一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物及其制备方法和应用，该提取物是通过以下方法制备得到的：取黄狗肾饮片，先用浓度为90～95%乙醇浸泡2～4小时，再用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，真空干燥得到黄狗肾提取物，超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力25MPa，萃取温度65℃；分离釜Ⅰ的压力5MPa，温度40℃；分离釜Ⅱ的压力5MPa，温度35℃；夹带剂为95%乙醇；萃取时间2h。本发明提供的黄狗肾提取物，活性成分含量高，非活性大极性化合物较少，本通过对超临界CO2的萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂及其用量的考察，确定黄狗肾有效成分提取效率最高的最佳工艺；实验结果表明超临界CO2萃取物和传统的水提物或醇提物相比具有更好的抗卵巢功能早衰的作用。

权利要求

1.一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：取黄狗肾饮片，先用浓度为90~95%乙醇浸泡2~4小时，然后采用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，然后真空干燥得到黄狗肾提取物，其中超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为25MPa，萃取温度为65℃；分离釜Ⅰ的压力为5MPa，温度为40℃；分离釜Ⅱ的压力为

5MPa，温度为35℃；夹带剂为浓度95%乙醇；萃取时间为2h。

2.一种权利要求1 所述的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取黄狗肾饮片，粉碎过20目筛，先用浓度为90~95%乙醇浸泡2~4小时，然后采用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，然后真空干燥得到黄狗肾提取物，其中超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为25MPa，萃取温度为65℃；分离釜Ⅰ的压力为5MPa，温度为40℃；分离釜Ⅱ的压力为5MPa，温度为35℃；夹带剂为浓度95%乙醇；萃取时间为2h。

3.根据权利要求2所述的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物的制备方法，其特征在于，夹带剂乙醇的体积用量毫升和黄狗肾饮片重量克的比为1至3倍。

4.权利要求1 所述的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物在制备抗卵巢功能早衰药物中的应用。

说明书

一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种动物药，具体涉及一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 黄狗肾为犬科动物雄性狗Canis familiaris L.的干燥阴茎和睾丸，又名狗鞭、广狗肾。其性温味甘、咸，归肾经，具有壮阳补肾、补精益髓功效。主治肾虚阳衰所致的男子阳痿不举，阴囊冰冷作痛，畏寒肢冷，腰膝酸软等。研究报道黄狗肾主要药效成分为脂肪、性激素等。目前的黄狗肾直接作为药味使用，具有较大的腥味，且含有较多的非药用成分，给服用带来较多的不便，且黄狗肾现有的提取方法大多为水提或者醇提，现有的提取方法中有效成分提取率较低，且提取物中含有较多其它杂质，且黄狗肾中的活性成分在高温条件下容易破坏，导致活性降低，甚至消失。因此很有必要在现有技术的基础上研发出一种提取效率高、活性成分结构不易破坏，临床服用方便的黄狗肾提取物的制备方法。发明内容：

[0003] 发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，本发明另一个目的是提供黄狗肾提取物的制备方法和作为制备抗卵巢功能早衰药物中的应用。

[0004] 技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，它是通过以下方法制备得到的：

[0005] 取黄狗肾饮片，先用浓度为90～95％乙醇浸泡2～4小时，然后采用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，然后真空干燥得到黄狗肾提取物，其中超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为25MPa，萃取温度为65℃；分离釜I的压力为5MPa，温度为40℃；分离釜II的压力为5MPa，温度为35℃；夹带剂为浓度95％乙醇；萃取时间为2h。

[0006] 作为优选方案，本发明提供的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，主要成分为脂肪酸和性激素类成分，脂肪酸类主要成分有8-十八碳烯酸、14-甲基十五烷酸、16-甲基十七烷酸、硬脂酸和棕榈油酸，性激素类成分有雌二醇和睾酮。

[0007] 本发明提供的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

[0008] 首先取黄狗肾饮片，粉碎过20目筛，然后用浓度为90～95％乙醇浸泡2～4小时，然后采用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，然后真空干燥得到黄狗肾提取物，其中超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为25～35MPa，萃取温度为55～65℃；分离釜I的压力为3～5MPa，温度为35～40℃；分离釜II的压力为3～5MPa，温度为30～35℃；夹带剂为浓度90～100％乙醇；萃取时间为2～3小时。

[0009] 作为优选方案，以上所述的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物的制备方法，夹带剂乙醇的体积用量毫升和黄狗肾饮片重量克的比为1至3倍，即夹带剂乙醇和黄狗肾饮片的比为1～3(ml/g)，作为更优选的方案，夹带剂乙醇和黄狗肾饮片的比为1(ml/g)[0010] 作为优选方案，以上所述的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物的制备方法，超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为25MPa，萃取温度为65℃；分离釜I的压力为5MPa，温度为40℃；分离釜II的压力为5MPa，温度为35℃；夹带剂为浓度95％乙醇，用量(ml)与黄狗肾饮片重量(g)比为1∶1，萃取时间为2小时。

[0011] 实验研究结果表明，本发明提供的的黄狗肾提取物具有很好的提高顺铂致卵巢早衰小鼠血清中雌二醇含量的作用，且能促进发育质中的卵泡、成熟卵泡和黄体生成的作用，可用于制备抗卵巢功能早衰的药物。

[0012] 一、超临界CO2萃取工艺筛选

[0013] 黄狗肾主要药效成分脂肪、性激素等具有低极性化合物，而超临界CO2流体萃取法为一种新的提取分离方法，它对非极性和低极性化合物具有很强的提取分离效果，而对极性大的化合物提物效率很低，因此，黄狗肾提取得到的化合物有效成分含量高，而极性大的非活性成分的含量较低。本发明为了进一步筛选出最佳的萃取工艺，对夹带剂浓度、用量、萃取温度、萃取时间、萃取压力等重要因素进行考察：

[0014] 1、夹带剂浓度的影响

[0015] 乙醇因其无毒，方便易得且可以通过加水改变其极性，所以选用乙醇为夹带剂。本实验考察了在65℃，25MPa，夹带剂∶药材＝1(ml/g)条件下乙醇浓度对萃取物得率的影响，具体实验结果如表1所示。

[0016] 表1不同乙醇浓度对萃取物得率的影响

[0017]乙醇浓度(％) 萃取物得率(％)
80 12
85 15
90 17
95 28
100 25

[0018]

[0019] 由表1的实验结果表明，萃取物得率随乙醇浓度增加而增加，当乙醇浓度为95％时萃取物得率最大，故优选95％乙醇为夹带剂。

[0020] 2、夹带剂用量的影响本实验考察了65℃，25MPa，95％乙醇为夹带剂条件下，夹带剂用量对萃取物得率的影响，具体实验结果如表2所示。

[0021] 表2不同95％乙醇用量对萃取物得率的影响

[0022]

[0023] 由表2的实验结果表明，萃取物得率随夹带剂用量增加而增加，因此优选夹带剂∶药材＝1～3(ml/g)当夹带剂∶药材＝1(ml/g)时，再增加夹带剂用量，萃取物得率相差不大，为了后续浓缩方便，优选夹带剂∶药材＝1(ml/g)。

[0024] 3、萃取压力的影响萃取压力是超临界流体萃取过程中的重要参数，是影响被萃取物在超临界流体中溶解性能的主要因素。本实验考察了65℃，95％乙醇为夹带剂，夹带剂∶药材＝1(ml/g)条件下，萃取压力对萃取物得率的影响，具体实验结果如表3所示。

[0025] 表3不同萃取压力对萃取物得率的影响

[0026]萃取压力(MPa) 萃取物得率(％)
15 10
20 22
25 28
30 27
35 26

[0027] 由表3的实验结果表明，萃取物得率随萃取压力增加而增加，当压力到达25MPa以上时，萃取物得率较高，故优选萃取压力为25～30MPa。

[0028] 4、萃取温度的影响实验考察了25MPa，95％乙醇为夹带剂，夹带剂∶药材＝1(ml/g)条件下萃取温度对萃取物得率的影响，具体实验结果如表4所示。

[0029] 表4不同萃取温度对萃取物得率的影响

[0030]萃取温度(℃) 萃取物得率(％)
55 22
60 25
65 29
70 27
75 25

[0031] 由表4的实验结果表明，当温度达到65℃后，萃取物得率最高，温度继续升高，萃取得率反而有较小降低，因此优选萃取温度为65℃。

[0032] 5、萃取时间的影响 实验考察了25MPa，65℃、95％乙醇为夹带剂，夹带剂∶药材＝1(ml/g)条件下萃取温度对萃取物得率的影响，具体实验结果如表5所示。

[0033] 表5不同萃取时间对萃取物得率的影响

[0034]萃取时间(小时) 萃取物得率(％)
0.5 12
1 20
2 29
3 30

[0035] 由表5的实验结果表明，随着时间延长，萃取效率逐渐升高，当萃取时间为2小时后，萃取物得率达较大值，因此优选萃取时间为2～3小时。

[0036] 通过以上各因素的筛选实验，本发明提供的超临界CO2萃取的最佳工艺为：萃取压力25MPa，萃取温度65℃；分离釜I压力5MPa，温度40℃；分离釜II压力5MPa，温度35℃；夹带剂95％乙醇的用量(ml)和黄狗肾的用量(g)比为1至2；萃取时间为2至3小时。

[0037] 本发明经过筛选得到最佳的萃取工艺，和传统的水提或醇提相比，超临界CO2萃取黄狗肾中的低极性活性成分具有提取效果高的优点，且可以在低温条件下进行萃取，可以保证活性成分不破坏。因次，超临界CO2萃取物临床上具有更好的药效。

[0038] 有益效果：本发明提供的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物和现有技术相比具有以下优点：

[0039] (1)本发明提供的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，经超临界CO2萃取得到，所含有的脂肪酸类成分和性激素类活性成分含量高，非活性大极性化合物较少，本发明通过实验比较，结果表明超临界CO2萃取物和传统的水提或醇提物相比具有更好的抗卵巢功能早衰的作用。

[0040] (2)本发明提供的具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物的制备方法，通过对超临界CO2的萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂及其用量的考察，确定黄狗肾有效成分提取效率最高的最佳工艺，本发明提供的超临界CO2萃取方法对黄狗肾中低极性、热不稳定的活性成分具有较高的提取效率，且制备方法可操作性强，并且制备工艺中能耗低，对环境无污染。

具体实施方式

[0041] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0042] 实施例1

[0043] 一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，它是通过以下方法制备得到的：

[0044] 取黄狗肾饮片，先用浓度为95％乙醇浸泡2小时，然后采用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，然后真空干燥得到黄狗肾提取物，提取物的主要成分为脂肪酸和性激素类成分。其中超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为25MPa，萃取温度为65℃；分离釜I的压力为5MPa，温度为40℃；分离釜II的压力为5MPa，温度为35℃；夹带剂为浓度95％乙醇，夹带剂95％乙醇的体积用量毫升和黄狗肾饮片重量克的比为1(ml/g)；萃取时间为2h。

[0045] 实施例2

[0046] 一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，它是通过以下方法制备得到的：

[0047] 取黄狗肾饮片，先用浓度为90％乙醇浸泡4小时，然后采用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，然后真空干燥得到黄狗肾提取物，提取物的主要成分为脂肪酸和性激素类成分。其中超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为35MPa，萃取温度为55℃；分离釜I的压力为4MPa，温度为40℃；分离釜II的压力为4MPa，温度为30℃；夹带剂为浓度95％乙醇，夹带剂95％乙醇的体积用量毫升和黄狗肾饮片重量克的比为2(ml/g)；萃取时间为3h。

[0048] 实施例3

[0049] 一种具有抗卵巢功能早衰的黄狗肾提取物，它是通过以下方法制备得到的：

[0050] 取黄狗肾饮片，先用浓度为90％乙醇浸泡3小时，然后采用超临界CO2流体进行萃取，得到萃取物，然后真空干燥得到黄狗肾提取物，提取物的主要成分为脂肪酸和性激素类成分。其中超临界CO2流体萃取条件为：萃取压力为30MPa，萃取温度为60℃；分离釜I的压力为5MPa，温度为35℃；分离釜II的压力为3MPa，温度为35℃；夹带剂为浓度95％乙醇，夹带剂95％乙醇的体积用量毫升和黄狗肾饮片重量克的比为3(ml/g)；萃取时间为2h。

[0051] 实施例4黄狗肾不同提取物的药效学比较及活性成分性激素的含量测定[0052] 1、实验材料

[0053] 1.1药物与试剂黄狗肾饮片购于江苏省医药公司；六味地黄丸(河南宛西制药股份有限公司，批号：091144)；己烯雌酚片(上海信谊康捷药业有限公司，批号：091001)；顺铂注射液(南京制药厂有限公司，批号：20100301)；E2试剂盒(北京华英生物技术研究所，批号：20100902)；TESTO试剂盒(北京华英生物技术研究所，批号：20100902)。

[0054] 提取物的制备(1)水提物：称取黄狗肾饮片适量，加10倍量水浸泡1h，加热煎煮2次，每次1h，合并提取液，浓缩，备用；(2)醇提物：称取黄狗肾饮片适量，加10倍量95％乙醇浸泡1h，加热回流2次，每次1h，合并提取液，回收乙醇至尽，浓缩，备用；(3)SFE-CO2提取物：实施例1制备得到。

[0055] 1.2动物ICR小鼠，SPF级，由扬州大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2007-0001。

[0056] 1.3仪器离心机(LDZ5-2型，北京京立离心机有限公司)；全自动放免计数仪(r-911型，中国科技大学实业总公司)；倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)。

[0057] 2实验方法

[0058] 2.1对顺铂致卵巢早衰小鼠的影响

[0059] 选取有正常动情周期的雌性ICR小鼠56只，体重25-28g，随机分为7组，每组8只。

[0060] (1)正常对照组：等量生理盐水；(2)模型对照组：等量生理盐水；(3)己烯雌酚组：0.25mg/kg；(4)六味地黄丸组：4.5g/kg；(5)水提物组：16.5g/kg；(6)醇提物组：16.5g/kg；(7)SFE-CO2提取物组(实施例1制备得到)：16.5g/kg。

[0061] 以上各组均按上述剂量连续灌胃14d，并于灌胃第2天起正常对照组腹腔注射生理盐水0.2mL/只，其它组按3.0mg/kg每天腹腔注射顺铂，连续7d。末次给药后1h，各组小鼠眼眶后静脉丛取血，离心，取血清测雌二醇(E2)水平。同时取卵巢分组浸入10％甲醛溶液中固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片，HE染色，封片，在光学显微镜下阅片，计数卵巢中各种卵泡和黄体的数量。

[0062] 2.2不同提取物中雌二醇(E2)和睾酮(TESTO)的含量测定

[0063] 样品处理分别取水提物、醇提物以及SFE-CO2提取物各0.1g，精密称定，加无水乙醇5.0mL，密闭，振摇，超声提取30min，离心(3000r/min)15min，取上清液，作为供试品溶液。雌二醇(E2)和睾酮(TESTO)采用放射免疫法进行测定，步骤按照试剂盒说明书进行。

[0064] 3结果与分析

[0065] 3.1对顺铂致卵巢早衰小鼠的影响

[0066] 3.1.1对顺铂致卵巢早衰小鼠E2水平的影响

[0067] 统计学处理数据用 表示，采用t检验，spss16.0统计软件进行统计分析。具体实验结果见表6。

[0068] 表6黄狗肾不同提取物对顺铂致卵巢早衰小鼠E2水平的影响

[0069]

[0070] 注：△p＜0.05，△△p＜0.01与正常组比较；*p＜0.05，**p＜0.01与模型组比较

[0071] 由表6实验结果表明，顺铂致小鼠卵巢早衰后，模型组小鼠的血清雌二醇(E2)水平比正常组明显降低，与正常组比较具有显著性差异(p＜0.01)；己烯雌酚组、六味地黄丸组、醇提物组以及SFE-CO2提取物组小鼠血清E2水平比模型组显著升高，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。且实验结果表明本发明提供的黄狗肾SFE-CO2提取物和水提物或醇提物相比具有明显差异，显示出更好的提高顺铂致卵巢早衰小鼠血清E2水平的作用。

[0072] 3.1.2对顺铂致卵巢早衰小鼠卵巢组织病理的影响

[0073] 统计学处理数据用 表示，采用t检验，spss16.0统计软件进行统计分析。实验结果见表7所示。

[0074] 表7黄狗肾不同提取物对顺铂致卵巢早衰小鼠卵巢组织病理的影响[0075]

[0076] 注*p＜0.05，**p＜0.01与模型组比较

[0077] 顺铂(CDDP)可通过氧化损伤作用，使细胞外基质的形成与降解失衡，从而抑制卵泡和颗粒细胞功能状态，使卵巢功能早衰。由表7的实验结果表明，模型组小鼠发育中卵泡数、成熟卵泡数与正常组相比明显下降；己烯雌酚组、六味地黄丸组、醇提物组以及SFE-C02提取物组小鼠发育中卵泡数与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。且实验结果表明黄狗肾SFE-CO2提取物和黄狗肾醇提物、水提物相比具有明显差异，显示出更好的促进卵巢卵泡发育、成熟的作用，从而能发挥更好的抗卵巢功能早衰的作用。

[0078] 3.2不同提取物雌二醇(E2)和睾酮(TESTO)含量测定，具体实验结果如表8所示：

[0079] 表8黄狗肾不同提取物中E2和TESTO的含量

[0080]