油茶蒲提取物制备药物的用途

摘要

本发明公开了一种油茶蒲提取物的用途，作为5α-还原酶抑制剂。油茶蒲提取物可用于制备治疗前列腺炎的药物，用于制备治疗前列腺增生的药物，用于制备治疗前列腺癌的药物，用于制备治疗痤疮的药物或日化产品，或者用于制备治疗雄激素依赖性脱发的药物或日化产品。

权利要求

1.油茶蒲提取物作为唯一活性成分在制备治疗前列腺增生药物中的应用，其特征是：油茶蒲提取物的制备方法为：油茶果壳经挑选后热风干燥，粉碎过60目筛子，按体积比

1:10加入50%乙醇溶液，40℃～60℃超声30min，过滤，滤液50℃减压浓缩至干粉，制备得油茶蒲醇提取物。

说明书

油茶蒲提取物制备药物的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及油茶蒲提取物的新用途，具体涉及油茶蒲提取物用于制备药品、保健品和日化用品，治疗5α-还原酶相关疾病的应用。

背景技术

[0002] 5α-还原酶(5α-reductase，5AR)是依赖NADPH的酶，在体内能催化睾酮(T)生成活性更强的二氢睾酮(DHT)。抑制该酶的活性，可减少DHT的生成，进而影响与DHT相关的疾病，如前列腺增生、前列腺癌、痤疮、男性脱发等。5α-还原酶有三种同工酶，5α-还原酶I和5α-还原酶II和5α-还原酶III。其中I型酶主要在非生殖性的组织中表达，如肝脏和非生殖器皮肤；II型酶主要在生殖性的组织中表达，如前列腺、生殖器皮肤、附睾、精囊、睾丸等；III型酶具体的特征和功能还需进一步确定。

[0003] 研究表明，5α-还原酶在体内的表达与前列腺增生、前列腺癌、痤疮等疾病密切相关，并且5α-还原酶抑制剂可很好地治疗上述疾病。在增生的前列腺中，I型5α-还原酶和II型5α-还原酶mRNA的表达明显比正常前列腺组织中高，且II型5α-还原酶的表达占主导。在前列腺癌组织中，无论是mRNA水平，还是蛋白质水平，I型5α-还原酶的表达增强，而II型5α-还原酶的表达减弱或不改变。另外，I型和II型5α-还原酶在高等级的前列腺癌组织中的表达均高于低等级的前列腺癌组织。而III型酶在良性前列腺组织中呈低表达，在前列腺癌组织中呈高表达。可见5α-还原酶的表达与前列腺增生及前列腺癌的产生和恶化密切相关，抑制该酶的活性可明显改善前列腺增生的症状，减轻前列腺癌的症状并减小患病几率。多次实验证明，5α-还原酶的抑制剂如度他雄胺和非那雄胺均能显著的减小前列腺的体积，减少前列腺增生症的评分，增加最大尿流量，降低患者患急性尿潴留和进行外科手术的风险。且上述两种抑制剂可明显的降低患者患前列腺癌的风险，减小并抑制癌组织的生长。另外，5α-还原酶在皮肤中广泛分布并参与皮肤的类固醇激素代谢，其活性表达异常可以引起男性脱发、女性多毛及痤疮等病，在临床上应用5α-还原酶抑制剂也取得很好的疗效。

[0004] 油茶(Camellia oleifera Abel)，属于茶科(Theacae)、山茶属(Camellia Linn)多年生木本油料植物，为常绿灌木或小乔木，高3～4m，有时可达8m。其品种繁多， 主要包括普通油茶、浙江红花油茶、广宁红花油茶、小叶油茶和华南油茶等。我国油茶资源丰富且2
分布广泛。全国油茶林约有4,000,000hm，主要分布在西南和东南部各省。油茶果是油茶的果实，为卵圆形，表面有长绒毛，由油茶蒲(也称油茶果壳、油茶果皮和茶包)和油茶籽(也称茶子心)构成。其中油茶蒲的含量占油茶果的60％左右。油茶蒲中含有丰富的木质素、多缩戊糖、鞣质和茶皂素等，作为油茶加工的副产物，通常作为燃料使用或被废弃。有报道指出将油茶蒲用于生产糠醛、木糖醇、活性炭、碳酸钾和焦磷酸钾等化工原料和栽培食用菌，但对其生物活性和药用价值的研究仍十分缺乏。所以加深对油茶蒲的开发和利用对振兴油茶产业、增加油茶的附加值、实现油茶副产物的综合利用，具有深远意义。 [0005] 油茶蒲提取物的制备已经属于公知技术，例如可按照在专利《一种油茶蒲提取物及其制备方法和用途》中公开的方法进行制备相应的水提物或醇提物。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种油茶蒲提取物的新用途，作为5α-还原酶抑制剂，能用于治疗因5α-还原酶所导致的一系列疾病。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种油茶蒲提取物的用途，作为5α-还原酶抑制剂。

[0008] 作为本发明的油茶蒲提取物的用途的改进：用于制备治疗前列腺炎的药物，用于制备治疗前列腺增生的药物，用于制备治疗前列腺癌的药物，用于制备治疗痤疮的药物或日化产品，用于制备治疗雄激素依赖性脱发的药物或日化产品。

[0009] 作为本发明的油茶蒲提取物的用途的进一步改进：油茶蒲提取物为油茶蒲水提取物、油茶蒲醇提取物、油茶蒲水提取物的分离纯化产物、或者油茶蒲醇提取物的分离纯化产物。

[0010] 本发明的发明人在研究过程中发现油茶蒲提取物具有抑制5α-还原酶的能力，并能减轻大鼠前列腺增生症状，抑制前列腺癌细胞的生长，治疗座疮等功能，上述内容在本发明之前从未被报道过。

[0011] 本发明所述的油茶蒲提取物(包括其分离纯化产物)能应用于防治与5α-还原酶相关疾病的保健食品、药品和日化用品等领域。

[0012] 本发明提供了一种来源广泛、安全有效、经济适用的植物提取物——油茶蒲提取物，对其在防治5α-还原酶相关疾病的作用进行了系统的研究，表明具有显著的抑制5α-还原酶活性、抗前列腺增生、抗前列腺癌、抑制痤疮的作用。先前大量的研究已表明油茶蒲提取物具有显著的抗自由基、抗氧化、抗辐射、保护心脑血管等生理和药理活性，因此其具 有安全、无毒、性能稳定、长期食用无副作用等优点。综合上述研究，可将其单独或与其它辅料复配制成保健食品、药品或日化用品，用于5α-还原酶相关疾病的防治。 [0013] 本发明的主要优点在于：

[0014] 1、确定了油茶蒲提取物抑制5α-还原酶的活性，确定了油茶蒲提取物在防治与5α-还原酶相关疾病上的作用，如前列腺炎、前列腺增生、前列腺癌、座疮等，拓展了其在保健品、药品和日化用品中的应用。

[0015] 2、利用了被废弃的油茶蒲，有利于减少资源浪费和环境污染，有利于农民的增收。

[0016] 本发明的油茶蒲提取物作为5α-还原酶抑制剂，实际使用方法为口服或外敷，具体使用剂量如下：

[0017] 当用于治疗前列腺炎时，每天口服用量为5～50mg/kg(体重)。

[0018] 当用于治疗前列腺增生时，每天口服用量为5～50mg/kg(体重)。

[0019] 当用于治疗前列腺癌时，每天口服用量为5～50mg/kg(体重)。

[0020] 当用于治疗痤疮时，在日化用品中的重量含量为十万分之一到万分之五。 [0021] 当用于治疗雄激素依赖性脱发药物时，在日化用品中的重量含量为十万分之一到万分之五。

附图说明

[0022] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0023] 图1是丙酸睾酮致大鼠前列腺增生各组的病理学切片图(×40)；

[0024] 注：放大40倍前列腺组织切片图：A为正常组，B为模型组，C为油茶蒲低剂量组，D为油茶蒲高剂量组，E为非那雄胺组；

[0025] 图2是不同浓度油茶蒲50％乙醇提取物及三个分级相对PC-3细胞生长的抑制作用图；

[0026] 图3是正丁醇相及其大孔树脂洗脱物对PC-3细胞生长的抑制作用图； [0027] 图4是60AL分别在24、48、72h对PC-3细胞的抑制作用图；

[0028] 图5是80AL分别在24、48、72h对PC-3细胞的抑制作用图。

具体实施方式

[0029] 下面通过实例对本发明作进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳的实施方法与材料仅作示范之用。

[0030] 1、油茶蒲提取物对5α-还原酶的抑制作用

[0031] 1.15α-还原酶的制备

[0032] 取清洁级雌性SD大鼠3只，禁食不禁水过夜后脱颈椎处死，取出肝脏冰台上剪碎。用预冷的缓冲液1∶5(肝脏质量g∶缓冲液体积mL)匀浆，在4℃下，10,000g匀浆15min，取胞浆部分做100,000g离心1h，沉淀即为粗微粒提取物，加入缓冲液(体积为前次缓冲液加入量的1/10)，匀浆，作为酶提取液。考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量作为5α-还原酶的量。分装，-80℃冰箱保存。

[0033] 提酶缓冲液：0.32M蔗糖，0.1mM DTT，1mM EDTA，20mM磷酸钠，其余为去离子水，pH6.5。

[0034] 1.25α-还原酶活性测定方法

[0035] 在每2mL缓冲溶液中含有睾酮T 20μM，NADPH 40μM，酶提取液216mg，DTT 1mM、磷酸钠40mM、其余为去离子水、pH 6.5中，在37℃的温度下，反应4min。以NADPH在340nm处吸光值下降速率为酶的活性。

[0036] 1.3油茶蒲提取物的制备

[0037] 油茶果壳经挑选后热风干燥，粉碎过60目筛子，按体积比1∶10加入50％乙醇溶液，40℃～60℃超声30min，过滤，滤液50℃减压浓缩至干粉，制备得油茶蒲醇提取物。 [0038] 称取一定量10.0g的油茶蒲提取物，用1000mL水配制成悬浮液，依次用与水量相等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次(先用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，最后用正丁醇萃取3次；每种萃取液每次的用量＝水的体积)。各不同极性的萃取液合并后用旋转蒸发仪浓缩至干粉，即得石油醚相、乙酸乙酯相，正丁醇相和剩余的水分级相。 [0039] 称取一定量5.0g的正丁醇相，用水5mL配制成悬浮液，过D101大孔吸附树脂，分别用2倍柱体积的水、20％(体积浓度)乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、100％乙醇梯度洗脱，各洗脱相用旋转蒸发仪浓缩至干粉。

[0040] 1.4实验结果

[0041] 取油茶蒲提取物及其分离纯化产物，浓度为10μg/mL时(以1.2中所述的缓冲溶液作为溶剂)测定其对5α-还原酶的抑制活性，结果见表1。可见50％醇提取物经分级萃取后，正丁醇相活性最高，剩余活性仅有20.71％。正丁醇相过大孔树脂乙醇洗脱，40％乙醇洗脱物活性最高，剩余活性仅有3.18％。实验方法按照1.2。

[0042] 表1油茶蒲提取物及其分离纯化部分对5α-还原酶的抑制活性

[0043]

[0044]

[0045] 注：“20AL”代表20％乙醇洗脱而得，其余类同。

[0046] 2、油茶蒲提取物对丙酸睾酮致大鼠前列腺增生的作用

[0047] 2.1实验方法

[0048] 取雄性SD大鼠50只，每只体重220～250g，随机取出10只为空白组。另40只用2％戊巴比妥钠麻醉后，常规消毒皮肤，经阴囊摘除双侧睾丸，残端处结扎，以确保止血，缝合皮肤，肌肉注射青霉素20万U/只，连续3天。1周后，将去睾丸大鼠随机分为4组，每组10只，分别为模型组、非那雄胺阳性对照组、油茶蒲提取物高剂量组、油茶蒲提取物低剂量组，-1
分笼饲养。除空白组外，其余大鼠每天皮下注射丙酸睾丸酮5mg·kg (0.1ml/100g体重)。
并同时分别灌胃给药，模型组以生理盐水0.4ml/100g体重灌胃，样品高剂量组给予水提液-1 -1 -1 -1
500mg·kg ·d (0.4ml/100g体重)，样品剂量组给予水提液200mg·kg ·d (0.4ml/100g-1 -1
体重)，非那雄胺组灌胃非那雄胺1mg·kg ·d (0.4ml/100g体重)，连续用药30天。 [0049] 2.2检测指标

[0050] 在给药期间第22d，用代谢笼收集大鼠24h代谢尿量。

[0051] 于末次给药24h后，称取各组大鼠重量，解剖分离出大鼠前列腺用分析天平称重，计算前列腺指数(前列腺湿重mg/体重g)。

[0052] 前列腺组织立即用10％甲醛固定，取腹叶，HE染色，光镜观察下观察各前列腺组织的细胞学形态。

[0053] 大鼠肝脏冰台上剪碎。用预冷的缓冲液1∶5(肝脏质量g∶缓冲液体积mL)匀浆，在4℃下，10,000g匀浆15min，取上清液作为5α-还原酶粗酶。在含睾酮T 20μM，NADPH40μM，DTT 1mM，磷酸钠40mM，pH 6.5的缓冲溶液中，加入此酶提取液40μL，在37℃的温度下，反应4min，测定反应速率，作为大鼠肝脏5α-还原酶的活力。

[0054] 2.3实验结果

[0055] 从前列腺指数结果表明，大鼠良性前列腺增生模型造模成功，P＜0.01。阳性对照，试样低剂量，高剂量均可减少增生前列腺的重量，但未达到显著性差异。具体如表2所示。

[0056] 表2油茶蒲提取物对大鼠前列腺指数的影响

[0057]

[0058] 注：c表示与空白组比较，P＜0.01

[0059] 在实验的第22天，收集测定大鼠24h内的排尿量，结果见表3。模型组大鼠的尿量显著低于空白组，此时模型组大鼠已经产生前列腺增生，出现排尿量减少的症状。阳性对照组和试样高剂量组可显著改善注射丙酸睾酮大鼠排尿情况，这两组大鼠排尿量与空白组大鼠排尿量接近。低剂量组大鼠排尿量与模型组相比未达到显著性差异。

[0060] 表3油茶蒲提取物对前列腺增生大鼠24h尿量的影响

[0061]

[0062] 注：a表示与空白组比较，P＜0.05；b表示与模型组比较，P＜0.05 [0063] 前列腺组织病理切片，正常组光镜下可见腺体腺腔正常大小，腔内表面光滑，很少有乳头状向腔内突起，上皮细胞排列整齐呈立方形，间质少。模型组上皮呈乳头状增生向腺腔内突出，呈锯齿状，上皮细胞呈高柱状、复层或假复层。油茶蒲低剂量、高剂量、非那雄胺组都可明显改善模型组的症状，腺体排列整齐，上皮细胞不增生或增生不明显，有少量乳头状突起，细胞呈低柱状或扁平状，排列整齐，如图1所示。

[0064] 模型组前列腺明显增生，其肝脏内5α-还原酶的活性也显著增加，从0.251±0.055μM/min增加到0.408±0.022μM/min，P＜0.01。阳性对照组和高剂量组都可显 著降低注射丙酸睾酮大鼠肝脏内5α-还原酶的活性，达到极显著的差异，见表4。低剂量组大鼠肝脏内的5α-还原酶活性与模型组相比没有显著性差异。可见，油茶蒲提取物不仅在体外可以有效地抑制5α-还原酶的活性，也可以降低由丙酸睾酮诱导的前列腺增生大鼠体内5α-还原酶的活性。鉴于5α-还原酶与前列腺增生疾病的密切关系，以及报道
5α-还原酶抑制剂治疗前列腺增生的效果，因此认为油茶蒲醇提物可用于治疗大鼠前列腺增生。

[0065] 表4油茶蒲提取物对前列腺增生大鼠肝脏5α-还原酶活性的影响

[0066]

[0067] 注：a表示与空白组比较，P＜0.05；c表示与空白组比较，P＜0.01；d表示与模型组比较，P＜0.01。

[0068] 3、油茶蒲提取物对高胆固醇模型小鼠前列腺增生的作用

[0069] 3.1实验方法

[0070] 取ICR雄性小鼠50只，除正常组外其余四组用高脂饲料喂养，使得高脂饲料组的小鼠体重比正常对照组高20％时，造模成功，实验中造模为6周。高脂饲料配方为：10％猪油，10％蛋黄粉，1％胆固醇，79％基础饲料。在第七周开始，正常组和高脂模型组用蒸馏水灌胃，低剂量、中剂量、高剂量组分别用100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的油茶蒲50％醇提物灌胃。给药30天后，禁食24h，称重，脱颈椎处死小鼠，取小鼠前列腺称重，并计算前列腺指数。

[0071] 3.2实验结果

[0072] 由表5可知，经高脂和高胆固醇饲养，达到肥胖程度的小鼠，前列腺指数显著要高于空白组，P＜0.05。肥胖小鼠在给予高脂饲料的同时给予油茶蒲50％醇提物，其前列腺指数在一定程度下降。当油茶蒲50％醇提物的浓度达到200mg/kg和400mg/kg体重时，前列腺指数与模型组相比均达到显著性下降。可见油茶蒲提取物可有效减轻高脂高胆固醇饮食引起的前列腺增生。

[0073] 表5油茶蒲提取物对高胆固醇饲养小鼠前列腺指数的影响

[0074]

[0075]

[0076] 注：a表示与空白组比较，P＜0.05；b表示与模型组比较，P＜0.05；d表示与模型组比较，P＜0.01。

[0077] 4、油茶蒲提取物对前列腺癌细胞PC-3的抑制作用

[0078] 4.1实验方法5

[0079] 取对数生长期PC-3细胞，胰酶消化后，调节细胞悬液浓度为1×10 个/ml，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，振荡器上轻轻混匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。贴壁24h后，每孔加入含油茶蒲提取物的培养液100μL，设置5个浓度梯度，使体系终浓度分别为12.5、25、50、100、200μg/mL，并设置本底组、空白组，每组5个复孔，培养24、48、72h。在结束前4h，每孔加入50μL MTT溶液，37℃，5％CO2中继续培养4h。取出96孔板，1800r/min离心5min，甩去液体，用纸吸干残留液体，每孔加入150μL的酸性DMSO，振荡10min，酶标仪上测定OD492。

[0080] 细胞生长抑制率(％)＝[1-(OD样品-OD本底)/(OD空白-OD本底)]×100％ [0081] 注：本底组：100μL培养液+100μL培养液；

[0082] 空白组：100μL细胞悬液+100μL培养液；

[0083] 样品组：100μL细胞悬液+100μL不同浓度的油茶蒲提取物溶液。

[0084] 4.2实验结果

[0085] 如图2所示，50％乙醇提取物和正丁醇相随着浓度的增加，对PC-3细胞的抑制作用增强，乙酸乙酯相和水相物质对PC-3细胞的抑制作用没有呈现浓度依赖性。50％乙醇提取物经分相萃取后，正丁醇相抑制PC-3细胞的活性增强，半抑制浓度为54.8μg/mL，50％乙醇提取物的半抑制浓度为151.6μg/mL。

[0086] 正丁醇相经大孔树脂洗脱后，20％乙醇洗脱物和40％乙醇洗脱物对PC-3细胞的抑制能力下降，而60％乙醇洗脱物和80％乙醇洗脱物作用效果显著增强，如图3所示。在48h，60AL的半抑制浓度为43.0μg/mL，80AL的半抑制浓度为28.1μg/mL，如图4和图5所示。

[0087] 结论：油茶蒲提取物或者其分离纯化产物可抑制5α-还原酶的活性；减小丙酸睾酮致 大鼠前列腺增生模型的前列腺重和前列腺指数，增加大鼠尿流量，抑制大鼠体内5α-还原酶的活性；减小高脂模型导致的小鼠前列腺重和前列腺指数；抑制前列腺细胞的增殖；预防和治疗座疮。可将其用于保健食品、药品和日化用品的开发，用于防治与5α-还原酶相关的疾病。

[0088] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。