溶菌酶组合抑菌剂转让专利
申请号 : CN201110033635.8
文献号 : CN102138570B
文献日 : 2014-02-05
发明人 : 史锋 , 尹金凤 , 李永富
申请人 : 江南大学
摘要 :
本发明涉及一种溶菌酶组合抑菌剂，主要解决溶菌酶对革兰氏阴性菌抑制效果差的问题。其由溶菌酶与甘氨酸以及乙二胺四乙酸进行复配组成，各组分按质量份的配比为：溶菌酶0.25～5，甘氨酸1～10，乙二胺四乙酸0.05～0.5；其可以为固态组合物，其在含菌料中的添加量按重量比为1.3～15‰，也可以将其溶解于10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，再加入含菌料中使用。本发明可以使溶菌酶对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抑制效果提高40至600多倍，本发明相对于抗生素和化学防腐剂而言，具有绿色可降解、无残留和安全的特点。
权利要求 :
1.溶菌酶组合抑菌剂，其特征在于由以下方法制备而成：
分别取溶菌酶4mg、甘氨酸16mg、EDTA 0.8mg 混合均匀，将其溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中配成四倍浓度的溶菌酶组合抑菌剂溶液，即得，在所述溶液中，所述溶菌酶、甘氨酸、EDTA的浓度分别为1mg/mL、4 mg/mL和0.2mg/mL；
或者，
分别称取溶菌酶40mg、甘氨酸80 mg、EDTA 4 mg混合均匀，将其溶解于4mL浓度为
10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中配成四倍浓度的溶菌酶组合抑菌剂溶液，即得，在所述溶液中，所述溶菌酶、甘氨酸、EDTA的浓度分别为10 mg/mL、20 mg/mL和1 mg/mL。
说明书 :
溶菌酶组合抑菌剂
技术领域
[0001] 本发明涉及生物抑菌剂，尤其涉及针对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抑菌剂。
背景技术
[0002] 目前，在食品、饲料等领域中使用的抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抗菌试剂主要有抗生素和化学防腐剂两类。抗生素虽然抗菌效果良好，但过度使用会引发病原菌快速变异和耐药性增强，导致严重的健康问题，且抗生素残留后不易被快速降解。化学防腐剂则难以被人体分解，积累到一定量后可能具有潜在的毒副作用，因此存在安全性隐患。于是需要寻找可替代的、安全易降解的抗菌试剂。
[0003] 目前已被发现的可被降解的抗菌试剂主要有溶菌酶、抗菌肽、乳铁蛋白、中草药提取物等。其中溶菌酶是公认安全的抗菌性酶，允许在食品、医药、饲料等体系中添加使用。但是溶菌酶虽然对部分革兰氏阳性菌有良好的杀灭效果，而对大肠杆菌等革兰氏阴性菌通常却抑制效果很低。因为溶菌酶主要通过水解细菌细胞壁的肽聚糖层而发挥抗菌作用，革兰氏阳性菌的肽聚糖层位于细菌细胞壁的最外侧，而革兰氏阴性菌的肽聚糖层则位于细菌细胞壁的内侧，其外部还有细胞外膜。因此提高溶菌酶对革兰氏阴性菌抗菌性能的研究具有积极的应用价值。
发明内容
[0004] 申请人针对溶菌酶对革兰氏阴性菌抑制效果低的问题进行了大量研究工作，在此基础上提供一种溶菌酶组合抑菌剂，其可以有效提高溶菌酶对革兰氏阴性菌的抗菌性能，例如可以有效抑制属于食品病源菌的革兰氏阴性菌—大肠杆菌。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 溶菌酶组合抑菌剂，由溶菌酶与甘氨酸以及乙二胺四乙酸（EDTA）进行复配组成，各组分按质量份的配比为：
[0007] 溶菌酶 0.25～5
[0008] 甘氨酸 1～10
[0009] 乙二胺四乙酸 0.05～0.5
[0010] 其可以为固态组合物，其在含菌料中的添加量按重量比为1.3～15‰。
[0011] 也可以将其溶解于浓度为10mM、pH 7.4的磷酸缓冲液中，配成1.3～15‰的质量体积浓度后（其中各组分的质量体积浓度（g/L）为：溶菌酶 0.25～5；甘氨酸 1～10；乙二胺四乙酸 0.05～0.5），加入含菌料中使用。
[0012] 本发明中：甘氨酸作为氨基酸，不仅与参与肽聚糖组成的关键单元丙氨酸构型相似，还可以在细菌生长时取代丙氨酸，而且它本身还参与形成肽聚糖。另外，甘氨酸还能够在一定程度上改变革兰氏阴性菌细胞外膜脂多糖中的内毒素的构型。这些不仅使得肽聚糖层更加松散，而且细胞形态发生改变，细胞的通透性增加；乙二胺四乙酸（EDTA）是细菌细2+ 2+ 2+ 2+
胞表面二价阳离子如Mg 和Ca 的螯合剂。Mg 和Ca 可以稳定细菌细胞壁中肽聚糖、磷壁
2+
酸及脂多糖所带的负电荷，增强这些分子的交联和折叠，提高细菌细胞表面的致密性。Mg
2+
和Ca 被螯合后，不仅减弱了细菌细胞壁的交联与折叠，而且导致细胞表面一部分脂多糖片段溶出，形成孔洞。上述增效剂甘氨酸和EDTA都是食品添加剂目录中允许使用的物质，上述增效剂都具有针对革兰氏阴性菌细胞外膜的穿透或渗透功能，能够促进溶菌酶穿越大肠杆菌的细胞外膜，到达溶菌酶的水解作用位点肽聚糖层，从而提高溶菌酶对大肠杆菌的抑菌效果。本发明可以使溶菌酶对大肠杆菌的抑制效果提高40多倍至600多倍。
胞表面二价阳离子如Mg 和Ca 的螯合剂。Mg 和Ca 可以稳定细菌细胞壁中肽聚糖、磷壁
2+
酸及脂多糖所带的负电荷，增强这些分子的交联和折叠，提高细菌细胞表面的致密性。Mg
2+
和Ca 被螯合后，不仅减弱了细菌细胞壁的交联与折叠，而且导致细胞表面一部分脂多糖片段溶出，形成孔洞。上述增效剂甘氨酸和EDTA都是食品添加剂目录中允许使用的物质，上述增效剂都具有针对革兰氏阴性菌细胞外膜的穿透或渗透功能，能够促进溶菌酶穿越大肠杆菌的细胞外膜，到达溶菌酶的水解作用位点肽聚糖层，从而提高溶菌酶对大肠杆菌的抑菌效果。本发明可以使溶菌酶对大肠杆菌的抑制效果提高40多倍至600多倍。
[0013] 本发明以溶菌酶为主，将甘氨酸、EDTA与溶菌酶复配，构成溶菌酶组合抑菌剂。复配后的组合抑菌剂随食品摄入人体后，其主体成分溶菌酶作为蛋白质可以被消化道内的蛋白酶水解成小肽和氨基酸，从而被吸收、利用，而甘氨酸本身即为人体可以吸收和转化的营养成分，EDTA虽不能被人体吸收利用，但作为已被批准使用的食品添加剂，可以经消化道排出体外，并具有螯合游离二价金属离子的性能。由上述可见，本发明相对于抗生素和化学防腐剂而言，具有绿色可降解、无残留和安全的特点。
[0014] 本发明抑菌剂的初始状态为固态混合物，可以直接以固态混合物加入含菌料中使用，但通常以1.3～15‰的质量体积浓度溶解于10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中以溶液状态使用。
附图说明
[0015] 图1示出溶菌酶及溶菌酶不同组合的抑菌剂对大肠杆菌ATCC25922的抑制率比较。
[0016] 图2示出溶菌酶及溶菌酶不同组合的抑菌剂对大肠杆菌ATCC25922的外膜渗透性能比较。
[0017] 附图3示出溶菌酶及溶菌酶不同组合的抑菌剂对大肠杆菌DH5α的抑制率比较。
具体实施方式
[0018] 试剂和菌株：以下实施例中所用溶菌酶为蛋清溶菌酶，为Sigma公司产品，但也可以用其他国产蛋清溶菌酶产品取代。甘氨酸、EDTA为国产分析纯试剂。大肠杆菌ATCC25922和大肠杆菌DH5α均来自于美国典型培养物保藏中心ATCC。
[0019] 固态溶菌酶组合抑菌剂的配制：将溶菌酶、甘氨酸、EDTA按质量份配比[0020] 0.25～5：1～10：0.05～0.5称取各组分，混合均匀即可。
[0021] 液态溶菌酶组合抑菌剂的配制：将固态溶菌酶组合抑菌剂溶解于浓度10mM、pH7.4磷酸缓冲液中，使溶菌酶、甘氨酸、EDTA的浓度（质量体积）分别达到0.25～5mg/mL、1～10mg/mL、0.05～0.5 mg/mL，或配成4倍于所述浓度的浓缩液使用。
[0022] 下面是本发明的实施例。
[0023] 实施例1——配方1对大肠杆菌ATCC25922的抑制效果：
[0024] 分别称取溶菌酶4mg、甘氨酸16mg、EDTA 0.8mg，混合均匀，将其溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，配成四倍浓度的溶菌酶组合抑菌剂溶液，溶液中溶菌酶、甘氨酸、EDTA的浓度分别为1mg/mL、4mg/mL和0.2mg/mL。将配成的溶菌酶组合抑菌剂溶液6
200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基
2.02
中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；与本发明的对比实验：单独用溶菌酶4mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，取其200μL加入到200μL菌浓
6
为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基中作用两小时，对大肠杆菌
0.3
ATCC25922的抑菌率为10 ，本发明与后者比较，抑菌率提高了52.5倍。上述抑菌率以N0/N表示，其中N0表示未加入本发明抑菌剂溶液的样品形成的菌落数，N表示加入本发明抑菌剂溶液的样品形成的菌落数，以下同此。
200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基
2.02
中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；与本发明的对比实验：单独用溶菌酶4mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，取其200μL加入到200μL菌浓
6
为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基中作用两小时，对大肠杆菌
0.3
ATCC25922的抑菌率为10 ，本发明与后者比较，抑菌率提高了52.5倍。上述抑菌率以N0/N表示，其中N0表示未加入本发明抑菌剂溶液的样品形成的菌落数，N表示加入本发明抑菌剂溶液的样品形成的菌落数，以下同此。
[0025] 实施例2——配方2对大肠杆菌ATCC25922的抑制效果：
[0026] 分别称取溶菌酶40mg、甘氨酸80mg、EDTA 4mg，混合均匀，将其溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，配成四倍浓度的溶菌酶组合抑菌剂溶液，溶液中溶菌酶、甘氨酸、EDTA的浓度分别为10mg/mL、20mg/mL和1mg/mL。将配成的溶菌酶组合抑菌剂溶液
6
200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基
3.45
中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；与本发明的对比实验：①单独用溶菌酶40mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，溶菌酶浓度为10mg/mL，取其
6
200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基中
1.0
作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；②用溶菌酶40mg、甘氨酸80mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，溶菌酶与甘氨酸的浓度分别为10mg/mL、20mg/
6
mL，取其200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL
2.05
LB培养基中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；③用溶菌酶40mg、EDTA
4mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，溶菌酶与EDTA的浓度分别为10mg/mL、
6
1mg/mL，取其200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL
1.70
LB培养基中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；
6
200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基
3.45
中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；与本发明的对比实验：①单独用溶菌酶40mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，溶菌酶浓度为10mg/mL，取其
6
200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL LB培养基中
1.0
作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；②用溶菌酶40mg、甘氨酸80mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，溶菌酶与甘氨酸的浓度分别为10mg/mL、20mg/
6
mL，取其200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL
2.05
LB培养基中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；③用溶菌酶40mg、EDTA
4mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，溶菌酶与EDTA的浓度分别为10mg/mL、
6
1mg/mL，取其200μL加入到200μL菌浓为10CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400μL
1.70
LB培养基中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为10 ；
[0027] 由上述实施例2可见，本发明和②③分别与①比较，抑菌率分别提高了281.8倍、11.2倍以及5.0倍，说明本发明对大肠杆菌ATCC25922的抑制能力显著增强，上述实施例2的结果示于图1。
[0028] 见图2，用疏水性荧光试剂NPN的常规测试方法，测试实施例2各种抑菌液作用下大肠杆菌ATCC25922外膜渗透性能，结果也表明，溶菌酶与甘氨酸组合的共同作用，使大肠杆菌ATCC25922的外膜渗透性明显提高；溶菌酶与EDTA组合的共同作用，大肠杆菌ATCC25922的外膜渗透性虽提高不多，但渗透速率加快；溶菌酶与甘氨酸、EDTA组合的共同作用，使得大肠杆菌ATCC25922的外膜渗透性能又进一步提高，有助于本发明进入肽聚糖层发挥抗菌活性。图2中的纵坐标为NPN荧光吸收值，横坐标为NPN作用时间，图中对照组为无抑菌剂作用下的大肠杆菌ATCC25922。
[0029] 实施例3——配方2对大肠杆菌DH5α的的抑制效果：
[0030] 溶菌酶及溶菌酶不同组合的抑菌剂配方同实施例2，但测试菌株改变成对溶菌酶敏感性较低的大肠杆菌DH5α，实验方法也同实施例2。
[0031] 实验结果表明：①终浓度为2.5mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液单独作用时对大肠杆0.35
菌DH5α的抑制率为10 ；②终浓度为2.5mg/mL溶菌酶—5mg/mL甘氨酸复配后的磷酸缓
1.60
冲液对大肠杆菌DH5α的抑制率为10 （抑制率相对①提高了17.8倍）；③终浓度为2.5mg/
3.00
mL溶菌酶—0.25mg/mL EDTA复配后的磷酸缓冲液对大肠杆菌DH5α的抑制率为10 （抑制率相对①提高了446.7倍）；④终浓度为2.5mg/mL溶菌酶—5mg/mL甘氨酸—0.25mg/mL
3.15
EDTA复配后的磷酸缓冲液对大肠杆菌DH5α的抑制率为10 （抑制率相对①提高了631.0倍）（图3）。即本发明对大肠杆菌DH5α的抑制能力增强更为显著。上述实施例3的结果示于图3。
菌DH5α的抑制率为10 ；②终浓度为2.5mg/mL溶菌酶—5mg/mL甘氨酸复配后的磷酸缓
1.60
冲液对大肠杆菌DH5α的抑制率为10 （抑制率相对①提高了17.8倍）；③终浓度为2.5mg/
3.00
mL溶菌酶—0.25mg/mL EDTA复配后的磷酸缓冲液对大肠杆菌DH5α的抑制率为10 （抑制率相对①提高了446.7倍）；④终浓度为2.5mg/mL溶菌酶—5mg/mL甘氨酸—0.25mg/mL
3.15
EDTA复配后的磷酸缓冲液对大肠杆菌DH5α的抑制率为10 （抑制率相对①提高了631.0倍）（图3）。即本发明对大肠杆菌DH5α的抑制能力增强更为显著。上述实施例3的结果示于图3。
[0032] 实施例4——配方3对大肠杆菌ATCC25922的抑制效果
[0033] 配方及实验方法同实施例2，其中溶菌酶、甘氨酸、EDTA的终浓度分别为5mg/mL、10mg/mL和0.5mg/mL，测试菌株为大肠杆菌ATCC25922。
[0034] 实验结果表明：①单独用终浓度为5mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液抑菌时，对大肠杆1.40
菌ATCC25922的抑制率为10 ；②终浓度为5mg/mL溶菌酶与10mg/mL甘氨酸、0.5mg/mL
3.98
EDTA复配成的溶菌酶组合抑菌剂的磷酸缓冲液对大肠杆菌ATCC25922的抑制率为10 ，抑制率相对①提高了380.2倍。
菌ATCC25922的抑制率为10 ；②终浓度为5mg/mL溶菌酶与10mg/mL甘氨酸、0.5mg/mL
3.98
EDTA复配成的溶菌酶组合抑菌剂的磷酸缓冲液对大肠杆菌ATCC25922的抑制率为10 ，抑制率相对①提高了380.2倍。
[0035] 本发明在实际应用中，可以将按所述质量份配比的溶菌酶组合抑菌剂粉末以1.3～15‰的重量比添加量混合于含菌料中，也可以按实施例所述方法将本发明配成溶液直接喷涂于含菌料的表面或配成浓缩液混合于含菌料中，抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长。
[0036] 以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，应包含在本发明的保护范围之内。