狼尾蕨叶片诱导不定芽高频率植株再生方法

摘要

狼尾蕨叶片诱导不定芽高频率植株再生方法，属于植物培养方法技术领域。现有的蕨类植物不定芽诱导植株再生技术尚停留在实验室研究阶段，且限于鹿角蕨科和肾蕨科。本发明以骨碎补科狼尾蕨无菌苗的叶片为外植体材料，在附加苯基脲类细胞分裂素CPPU2.0mg/L和吲哚丁酸IBA0.1mg/L的培养基上诱导不定芽发生，不定芽诱导频率达95%。在添加CPPU0.5mg/L和IBA0.1mg/L的培养基上进行不定芽增殖，不定芽每代增殖系数为5。不定芽在附加IBA0.2mg/L的培养基上成苗率达100%，并发育成具有根、茎、叶的完整小植株。本方法适用于狼尾蕨试管苗繁殖，为开展体细胞突变体筛选和基因转化研究工作提供条件。

权利要求

1.狼尾蕨叶片诱导不定芽高频率植株再生方法，其特征在于：

1)材料

选用狼尾蕨无菌苗的叶片为材料；

2)培养基

基本培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，添加蔗糖30g/L，8g/L的琼脂条作为固化剂；

不定芽诱导培养基：附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 2.0mg/L和IBA 0.1mg/L；

不定芽增殖培养基：附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 0.5mg/L和IBA 0.1mg/L；

成苗和生根培养基：附加生长素IBA0.2mg/L，活性炭质量比0.1％；

上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

3)方法

在超净工作台上剪取狼尾蕨无菌苗的叶片，接种在步骤2)所述不定芽诱导培养基上，

20d从叶片诱导产生出不定芽；不定芽转到步骤2)所述不定芽增殖培养基上进行继代增殖培养，30d为一个周期；不定芽转移到步骤2)所述成苗和生根培养基上，发育成具有根、茎、叶的完整小植株；

不定芽的诱导和增殖、成苗和生根培养均在光照条件下进行，光照强度为1500lx，光照时间为16h/d；培养室温度为26℃±2℃。

说明书

狼尾蕨叶片诱导不定芽高频率植株再生方法

技术领域

[0001] 本发明狼尾蕨叶片诱导不定芽高频率植株再生方法，涉及一种适用于蕨类植物体细胞离体培养植株再生与试管苗微繁殖技术，属于植物培养方法技术领域。

背景技术

[0002] 截止目前，在12000种蕨类植物中，成功进行组织培养的仅占极少一部分，部分属种虽已组培成功，但存在周期长，增殖率不高的问题(韩敬，赵莉.蕨类植物繁殖研究进展[J].安徽农业科学，2005，33(7)：1261～1263)。与孢子作外植体相比，利用孢子体上的根状茎茎尖、嫩叶等作外植体进行组培有成苗速度快等优点。因而，以孢子体为外植体的蕨类植物组培研究是蕨类组培研究的重点之一(蒋盛军，宋希强，王胜培，等.蕨类植物组织培养研究进展[J].园艺学报，2002，29(增刊)：651～656)。

[0003] 狼尾蕨(Davallia bullata)属于蕨类植物水龙骨目(Polypodiales)骨碎补科(Davalliaceae)。李文安等以狼尾蕨带有孢子的叶片为外植体材料，从孢子萌发、诱导产生叶原体到长成具有根、茎、叶的小植株长达一年以上(李文安，王玉琴.狼尾蕨的离体培养[J].植物生理学通讯，1990(3)：44)。李华赐等以鹿角蕨的叶片为外植体，0.1～1.0mg/L BAP有利于不定芽的诱导和增殖(李华赐，陈志红.鹿角蕨的组织培养[J].植物生理学通讯，1988(2)：58)。在肾蕨属植物根状茎尖培养中，Loescher认为诱导不定芽发生无需外源激素，但KT可以促进不定芽的形成和增殖，而BAP则起抑制作用(Loescher W H and Albrecht C N.Development in vitro of Nephrolepis exaltala cv.Bostoniensis runner tissues[J].Physiol Plant，1979，47：250～254)。Camloh指出BAP可以促进二叉鹿角蕨茎端叶片形成不定芽(Camloh M，Gogala N and Rode J.Plant regeneration from leaf explants of the fern Platycerium bifureatum in vitro[J].Scientia Horticulture，1994，56：257～266)。

发明内容

[0004] 技术问题 本发明要解决的技术问题和提出的技术任务是：以狼尾蕨的叶片为外植体材料，通过选用苯基脲类细胞分裂素CPPU诱导和增殖不定芽，提高不定芽的成苗率，建立高频率植株再生技术体系。

[0005] 技术方案

[0006] 狼尾蕨叶片诱导不定芽高频率植株再生方法，包括：

[0007] 1)材料

[0008] 选用狼尾蕨无菌苗的叶片为材料；

[0009] 2)培养基

[0010] 基本培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，添加蔗糖30g/L，8g/L的琼脂条作为固化剂；

[0011] 不定芽诱导培养基：附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 2.0mg/L和IBA 0.1mg/L；

[0012] 不定芽增殖培养基：附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 0.5mg/L和IBA 0.1mg/L；

[0013] 成苗和生根培养基：附加生长素IBA 0.2mg/L，活性炭0.1％；

[0014] 上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；

[0015] 3)方法

[0016] 在超净工作台上剪取狼尾蕨无菌苗的叶片，接种在步骤2)所述不定芽诱导培养基上，20d左右从叶片诱导产生出不定芽；不定芽转到步骤2)所述不定芽增殖培养基上进行继代增殖培养，30d为一个周期；不定芽转移到步骤2)所述成苗和生根培养基上，发育成具有根、茎、叶的完整小植株；

[0017] 不定芽的诱导和增殖、成苗和生根培养均在光照条件下进行，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为26℃±2℃。

[0018] 有益效果 本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

[0019] 本发明选用苯基脲类细胞分裂素CPPU从狼尾蕨叶片诱导产生正常状态的叶芽状不定芽比例达95％左右，叶芽的成苗率达100％；BAP诱导和增殖非正常状态的叶状体不定芽，成苗率仅为6％；KT诱导产生较高比例正常状态的叶芽状不定芽，但增殖的不定芽呈现玻璃化和软腐现象，成苗率为40％。

[0020] 国内外学者在肾蕨科和鹿角蕨科蕨类植物上选用BAP和KT从叶片诱导和增殖不定芽，植株再生技术尚停留在研究阶段。本发明首次建立起骨碎补科的狼尾蕨叶片诱导不定芽高频率植株再生技术，达到实用化程度，为开展蕨类植物微繁殖、体细胞突变体筛选和转基因工作可提供借鉴。

附图说明

[0021] 图1 CPPU诱导的不定芽。

[0022] 图2 BAP诱导和增殖的不定芽。

[0023] 图3 CPPU诱导和增殖的不定芽。

[0024] 图4 完整小植株。

具体实施方式

[0025] 1.材料和方法

[0026] 1.1试验材料

[0027] 以蕨类植物水龙骨目(Polypodiales)骨碎补科(Davalliaceae)的狼尾蕨(Davallia bullata)无菌苗(狼尾蕨种苗购自南京万博花卉市场)的叶片为外植体。

[0028] 1.2培养基

[0029] 基本培养基由MS大量元素、MS微量元素(Murashige T，Skoog F.A revised medium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J].Physiol plant，1962，15：473～497)和B5维生素(Gamborg O L，Miller R A，Ojima K.Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells[J].Exp.Cell Res.，1968.50：151～158)组成，为植物组织培养中一种常用的培养基，蔗糖30g/L，琼脂条(乘风牌，福建泉州市泉港化工厂)8g/L；

[0030] 不定芽诱导培养基：分别附加2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(简称BAP，上海雪满生物科技有限公司)，激动素(简称KT，南京生兴生物技术有限公司)和苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)；

[0031] 不定芽增殖培养基：分别附加0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤(简称BAP，上海雪满生物科技有限公司)，激动素(简称KT，南京生兴生物技术有限公司)和苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)；

[0032] 成苗和生根培养基：附加0.2mg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)，0.1％活性炭(南京助研生物技术有限公司)；

[0033] 培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8。

[0034] 1.3方法

[0035] 以狼尾蕨无菌苗的叶片为材料，在不定芽诱导培养基上20d左右诱导产生不定芽；带有不定芽的叶片转移到不定芽增殖培养基上，30d为一个周期，不定芽继代增殖；不定芽转移到成苗和生根培养基上，25d左右形成具有根、茎、叶的完整再生植株；离体培养条件：培养室温度为26±2℃，光照强度为1500 lx，光照时间为16h/d。

[0036] 2.结果

[0037] 2.1细胞分裂素对叶片诱导不定芽的影响

[0038] 狼尾蕨无菌苗的叶片接种在附加KT 2.0mg/L、IBA 0.1mg/L和CPPU 2.0mg/L、IBA0.1mg/L的诱导培养基上，20d左右诱导产生不定芽，30d左右形成密集的叶状体芽并伴随肉眼可见的叶芽状不定芽(图1)；而在添加BAP 2.0mg/L、IBA 0.1mg/L的培养基上，仅诱导产生密集的叶状体芽，未见叶芽状不定芽。

[0039] 表1细胞分裂素对叶片诱导不定芽的影响

[0040]

[0041] 表1结果显示：在附加2.0mg/L KT、CPPU或BAP的不定芽诱导培养基上，不定芽的诱导频率均在90％以上，但诱导产生的不定芽的状态有明显差异，KT和CPPU有利于诱导产生正常状态的叶芽状不定芽。

[0042] 2.2细胞分裂素对不定芽增殖的影响

[0043] 在附加CPPU 0.5mg/L、IBA 0.1mg/L的不定芽增殖培养基上，前期来自添加KT或CPPU培养基上的叶状体芽均转而形成正常状态的叶芽状不定芽(图2)，而前期来自BAP培养基上的叶状体芽基本保持非正常状态的叶状体不定芽，仅个别的叶状体芽形成叶芽状不定芽。

[0044] 前期来自添加KT培养基上的不定芽转到附加KT 0.5mg/L、IBA 0.1mg/L的不定芽增殖培养基上，多数芽转而形成正常状态的叶芽状不定芽，但仍有部分芽保持叶状体状。前期来自BAP培养基上的不定芽转到附加BAP 0.5mg/L、IBA0.1mg/L的不定芽增殖培养基上，芽均保持密集的叶状体状(图3)。

[0045] 0.5mg/L KT、CPPU或BAP对不定芽的增殖效率基本相当，每代增殖系数约为5。

[0046] 表2细胞分裂素对不定芽成苗的影响

[0047]

[0048] 试验中观察到前期来自添加KT培养基上的不定芽转到附加CPPU 0.5mg/L、IBA0.1mg/L的培养基上增殖培养，50％以上的不定芽呈现玻璃化和软腐现象，从而导致成苗率仅为40％；而前期来自附加CPPU培养基上的不定芽转到附加CPPU 0.5mg/L、IBA 0.1mg/L的培养基上增殖培养，不定芽生长健壮，在附加IBA0.2mg/L的培养基上成苗率高达100％(表2)，诱导生成浅黑色根系，生根率达98％，形成具有根、茎、叶的完整小植株(图4)。由此可见，苯基脲类细胞分裂素CPPU适宜狼尾蕨叶片不定芽的诱导、增殖和成苗。

[0049] 3.结论

[0050] CPPU是一种苯基脲类细胞分裂素，可促进多种植物在离体培养中诱导不定芽的发生(罗正荣.新植物生长调节剂CPPU及其在果树和蔬菜上的应用[J].植物生理学通讯，1993，29(1)：297～299)。本试验以蕨类植物骨碎补科狼尾蕨的叶片为外植体，苯基脲类细胞分裂素CPPU诱导和增殖不定芽的效果明显优于KT和BAP，正常状态的叶芽状不定芽的比例达95％以上，不定芽每代增殖系数为5，不定芽的成苗率高达100％，建立起高频率植株再生技术体系。