本发明公开了一种对真菌单个孢子的分离方法，其技术方案是将玻璃毛细管从尖端插入巴斯德吸管中，用Parafilm封口膜将巴斯德吸管尖端管口处封闭，用解剖针挑取待分离的真菌材料，将毛细管管口中心正对并接近孢子，转移孢子至培养基上方，真孢分离完成，培养基选用PDA培养基或SDA培养基或MEA培养基。本发明通过将巴斯德吸管和不同规格的玻璃毛细管相结合来实现对各种真菌孢子的吸取和转移操作。具有造价低、制作及操作简单，便于拆卸灭菌和可重复利用等特点，同时弥补了目前各种方法均不适合从液体环境中分离真菌孢子的缺陷。
1.真菌单个孢子的分离方法，其特征在于：是通过以下方法实现的：
1.a.根据待分离孢子的大小选择内径在0.02-1mm之间长度为100mm的硬质中性玻璃毛细管，同时备用尖端细长带胶头的玻璃巴斯德吸管以及普通载玻片和蒸馏水，将上述设备及蒸馏水进行高压蒸汽灭菌；
1.b.将玻璃毛细管从尖端插入巴斯德吸管中，留一段在巴斯德吸管外，用Parafilm封口膜将巴斯德吸管尖端管口处封闭；
1.c.用解剖针挑取部分待分离的真菌材料，真菌病害病斑组织或大型真菌菌褶或真菌菌落，置于已消毒的载玻片上，滴加无菌水分散孢子，在复式显微镜或解剖镜下，调整视野使单个孢子清晰可见；
1.d.将巴斯德吸管的胶头捏下并保持不动，在复式显微镜或解剖镜下，将毛细管管口接近待分离的单个孢子，并使毛细管管口中心正对并接近孢子，松动胶头，将孢子吸入毛细管中，保持胶头不动；
1.e.取备用的培养基，转移孢子至培养基上方，捏下胶头将孢子吹到培养基表面，操作过程中如有污染，便更换玻璃毛细管，操作结束后拆卸玻璃毛细管，将巴斯德吸管与毛细管分别保存，真菌单个孢子的分离完成，培养基选用PDA培养基或SDA培养基或MEA培养基或选择培养基。
2.根据权利要求1所述的真菌单个孢子的分离方法，其特征在于：是通过以下方法实现的：
2.a.根据待分离的孢子大小备用内径为0.1mm、长度为100mm的硬质中性玻璃毛细管若干根，尖端细长带胶头的玻璃巴斯德吸管一支，25.4×76.2mm的普通载玻片和20ml蒸馏水，将上述设备及蒸馏水在121℃下高压蒸汽灭菌20min；
2.b.将玻璃毛细管从尖端插入巴斯德吸管中，留20mm长度在吸管外，用Parafilm封口膜将吸管尖端管口处封闭；
2.c.取一支解剖针，在酒精灯火焰上将针头烧红灭菌，待解剖针冷却后，挑取部分待分离的真菌材料，选取链格孢菌落和青霉菌落，置于已消毒的载玻片上，滴加一滴无菌水使孢子分散开，在复式显微镜或解剖镜下，调整视野使单个孢子清晰可见；
2.d.单手持巴斯德吸管和玻璃毛细管，拇指和食指捏巴斯德吸管胶头，中指和无名指夹持吸管的下端，手指不要接触毛细管，将巴斯德吸管的胶头捏下并保持不动，在复式显微镜或解剖镜下，将毛细管管口接近待分离的单个孢子，并使管口中心正对并接近孢子，松动胶头，将单个孢子吸入毛细管中，保持胶头不动，注意不要使孢子进入吸管内；
2.e.取备用的PDA培养基，手持巴斯德吸管和玻璃毛细管转移孢子至PDA培养基上方，捏下胶头将孢子吹到PDA培养基表面，操作过程中如有污染，便更换玻璃毛细管，操作结束后拆卸玻璃毛细管，将巴斯德吸管与毛细管分别保存，真菌单个孢子的分离完成。
真菌单个孢子的分离方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种分离方法，具体是对真菌单个孢子的分离方法，属于微生物培养技术领域。
背景技术
[0002] 由单个孢子培养得到的纯培养物是进行真菌的分离鉴定及基础生理生化研究的基础，因而对真菌单个孢子进行分离就显得尤为重要。目前已有很多用于单孢分离的方法，如利用固定的昆虫针、眉毛针、玻璃毛细管以及手工制作的玻璃针等工具进行单孢分离。美国科学家Hansen在《Science》1926年64：384“A simple method of obtaining single-spore cultures”公开了一种利用玻璃毛细管进行单孢分离的方法，他用玻璃毛细管吸取含有待分离孢子融化的琼脂培养基，待培养基固化后在显微镜下截取存在单个孢子的毛细管片段用于后续的培养。该方法对实验技能的要求较高，一方面很难将培养基吸入毛细管中并截取到单个孢子的毛细管片段，另一方面，操作过程中极易引入其他微生物的污染；中国台湾科学家Goh在《Fungaldiversity》1999年2：47-63“Single-spore isolation using a hand-made glassneedle”中报道了一种手工制作的用于单孢分离的玻璃针，可实现对多种真菌孢子的分离和转移，然而这种方法中玻璃针的制作和使用都比较困难，且极易折断不便保存；拆荣耀和金敏忠在《植物保护》1991年3：53“介绍一种单孢直接挑取获得单孢菌株的方法”中借助固定在显微镜载物台上的昆虫针，实现了对病原菌单孢的分离操作，但该方法的操作比较繁琐，另外由于昆虫针较粗且是固定的，缺少灵活性，很难真正挑取并转移单个的孢子；孙广宇和张天宇在《植物保护》1996年10(1)：40-41“一种简易单孢子分离技术”中使用固定在玻璃棒上的尖端弯折的昆虫针制作了一种挑孢针，虽然这种工具操作比较方便，但仍受限于昆虫针相对于孢子太粗，不利于实现单个孢子的挑取，且不适合于湿度较大及液体环境中的单孢挑取操作；林代福在《山地农业生物学报》2003年22(5)：462-463“单孢分离的眉毛挑针法”中提出了一种特殊的眉毛挑针，可以很好的实现单孢的分离，但这种方法仍然不适合从液体环境中挑取孢子，同时其制作较为繁琐且不利于保存。目前为止，虽然用于单孢分离的方法已有很多，但它们在操作、应用及保存上都有一定的局限性，不能针对各种不同的操作环境成功的进行单孢分离。
发明内容
[0003] 本发明为实现对真菌单个孢子的分离，并克服现行分离方法存在的缺陷，公开了一种简单实用的单孢分离方法。
[0004] 本发明是通过以下方法实现的：
[0005] a.根据待分离孢子的大小选择内径在0.02-1mm之间长度为100mm的硬质中性玻璃毛细管，同时备用尖端细长带胶头的玻璃巴斯德吸管以及普通载玻片和蒸馏水，将上述设备及蒸馏水进行高压蒸汽灭菌；
[0006] b.将玻璃毛细管从尖端插入巴斯德吸管中，留一段在巴斯德吸管外，用Parafilm封口膜将巴斯德吸管尖端管口处封闭；
[0007] c.用解剖针挑取部分待分离的真菌材料，真菌病害病斑组织或大型真菌菌褶或真菌菌落，置于已消毒的载玻片上，滴加无菌水分散孢子，在复式显微镜或解剖镜下，调整视野使单个孢子清晰可见；
[0008] d.将巴斯德吸管的胶头捏下并保持不动，在复式显微镜或解剖镜下，将毛细管管口接近待分离的单个孢子，并使毛细管管口中心正对并接近孢子，松动胶头，将孢子吸入毛细管中，保持胶头不动；
[0009] e.取备用的培养基，转移孢子至培养基上方，捏下胶头将孢子吹到培养基表面，操作过程中如有污染，便更换玻璃毛细管，操作结束后拆卸玻璃毛细管，将巴斯德吸管与毛细管分别保存，真菌单个孢子的分离完成，培养基选用PDA培养基或SDA培养基或MEA培养基或选择培养基。
[0010] 本发明通过将巴斯德吸管和不同规格的玻璃毛细管相结合来实现对各种真菌孢子的吸取和转移操作。该方法具有造价低、制作及操作简单，便于拆卸灭菌和可重复利用等特点，同时弥补了目前各种方法均不适合从液体环境中分离真菌孢子的缺陷。
附图说明
[0011] 附图是本发明分离孢子的模式图。
[0012] 图示：巴斯德吸管1，玻璃毛细管2，Parafilm封口膜3，孢子4。
具体实施方式
[0013] 以下结合附图对本发明做进一步详细描述：
[0014] a.根据待分离的孢子大小备用内径为0.1mm、长度为100mm的硬质中性玻璃毛细管若干根，尖端细长带胶头的玻璃巴斯德吸管一支，25.4×76.2mm的普通载玻片和20ml蒸馏水，将上述设备及蒸馏水在121℃下高压蒸汽灭菌20min；
[0015] b.将玻璃毛细管从尖端插入巴斯德吸管中，留20mm长度在吸管外，用Parafilm封口膜将吸管尖端管口处封闭；
[0016] c.取一支解剖针，在酒精灯火焰上将针头烧红灭菌，待解剖针冷却后，挑取部分待分离的真菌材料，选取链格孢菌落和青霉菌落，置于已消毒的载玻片上，滴加一滴无菌水使孢子分散开，在复式显微镜或解剖镜下，调整视野使单个孢子清晰可见；
[0017] d.单手持巴斯德吸管和玻璃毛细管，拇指和食指捏巴斯德吸管胶头，中指和无名指夹持吸管的下端，手指不要接触毛细管，将巴斯德吸管的胶头捏下并保持不动，在复式显微镜或解剖镜下，将毛细管管口接近待分离的单个孢子，并使管口中心正对并接近孢子，松动胶头，将单个孢子吸入毛细管中，保持胶头不动，注意不要使孢子进入吸管内；
[0018] e.取备用的PDA培养基，手持巴斯德吸管和玻璃毛细管转移孢子至PDA培养基上方，捏下胶头将孢子吹到PDA培养基表面，操作过程中如有污染，便更换玻璃毛细管，操作结束后拆卸玻璃毛细管，将巴斯德吸管与毛细管分别保存，真菌单个孢子的分离完成。
