匐枝青藓配子体离体快繁方法

摘要

本发明公开了一种匐枝青藓配子体离体快繁的方法，包括以下步骤：将生长于自然环境中的匐枝青藓配子体新生分枝表面消毒，接种到无任何激素的培养基上培养10天，获得无菌配子体；将无菌配子体转接到新生配子体培养基上培养30天，获得新生配子体分枝；将新生配子体分枝切割成0.3-0.5cm长的切段，接种到配子体增殖扩繁培养基上，培养30天，每个配子体切段可新生数量众多的配子体分枝。本发明的优点是：方法简单，匐枝青藓繁殖速度快；便于集约化和工产化生产；有利于保护人类环境；为环境科学研究提供理想的试验材料。

权利要求

1.一种匐枝青藓配子体离体快繁方法，步骤如下：

(1)准确称取下列物质，置入容器中混合、搅拌，制备培养基：KNO3 250mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、KH2PO4 250mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/L、酒石酸氨0.115mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、MnSO4·4H2O 11.15mg/L、H3BO3 3.1mg/L、KI0.415mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、NaMoO4·2H2O 0.125mg/L、CoCL2·6H2O

0.0125mg/L；

(2)培养无菌配子体：

取自然环境中生长的匐枝青藓配子体新生分枝表面消毒，接种到步骤(1)制备的培养基上，培养条件：温度25±2℃；光照强度4000lx；光照时间12小时/天；培养10天，筛选获得无菌配子体；

(3)培养新生配子体分枝：

A制备新生配子体培养基：

步骤(1)制备的培养基+0.1～2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01～0.2mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖，置入容器中混合、搅拌，制成；

B将步骤(2)培养的无菌配子体转接到新生配子体培养基，培养条件：温度

20±2℃-35±2℃；光照强度4000lx；光照时间12小时/天；培养30天，获得新生配子体分枝；

(4)配子体增殖扩繁：

A制备配子体增殖扩繁培养基：

步骤(1)制备的培养基+0～0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+0～0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖，置入容器中混合、搅拌，制成；

B将步骤(3)培养的新生配子体分枝切割成长0.3cm-0.5cm的切段，接种到配子体增殖扩繁培养基上，培养条件：温度25±2℃；光照强度4000lx；光照时间12小时/天；培养30天，每个配子体切段可新生数量众多的配子体分枝。

2.根据权利要求1所述的匐枝青藓配子体离体快繁方法，其特征在于：步骤(2)中匐枝青藓配子体新生分枝表面消毒为75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％体积分数的升汞溶液3分钟。

3.根据权利要求1所述的匐枝青藓配子体离体快繁方法，其特征在于：步骤(4)B中选用匐枝青藓配子体上新生的幼嫩分枝切割。

说明书

匐枝青藓配子体离体快繁方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种匐枝青藓培养技术，具体地说是一种匐枝青藓配子体离体快繁方法。

背景技术

[0002] 匐枝 青藓(Brachythecium procumbens(mitt.)jaeg.)苔 藓植 物，青藓 科(Brachytheciaceae)青藓属(Brachythecium)；雌雄同株，植株黄绿色，体形紧密，有光泽。主茎匍匐，弯曲，不规则斜生枝，枝单一或再分枝。叶密生，覆瓦状排列，直立伸展；茎叶阔卵形，内凹，具皱褶；叶尖具短毛尖，中肋达叶长度的2/3-3/4。孢子体生于主茎；雌苞叶狭长，直立，先端反卷。蒴柄扭曲，平滑，长约2mm。

[0003] 苔藓植物结构简单，对环境污染物吸附力强。已有技术表明，苔藓类植物对重金属、空气和环境污染物等因子的反应敏感程度是种子植物的10倍，苔藓植物积累的元素远远超过生理需要水平。即使有毒物质在环境中存在浓度很低，苔藓植物也可以将其吸附、积累和集中在植物体内。由于对空气污染物敏感等优点苔藓植物被国际公认为环境污染指示生物。

[0004] 利用苔藓植物监测和研究环境重金属的沉降污染是国际环境科学研究的重要技术问题。我国主要是通过分析苔藓样品组织内的元素含量，针对点污染源对大气污染进行定量分析，对城市等大范围地区的大气污染进行长期的定量监测。

[0005] 匐枝青藓(Brachythecium procumbens(mitt.)jaeg.)植株体积大，分布广泛，易于采集，利用其指示环境污染具有明显优势。通过组织培养方法，建立匐枝青藓快繁系统，可以为利用匐枝青藓研究大气重金属元素在苔藓植物体内的迁移、分布和富集机制提供理想的试验材料。经检索国内外专利文献，广泛查阅国内外出版物，未见有匐枝青藓在试管内大量扩繁配子体的培养技术，未见有利用匐枝青藓配子体离体培养获得配子体的相关研究报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种离体快繁匐枝青藓配子体的方法，实现人工大量快速扩繁匐枝青藓，为研究苔藓植物对环境污染的生理响应和污染物在苔藓植物体内的迁移、分布和富集机制提供理想的试验材料。

[0007] 本发明目的是这样实现的：

[0008] 一种匐枝青藓配子体离体快繁方法，步骤如下：

[0009] (1)准确称取下列物质，置入容器中混合、搅拌，制备培养基：

[0010] KNO3 250mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、KH2PO4 250mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/L、酒石酸氨0.115mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、MnSO4·4H2O 11.15mg/L、H3BO3 3.1mg/L、KI 0.415mg/L、ZnSO4·7H2O4.3mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、NaMoO4·2H2O 0.125mg/L、CoCL2·6H2O0.0125mg/L；

[0011] (2)培养无菌配子体：

[0012] 取自然环境中生长的匐枝青藓配子体新生分枝表面消毒，接种到步骤(1)制备的培养基上，培养条件：温度25±2℃；光照强度4000lx；光照时间12小时/天；培养10天，筛选获得无菌配子体；

[0013] (3)培养新生配子体分枝：

[0014] A制备新生配子体培养基：

[0015] 步骤(1)制备的培养基+0.1～2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01～0.2mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖，置入容器中混合、搅拌，制成；

[0016] B将步骤(2)培养的无菌配子体转接到新生配子体培养基，培养条件：温度20-35±2℃；光照强度4000lx；光照时间12小时/天；培养30天，获得新生配子体分枝；

[0017] (4)配子体增殖扩繁：

[0018] A制备配子体增殖扩繁培养基：

[0019] 步骤(1)制备的培养基+0～0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+0～0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖，置入容器中混合、搅拌，制成；

[0020] B将步骤(3)培养的新生配子体分枝切割成长0.3cm-0.5cm的切段，接种到配子体增殖扩繁培养基上，培养条件：温度25±2℃；光照强度4000lx；光照时间12小时/天；培养30天，每个配子体切段可新生数量众多的配子体分枝；

[0021] 步骤(2)中匐枝青藓配子体新生分枝表面消毒为75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％体积分数的升汞溶液3分钟。

[0022] 步骤(4)B中选用匐枝青藓配子体上新生的幼嫩分枝切割。

[0023] 本发明的要点是：

[0024] 取自然环境中生长的匐枝青藓配子体新生分枝，接种到培养基上，培养10天，筛选获得无菌配子体；然后培养新生配子体分枝：再进行配子体增殖扩繁。

[0025] 本发明制备的培养基为无任何激素的改良Knop′s培养基；本发明使用的新生配子体培养基、配子体增殖扩繁培养基是在无任何激素的改良Knop′s培养基基础上增加必要的组分。

[0026] 由于匐枝青藓植株体积大，分布广泛，易于采集，利用其吸附环境污染物、指示环境污染状况具有明显优势。所以本发明方法实施后对匐枝青藓吸附、积累环境中的重金属和环境污染物，对于保护环境具有重要的意义。

[0027] 本发明在世界上首次建立了匐枝青藓配子体离体快繁的方法，填补了现有技术没有匐枝青藓配子体离体快繁方法空白。使用本发明的离体快速扩繁方法，有利于高度集约化和高密度工产化生产；有利于自动化控制生产；在短时间内可实现人工大量扩繁匐枝青藓配子体，为研究苔藓植物对环境污染的生理响应和污染物在苔藓植物体内的迁移、分布和富集机制提供理想的试验材料，具有重要的科研、环保价值。

[0028] 本发明的优点是：

[0029] 1、方法简单，匐枝青藓繁殖速度快。

[0030] 2、便于集约化和工产化生产。

[0031] 3、有利于保护人类环境。

[0032] 4、为环境科学研究提供理想的试验材料。

具体实施方式

[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明：

[0034] 实施例1：

[0035] 剪取生长于自然环境中的匐枝青藓配子体新分枝进行表面消毒，消毒剂为75％体积分数的酒精溶液和0.1％体积分数的升汞溶液。消毒后，将切取长度约为0.5cm的分枝先端接种到无任何激素的改良Knop′s培养基上培养，以获得无菌外植体。培养条件为：温度25±2℃，光照强度4000lx，光照时间12小时/天，培养10天。

[0036] 按常规方法制备75％体积分数的酒精溶液和0.1％质量体积分数的升汞溶液，用于匐枝青藓配子体的表面灭菌，灭菌剂组合和灭菌时间为以下3种：

[0037] a)75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％质量体积分数的升汞溶液3分钟；

[0038] b)75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％质量体积分数的升汞溶液5分钟；

[0039] c)75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％质量体积分数的升汞溶液10分钟；

[0040] 按常规方法制备无任何激素的改良Knop′s培养基，用于无菌外植体的筛选培养，培养基配方组成为：改良Knop′s基本培养基+10g/L蔗糖。

[0041] 配子体灭菌结果如下：

[0042] a)75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％质量体积分数的升汞溶液3分钟灭菌处理后，无菌成活率38.8％，污染成活率52.4％，死亡率9.8％；

[0043] b)75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％质量体积分数的升汞溶液5分钟灭菌处理后，无菌成活率12.2％，污染成活率22.6％，死亡率65.2％；

[0044] c)75％体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1％质量体积分数的升汞溶液10分钟灭菌处理后，死亡率100％；

[0045] 比较上述配子体灭菌结果可以看出：匐枝青藓配子体对0.1％质量体积分数升汞溶液的抗毒害能力较弱，3分钟灭菌处理即可导致死亡现象发生，灭菌处理时间达到10分钟时，配子体全部死亡殆尽。

[0046] 实施例2：

[0047] 将实例1得到的无菌外植体转接到诱导新生配子体产生的培养基上，培养30天。培养条件为：温度25℃，光照强度4000Lx，光照时间12小时/天；

[0048] 按常规方法制备诱导新生配子体产生的培养基，培养基配方组成为以下五种：

[0049] 改良Knop′s基本培养基配方为：KNO3 250mg/L、MgSO4·7H2O250mg/L、KH2PO4250mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/L、酒石酸氨0.115mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、MnSO4·4H2O
11.15mg/L、H3BO33.1mg/L、KI 0.415mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、NaMoO4·2H2O 0.125mg/L、CoCL2·6H2O 0.0125mg/L；

[0050] a)改良Knop′s基本培养基+0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.01mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖；

[0051] b)改良Knop′s基本培养基+0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖；

[0052] c)改良Knop′s基本培养基+0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖；

[0053] d)改良Knop′s基本培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖；

[0054] e)改良Knop′s基本培养基+2.0mg/L 6-糠基氨基嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖。

[0055] 培养结果如下：

[0056] a)改良Knop′s基本培养基+0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.01mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，无菌分枝先端伸长生长速度较缓慢，新生分枝较少。培养30天时，无菌分枝平均长度为1.7cm，每个分枝上产生的长度达0.5cm以上的新生分枝数平均为3个；

[0057] b)改良Knop′s基本培养基+0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，无菌分枝先端伸长生长速度较快，新生分枝较多。培养30天时，无菌分枝平均长度为3.2cm，每个分枝上产生的长度达0.5cm以上的新生分枝数平均为5个；

[0058] c)改良Knop′s基本培养基+0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，无菌分枝先端伸长生长速度一般，新生分枝较多而短。培养30天时，无菌分枝平均长度为2.2cm，每个分枝上没有长度达0.5cm以上的新生分枝；

[0059] d)改良Knop′s基本培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，无菌分枝先端膨胀变粗且伸长生长速度很缓慢，新生分枝多且短。培养30天时，经测量无菌分枝平均长度为1.1cm，每个分枝上没有长度超过0.5cm的新生分枝；

[0060] e)改良Knop′s基本培养基+2.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，无菌分枝先端明显变粗肿胀，颜色变得浓绿，伸长速度极其缓慢，分枝上形成许多密集新生绿色粒状物。培养30天时，无菌分枝平均长度为仅0.8cm，未见新生分枝。

[0061] 比较上述培养结果可以看出，在改良Knop′s基本培养基基础上，添加6-苄基氨基嘌呤和萘乙酸两种激素的浓度组合不同，对无菌配子体先端的生长和新生分枝的诱导形成有很大影响。0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸既有利于无菌配子体先端的生长又有利于新生分枝的形成。

[0062] 实施例3：

[0063] 将实例2得到的无菌新生分枝切割成长约0.3cm-0.5cm的切段，转接到诱导新生配子体产生的最佳培养基上，培养30天。所述诱导新生配子体产生的最佳培养基的配方为：改良Knop′s基本培养基+0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖。其中改良Knop′s基本培养基配方为：KNO3 250mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、KH2PO4250mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/L、酒石酸氨0.115mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、MnSO4·4H2O
11.15mg/L、H3BO3 3.1mg/L、KI 0.415mg/L、ZnSO4·7H2O4.3mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、NaMoO4·2H2O 0.125mg/L、CoCL2·6H2O 0.0125mg/L；

[0064] 常规方法制备诱导新生配子体产生的培养基，按以下四种培养条件进行培养：

[0065] a)温度20±2℃，光照强度4000lx，光照时间12小时/天，培养30天；

[0066] b)温度25±2℃，光照强度4000lx，光照时间12小时/天，培养30天；

[0067] c)温度30±2℃，光照强度4000lx，光照时间12小时/天，培养30天；

[0068] d)温度35±2℃，光照强度4000lx，光照时间12小时/天，培养30天。

[0069] 培养结果如下：

[0070] a)温度20±2℃，光照强度4000Lx，光照时间12小时/天，培养30天时，无菌配子体切段颜色鲜绿，每个切段上产生长度超过0.5cm的新生分枝数平均为3个；

[0071] b)温度25±2℃，光照强度4000Lx，光照时间12小时/天，培养30天时，无菌配子体切段颜色鲜绿，每个切段上产生长度超过0.5cm的新生分枝数平均为5个；

[0072] c)温度30±2℃，光照强度4000Lx，光照时间12小时/天，培养30天时，无菌配子体切段颜色淡绿，每个切段上长度超过0.5cm的新生分枝数平均为6个，但生长细弱，颜色黄绿；

[0073] d)温度35±2℃，光照强度4000Lx，光照时间12小时/天，培养30天时，无菌配子体切段颜色黄绿，每个切段上的新生分枝细弱发黄，没有长度超过0.5cm的新生分枝。

[0074] 比较上述培养结果可以看出，培养温度对于匐枝青藓配子体的生长状态和新生分枝形成有显著影响，25±2℃是比较适宜的培养温度，温度过高或过低都不利于配子体的生长和新生分枝的形成。

[0075] 实施例4：

[0076] 将实施例3中b)诱导培养得到的新生配子体切割剪碎接种到配子体增殖扩繁的培养基上，培养30天。培养条件为：温度25±2℃，光照强度4000lx，光照时间12小时/天。

[0077] 按常规方法制备配子体增殖扩繁的培养基，配方组成为以下四种：

[0078] a)改良Knop′s基本培养基+10g/L蔗糖；

[0079] b)改良Knop′s基本培养基+0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖；

[0080] c)改良Knop′s基本培养基+0.2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖；

[0081] d)改良Knop′s基本培养基+0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖；

[0082] 培养结果如下：

[0083] a)改良Knop′s基本培养基+10g/L蔗糖中，细碎分枝上新生分枝较少，培养30天时，新生分枝平均长度为1.2cm，每个细碎分枝上产生的新生分枝数平均为1个；

[0084] b)改良Knop′s基本培养基+0.1mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，细碎分枝上新生分枝较少，培养30天时，无菌分枝平均长度为1.6cm，每个细碎分枝上产生的新生分枝数平均为2个；

[0085] c)改良Knop′s基本培养基+0.2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，细碎分枝上新生分枝较多，培养30天时，经测量无菌分枝平均长度为1.4cm，每个细碎分枝上产生的新生分枝数平均为4个；

[0086] d)改良Knop′s基本培养基+0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸+10g/L蔗糖中，细碎分枝上新生分枝较少，培养30天时，无菌分枝平均长度为0.6cm，每个细碎分枝上产生的新生分枝数平均为2个；

[0087] 比较上述培养结果可以看出，在改良Knop′s基本培养基基础上，添加6-苄基氨基嘌呤和萘乙酸两种激素的浓度组合不同，对配子体的生长和增殖有很大影响。0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.05mg/L萘乙酸既有利于配子体分枝的形成又有利于新生分枝的生长。

[0088] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修