远的类型之间的杂交，包括种间、属间和科间的杂交。它可以创造现有植物所没有的特异类型或新种质，因此远缘杂交已成为解决植物基因资源匮乏的重要手段，在植物遗传育种中有广泛的应用，如在小麦(Bris B.等，1983；Kozub NA等，2004)、棉花(Vmh B I等，1999)、油菜(刘忠松等，2001；陈树忠等，2000)、黄瓜(Chen J F等，1997)等多种作物上通过种间或属间杂交进行品种改良，获得了丰富的遗传变异类型。

[0003] 众所周知，萝卜属(Raphanus)植物中存在着丰富的抗源和许多对芸薹属(Brassica)栽培作物有益的性状，如细胞质雄性不育基因和恢复基因、对软腐病、黑腐病、和根肿病等多种病害的抗性基因，萝卜属植物还具有抗线虫病、抗旱、抗寒、耐酸碱等优异特性(Delourme等，1998；Dolstra，1982；Baukloh，1976)。因此，萝卜属是芸薹属及其它十字花科近缘属植物进行遗传改良和创造新的变异的重要供体资源。国际上对芸薹属与萝卜属的远缘杂交研究始于上世纪二十年代，至今已开展了八十多年，其中甘蓝(Brassica oleracea)和白菜(Brassica campestris)与萝卜的远缘杂交研究不少，但多数研究表明萝卜与芸薹杂交获得杂种非常困难，虽然有的获得了萝卜芸薹、萝卜甘蓝或萝卜黑芥等杂种，但杂种高度不育，难以继续回交。为了克服芸薹属植物与萝卜杂交不亲和性，许多学者尝试用不同的技术和方法，如：植株嫁接后杂交、混合花粉授粉、化学药物处理等，但这些技术和方法对芸薹属植物与萝卜的远缘杂交几乎没有效果(李旭峰等，1995)。后来组织培养技术和原生质体融合技术推动了这一领域的发展，最成功的是通过原生质体融合技术成功地将萝卜的细胞质雄性不育基因转入芸薹属蔬菜，获得甘蓝和白菜的细胞质雄性不育材料。与有性杂交相比，原生质体融合技术虽然可以在一定程度上克服远缘杂交不亲和性，获得杂种，但在原生质体培养的技术成熟度、在体细胞杂种的遗传稳定性、育性(特别是远缘体细胞杂交中)以及非对称杂交中染色体消失的随机性导致无法有针对地转移特定的性状等方面都存在着亟待研究和解决的问题(宋尚伟等，2007)。

[0004] 基于上述情况，本领域技术人员仍在积极寻求一种能有效地克服甘蓝与萝卜间的远缘杂交障碍，将萝卜染色体或基因导入到甘蓝的途径。本发明拟采用一种新的思路和方法，避开甘蓝与萝卜之间的直接杂交，而利用从国外引进的附加萝卜d染色体的甘蓝型油菜与甘蓝进行有性杂交，从而将萝卜d染色体从甘蓝型油菜转移至甘蓝，使甘蓝获得萝卜d染色体所携带的优良性状(如抗线虫病等)，为甘蓝遗传育种创造更多的遗传变异。 发明内容

[0005] 本发明的目的在于，提供一种可以克服萝卜与甘蓝之间的远缘杂交障碍，通过有性杂交将萝卜d染色体导入甘蓝的方法。

[0006] 本发明的发明思路为：为了克服甘蓝与萝卜之间的远缘杂交障碍，发明人利用甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系(CGMCC No.3596)作为甘蓝与萝卜之间的桥梁，通过该附加系与甘蓝的有性杂交，将萝卜d染色体导入到甘蓝，同时利用细胞学和分子标记技术，选择含萝卜d染色体的甘蓝植株，创建携带萝卜d染色体的甘蓝新种质。这种方法以甘蓝型油菜作为萝卜d染色体的载体，通过它与甘蓝的杂交将萝卜d染色体传递给甘蓝，避免了甘蓝与萝卜之间的直接杂交，这种芸薹属内的杂交比芸薹属与萝卜属之间的属间杂交更容易成功。在后代材料的鉴定上，利用细胞学和分子标记技术，可以快速、高效地选择目标材料。 [0007] 为了达成上述目的，本发明采用如下具体技术方案：

[0008] 所述的获得携带有萝卜d染色体的甘蓝的方法包括下述步骤：

[0009] (1)利用甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系为母本，甘蓝为父本进行人工蕾期杂交授粉，结合子房培养，得到转育一代；

[0010] (2)利用RAPD分子标记检测和细胞镜检鉴定转育一代，选择含有萝卜d染色体且根尖细胞染色体数目为29的单株，与甘蓝进行回交转育，结合子房培养，得到转育二代； [0011] (3)利用RAPD分子标记检测，选择含有萝卜d染色体的植株，再利用细胞镜检，选择含有萝卜d染色体且根尖细胞染色体数目接近20，推荐选择19～29范围内的，植株形态接近甘蓝的单株，继续与甘蓝进行回交转育，结合子房培养，得到转育三代； [0012] (4)利用RAPD分子标记检测，选择含有萝卜d染色体的植株，再利用细胞镜检，选择含有萝卜d染色体且根尖细胞染色体数目为19或20， 植株形态似甘蓝的单株，即为携带有萝卜d染色体的甘蓝。

[0013] 甘蓝植株形态及生物学特性均为本领域技术人员公知内容，在此不赘述，本发明最终产品经分子鉴定含有萝卜d染色体及具备甘蓝形态和生物学特性。

[0014] 所述甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系于2010年1月27日，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.3596，分类命名：油菜brassica napus。

[0015] 上述RAPD分子标记检测为：利用萝卜d染色体的RAPD标记OPF07-363bp、OPG19-488bp中的一个检测，有上述标记中任意一个的植株为含有萝卜d染色体植株。OPF07和OPG19的引物序列如下所示。

[0016] OPF07-363bp：5’-CCGATATCCC-3’；OPG19-488bp：5’-GTCAGGGCAA-3’。 [0017] 所述细胞镜检是利用显微镜镜检待检植株根尖细胞染色体数目。 [0018] 本发明所涉及的甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系CGMCC No.3596直接来源为：德国联邦栽培作物育种研究中心；原始来源：由德国联邦栽培作物育种研究中心自行培育。父本甘蓝的直接来源和原始来源均为：北京市农林科学院自行培育。 [0019] 本发明的优点及有益效果：

[0020] 与传统的甘蓝和萝卜直接远缘杂交方法相比，采用附加萝卜d染色体的甘蓝型油菜与甘蓝进行杂交，以甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系(基因组AACC+RR)作为甘蓝(基因组CC)与萝卜(基因组RR)的中间桥梁，并且只有1对萝卜染色体与甘蓝基因组整合，可以避免用整个萝卜基因组杂交引起的更多遗传累赘，因此这种方法不但可以克服甘蓝与萝卜之间的远缘杂交障碍，还可以提高目标性状的转移和选择效率。这种方法为甘蓝与萝卜的远缘杂交提供了一条新的思路与方法。

附图说明

[0021] 图1为本发明技术流程图；

[0022] 图2为RAPD分子标记OPF07-363bp检测结果，泳道从左到右分别是Marker，2个附加系亲本，2个甘蓝亲本，3个转育一代，Marker，1个转育一代，1个转育二代，其余为转育三代；

[0023] 图3为RAPD分子标记OPG19-488bp检测结果，泳道从左到右分别是Marker，附加系亲本，3个甘蓝亲本，3个转育一代，1个转育二代，1个转育三代，Marker，其余为转育三代。

具体实施方式

[0024] 如图1所示，具体步骤如下：

[0025] 1、杂交授粉与子房培养：以甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系为母本，甘蓝(市售可以购买得到，品种或纯合的自交系都可以应用于本发明，无具体限定)为父本进行杂交授粉。开花前2～3天，父母本花枝分别套袋隔离。母本蕾期去雄，取父本的花粉涂抹于母本的柱头上。取授粉后7～15天的子房进行组织培养。培养基为：1/2MS+肌醇(10g/L)+烟酸(100mg/L)+VB6(100mg/L)+VB1(1g/L)+IAA(1.5mg/L)+蔗糖(50g/L)，pH＝5.8。培养一个月左右，子房内的种子基本成熟，得到转育一代。

[0026] 2、转育一代鉴定：

[0027] (1)利用萝卜d染色体的RAPD标记OPF07-363bp和OPG19-488bp中的一个检测转育一代是否含有萝卜d染色体，有上述标记的植株为含有萝卜d染色体。如图2和图3所示。

[0028] 图2为RAPD分子标记OPF07-363bp检测结果，泳道从左到右分别是Marker，2个附加系亲本，2个甘蓝亲本，3个转育一代，Marker，1个转育一代，1个转育二代，其余为转育三代；

[0029] 图3为RAPD分子标记OPG19-488bp检测结果，泳道从左到右分别是Marker，附加系亲本，3个甘蓝亲本，3个转育一代，1个转育二代，1个转育三代，Marker，其余为转育三代。

[0030] 其中引物OPF07、OPG19的碱基序列分别如下所示，具体为5’-CCGATATCCC-3’，5’-GTCAGGGCAA-3’。转育一代含有萝卜d染色体。

[0031] RAPD分子标记鉴定采用SDS法提取亲本和杂种幼苗叶片DNA，用RAPD引物进行PCR扩增，反应体系为：16ng DNA，0.25mmol/L dNTP，1×Buffer，0.1U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L MgCL2，0.4mmol/L引物，终体积8μL。反应循环为：94℃(2min)，94℃(30s)-36℃(30s)-72℃(1min)45个循环，之后72℃10min，4℃保存。PCR产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测。

[0032] (2)用显微镜镜检转育一代植株的根尖细胞染色体数目，转育一代的染色体数目为29。

[0033] 染色体镜检方法：先固定根尖，取2～3mm左右根尖于饱和对二氯苯溶液中避光处理4h，后转入现配的卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸以3∶1混合)中固定3～24h。取固定后的根尖进行解离，先用蒸馏水漂洗根尖2～3次，然后将根尖放入已预热的1mol/L盐酸中60℃水浴6～8分钟，再转入蒸馏水中浸泡10分钟以上。 切取根尖用卡宝品红染液染色4～6分钟，常规压片后在OLYMPUS BH-2显微镜下镜检染色体。

[0034] 3、回交授粉与子房培养：以鉴定筛选出的转育一代为母本，甘蓝为父本进行回交授粉。授粉方法与子房培养方法同步骤1，得到的种子为转育二代。

[0035] 4、转育二代鉴定：同步骤2方法(1)，用分子标记检测转育二代中是否含有萝卜d染色体。选择带萝卜d染色体的转育二代植株，用显微镜镜检根尖细胞染色体，从中选择染色体数目接近20、植株形态接近甘蓝的植株。

[0036] 5、转育二代回交与子房培养：以鉴定筛选得到的转育二代为母本，甘蓝为父本继续回交授粉。授粉与子房培养方法同步骤1，得到转育三代。

[0037] 6、转育三代鉴定：同第二步(1)方法，检测转育三代中是否含有萝卜d染色体。选择带萝卜d染色体的转育三代植株，用显微镜镜检根尖细胞染色体，从中选择染色体数目为19或20、植株形态似甘蓝的植株，即为本发明所述携带有萝卜d染色体的甘蓝。 [0038] 经本方法获得的甘蓝经RAPD分子标记鉴定含有萝卜d染色体，并且具有甘蓝的形态学和生物学特性。本发明通过简单的方法克服了甘蓝与萝卜之间的远缘杂交障碍，提高目标性状的转移和选择效率。本发明为甘蓝与萝卜的远缘杂交提供了一条新的思路与方法，具有很好的市场前景。