一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法

摘要

一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，属于植物技术领域。制备工艺包括：以密茱萸为原料，用含水乙醇做溶剂进行渗漉提取；提取液闪蒸浓缩回收溶剂；浓缩液通大孔吸附树脂柱分离富集，用含水溶剂进行梯度洗脱，合并一定比例的含水溶剂洗脱液闪蒸浓缩回收溶剂，继续真空干燥成干粉即可。其工艺简单、提取浓缩方法优越、操作方便、绿色高效，提取物中总黄酮的含量为6.12％～15.58%，总黄酮的提取率为5.25％～10.43%，总黄酮的转移率高达45.63％～62.88%。经初步体外生物活性试验表明，密茱萸总黄酮提取物具有一定的抗氧化、抑菌等活性，可用作食品添加剂、抗氧剂、防腐剂等，具有一定的开发应用价值。

权利要求

1.一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）原料处理：将密茱萸药材挑选后用粉碎机打成粗粉，过20～40目筛；

2）渗漉提取：将密茱萸粗粉装入渗漉筒中，用50％～80%含水乙醇浸泡8～12 小时后，用50％～80%含水乙醇进行渗漉提取，若原料重量为1kg则含水乙醇的用量为8～16升，流速为5～8 mL/min，收集渗漉液；

3）闪蒸浓缩：将渗漉液在水浴温度60℃～90℃，真空度为0.090 Mpa～0.095Mpa，进-1液流速为200～350 mL·min 的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到每mL药液折合含1.0～2.0g原料的浓缩液；

4）大孔树脂吸附纯化：将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，依次用水、10%含水乙醇、20%～70%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为5～15 mL · -1min ，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20%～60%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在60℃～90℃下，真空度为0.090 Mpa～0.095Mpa，进液流速为250～-1

350 mL · min 的条件下进行真空薄膜浓缩干燥，即得密茱萸总黄酮提取物干粉。

2.如权利要求1所述的一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤2）中：用于浸泡的含水乙醇浓度为60％～70％，浸泡时间为9-10小时；用于渗漉提取的含水乙醇浓度为60％～70％，流速为6～7 mL/min。

3.如权利要求1所述的一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤3）-1中：水浴温度为70℃～80℃，真空度为0.093Mpa，进液流速为250～300mL·min 。

4.如权利要求1所述的一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4）中：依次用水、10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、70%含水乙醇进行-1梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为8～12mL·min ，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液。

5.如权利要求1所述的一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4）中：依次用水、10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、70%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱液。

6.如权利要求1所述的一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4）中：合并的洗脱液浓缩干燥的温度为70℃～80℃下，真空度为0.093 Mpa，进液流速为-1

280～320 mL·min 。

说明书

一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物技术领域，具体为一种从中草药中提取总黄酮的制备方法。

背景技术

[0002] 黄酮类化合物是一类存在于植物界的具有生物活性的重要物质，广泛存在于不同科属植物中，主要存在于芸香料、唇形科、豆科、伞形科与菊科中。研究报道，约有20％的中草药中含有黄酮类化合物，可见黄酮类化合物的资源相当丰富。黄酮类化合物可以从食物中摄得，也可从富含黄酮类化合物的植物中提取，它不仅能作为防治心脑血管疾病的药物，而且有明显的抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基，降血脂、降低胆固醇、降血糖，抗癌防癌、免疫调节等生理活性，是一类具有广阔应用前景的天然成分，也是应用前景广泛的天然抗氧剂，防腐剂，可用于研制多种保健食品、食品添加剂和化妆品。因此具有很好的开发应用价值。

[0003] 近年来从天然植物中提取黄酮类化合物的方法多采用常规的提取方法，包括冷浸法、超声法、回流法等。这些方法具有溶剂用量大、提取时间长、操作麻烦、效率较低等弊端。而分离富集黄酮类成分多采用大孔树脂柱色谱，以不同比例的含水溶剂梯度洗脱的方法。
由于大量提取液和洗脱液需要浓缩，浓缩方法不当往往容易造成有效成分破坏，降低有效成分的提取率，同时黄酮提取物中常含有一些重金属杂质，且往往超标。

[0004] Melicope patulinervia (Merr.& Chun)Huang为芸香科密茱萸属植物，为灌木或乔木，分布在中国大陆的海南的等地，生长在海拔900～1200米的坡地疏林中，为海南特有植物。据文献报道，该科植物中所含的化学成分主要为黄酮类、生物碱类和萜类等，具有显著的抗氧化、抑菌杀虫、清热解毒、行气止痛，燥湿止痒等作用。是一味民间常用中草药，民间主要用于治疗咽喉肿痛，热毒疮肿，风湿痹痛，湿火骨痛，跌打肿痛等症，外用治疗皮肤湿热疮疹，皮肤瘙痒，痔疮。目前对其化学成分的研究及其开发应用未见有任何报道。

发明内容

[0005] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种从中草药中提取总黄酮的制备方法的技术方案，其工艺简单、提取浓缩方法优越、操作方便、绿色高效，总黄酮提取物的收率较高。

[0006] 所述的一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

[0007] 1）原料处理：将密茱萸药材挑选后用粉碎机打成粗粉，过20～40目筛；

[0008] 2）渗漉提取：将密茱萸粗粉装入渗漉筒中，用50％～80%含水乙醇浸泡8～12 小时后，用50％～80%含水乙醇进行渗漉提取，若原料重量为1kg则含水乙醇的用量为8～16升，流速为5～8 mL/min，收集渗漉液；

[0009] 3）闪蒸浓缩：将渗漉液在水浴温度60℃～90℃，真空度为0.090 Mpa～0.095Mpa，-1进液流速为200～350 mL·min 的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到每mL药液折合含1.0～2.0g原料的浓缩液；

[0010] 4）大孔树脂吸附纯化：将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，依次用水、10%含水乙醇、20%～70%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为5～15 -1
mL · min ，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20%～60%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在60℃～90℃下，真空度为0.090 Mpa～0.095Mpa，进液流速为-1
250～350 mL · min 的条件下进行真空薄膜浓缩干燥，即得密茱萸总黄酮提取物干粉。

[0011] 所述的一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤2）中：用于浸泡的含水乙醇浓度为60％～70％，浸泡时间为9-10小时；用于渗漉提取的含水乙醇浓度为60％～70％，流速为6～7 mL/min。

[0012] 所述的一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤3）中：水浴温度-1为70℃～80℃，真空度为0.093Mpa，进液流速为250～300mL·min 。

[0013] 所述的一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4）中：依次用水、10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、70%含水乙醇进行梯度洗脱，-1最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为8～12mL·min ，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液。

[0014] 所述的一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4）中：依次用水、10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、70%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱液。

[0015] 所述的一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，其特征在于步骤4）中：合并的洗脱液浓缩干燥的温度为70℃～80℃下，真空度为0.093 Mpa，进液流速为280～320 -1mL·min 。

[0016] 所述的大孔吸附树脂为Dianon HP-20大孔吸附树脂。

[0017] 上述一种从中草药中提取总黄酮的制备方法，具有以下有益效果：

[0018] 1、本发明对密茱萸采用含水乙醇渗漉提取，真空闪蒸浓缩，具有提取溶剂用量少、提取效率比冷浸法高、室温提取不破坏有效成分；闪蒸浓缩时浓缩液受热温度低、时间短、浓缩速度快、效率高，操作简单、使用方便、节能环保等优势。

[0019] 2、上述从密茱萸中提取制备总黄酮的方法，工艺简单、提取浓缩方法先进、操作方便、成本低，绿色高效，总黄酮提取物收率高。采用紫外分光光度法测定所得到的总黄酮提取物，提取物中总黄酮的含量为6.12％～15.58%，总黄酮的提取率为5.25％～10.43%，总黄酮的转移率高达45.63％～62.88%。经初步体外生物活性试验表明，密茱萸总黄酮提取物具有一定的抗菌、抗氧化活性，可用作食品添加剂、抗氧剂、防腐剂、药物原料等。因此具有很好的开发应用价值。

[0020] 3、通过ICP-MS法测定总黄酮提取物中重金属的含量，发现采用该发明方法制备的密茱萸总黄酮中重金属含量很低，符合《中国药典》及《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。

[0021] 本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，液体的百分含量为体积比，固体的百分含量为重量比。

附图说明

[0022] 图1为5-羟基-6,7.8-三甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基黄酮的核磁共振氢谱图；

[0023] 图2为5-羟基-6,7.8-三甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基黄酮的核磁共振碳谱图；

[0024] 图3为5,6,7.8-四甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基黄酮的核磁共振氢谱图；

[0025] 图4为5,6,7.8-四甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基黄酮的核磁共振碳谱图。

具体实施方式

[0026] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

[0027] 实施例1：

[0028] 1）原料处理：将密茱萸药材挑选后用粉碎机打成粗粉，过20目筛；

[0029] 2）渗漉提取：将密茱萸粗粉装入渗漉筒中，用60%含水乙醇浸泡10 小时后，用70%含水乙醇进行渗漉提取，若原料重量为1kg则含水乙醇的用量为12升，流速为6 mL/min，收集渗漉液；

[0030] 3）闪蒸浓缩：将渗漉液在水浴温度70℃，真空度为0.095Mpa，进液流速为250 mL -1· min 的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到每mL药液折合含2.0g原料的浓缩液；

[0031] 4）大孔树脂吸附纯化：将得到的浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂分离富集，依次用水、10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、70%含水乙醇进行-1梯度洗脱，洗脱流速为10 mL·min ，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液，将合并的洗脱液在70℃下，真空度-1
为0.095Mpa，进液流速为300 mL·min 的条件下进行真空薄膜浓缩真空浓缩、干燥，即得密茱萸总黄酮提取物干粉。

[0032] 在本发明所述的制备方法中：

[0033] 步骤1）中将密茱萸药材粗粉过40目筛；

[0034] 步骤2）中用于浸泡的含水乙醇浓度为50％、70％或80％，浸泡时间为8小时、9小时或12小时；用于渗漉提取的含水乙醇浓度为50％、60％或80％，流速为流速为5 mL/min、7 mL/min或8 mL/min；

[0035] 步骤3）中水浴温度为60℃、80℃或90℃，真空度为0.093Mpa，进液流速为-1 -1 -1200mL·min 、300mL·min 或350mL·min ，得到每mL药液折合含1.0g、1.3g、1.5g、1.8g原料的浓缩液；

[0036] 步骤4）中依次用水、10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、70%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，收集合并、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱液。

[0037] 步骤4）中：合并的洗脱液浓缩干燥的温度为60℃、70℃或80℃，真空度为0.093 -1 -1 -1 -1Mpa，洗脱流速为5mL·min 、8mL·min 、12mL·min 或15mL·min ，进液流速为250 -1 -1 -1
mL·min 、320 mL·min 或350 mL·min 。上述步骤中用H2O及10％的含水乙醇洗脱为除去水溶性杂质，最后都用70%丙酮洗脱除掉全部杂质，再生大孔吸附树脂；

[0038] 其它同实施例1，能取得本发明所述的有益效果。

[0039] 以下通过相应的试验对通过本发明制备的总黄酮提取物进行总黄酮及重金属的含量测定，同时进行体外抗菌及抗氧化活性试验。

[0040] 1、密茱萸提取物中总黄酮的含量测定

[0041] 测定条件：UV-2102PCS 紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所提供），槲皮素的最大吸收波长：510 nm。

[0042] 标准曲线的绘制：准确称取干燥恒重的槲皮素对照品5.5 mg，加入75%乙醇溶解-1并定容至50 mL的量瓶中，摇匀得浓度为0.110 mg · mL 的对照品溶液。分别取上述槲皮素标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0于10 mL量瓶中，用75%乙醇补充至5 mL，各加入0.5 mL 5%亚硝酸钠，摇匀，放置5 min后再各加入10%硝酸铝0.5 mL，摇匀。5 min后再加入4%的氢氧化钠溶液4 mL，混匀，用75%乙醇稀释至刻度。15 min后于510 nm处测吸光度，试剂为空白参比，以槲皮素质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归, 得槲皮素含量与吸光度之间的回归方程：y = 12.93x + 0.44，γ=0.9980。

[0043] 样品的含量测定：精密称定干燥的密茱萸提取物干粉（实施例1）适量，用75%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL 量瓶中，添加75%乙醇溶液使体积约为5 mL，按照上述绘制槲皮素标准曲线的方法，依次加入亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠溶液，混匀，用75%乙醇稀释至刻度。静置20 min后测定吸光度。重复3次测定，并根据标准曲线换算出样品中总黄酮的含量，计算出密茱萸提取物中总黄酮的平均含量为16.12％～21.58%，总黄酮的提取率为5.25％～10.43%，总黄酮的转移率高达45.63％～
62.88%。

[0044] 经系统提取分离，从密茱萸70%乙醇提取物的不同萃取部位得到了若干个黄酮单体，经过理化鉴别及光谱技术鉴定了它们的结构。其中在乙酸乙酯萃取部位分离鉴定出的5,6,7.8-四甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基黄酮，5-羟基-6,7.8-三甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基黄酮的量非常大。经HPLC含量测定，密茱萸总黄酮提取物中5-羟基-6,7.8-三甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基黄酮及5,6,7.8-四甲氧基-3′,4′-亚二甲氧基黄酮的含量分别达3.12%和5.37%。

[0045] 2、密茱萸总黄酮提取物中重金属元素的含量测定

[0046] （1）仪器与工作参数：采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定密茱萸总黄酮提取物中重金属元素的含量。X-Series型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)；MARS-5型微波消解仪(美国CEM公司)， 附RTP-300 Plus温控；Milli-Q Academic超纯水处理器(美国Millipore公司)。硝酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。仪器工作参数如下表1。

[0047] 表1 ICP-MS工作参数

[0048]工作参数 设定值 工作参数 设定值
正向功率/(W) 1200 采样深度 130
扫描模式 跳峰 冷却气流量/(L•min-1) 13.02
扫描次数 100 辅助气流量/(L•min-1) 0.70
驻留时间/(μs) 10000 雾化气流量/(L•min-1) 0.84
采样时间/(s) 49 进样时间/(s) 45
样品提升率/(mL•min-1) 1.0 清洗时间/(s) 60

[0049] （2） 样品的预处理及微波消解：精密称取密茱萸总黄酮提取物粉末（实施例1）0.1 g ( 称准至0.0001 g) ，置于聚四氟乙烯微波消解罐的内罐中，加入5 mL浓硝酸，轻微振荡静置0.5 h，放入微波消解仪中，按微波消解程序进行消解，消解完毕后冷却至室温，取出内罐将消解液转移并定容到50 mL容量瓶中，同时备一份空白溶液做对照，见表2。

[0050] 表2 微波消解程序

[0051]消解程序 功率/W升温时间/min 控制压力/kPa 温度/℃ 持续时间/min
1 1200 5 340 120 2
2 1200 3 689 150 3
3 1200 3 1000 180 6

[0052] 在消解安全限度内，对消解罐内的压力、温度、升温时间进行优选，发现采用三个程序的逐渐升温、升压方式进行微波消解，获得了无残渣、澄清透明的消化液，整个微波处理只需要11 min。

[0053] 对于砷和铅等易挥发元素，在消解过程中需严格控制温度。实验证明消解温度约150℃时能保持消解液处在近似微沸状态，刚好达到HNO3的沸点。同时为防止样品炭化，硝酸采取滴加的形式，且加入硝酸后注意温度的控制，使消解液保持微沸状态，以保证样品中待测元素损失最小。

[0054] （3）标准溶液及线性范围：铬、砷、镉、铅、铜标准贮备溶液(美国SPEX CertiPrep Inc.)，浓度为10 mg • L-1，分别储存于聚乙烯塑料瓶中，然后根据测定的需要配成适当浓度的混合标准溶液（含1％硝酸）。

[0055] 用逐步稀释法从标准储备液中移出一定量的标准溶液，用高纯水稀释配制成标准溶液，铬、砷、镉、铅、铜元素的标准系列浓度均为2.0、5.0、10.0、20.0 μg • L-1，标准溶液中含1％HNO3。分别加入内标溶液，在选定的优化条件下，采用ICP-MS进行测定，标准溶液进入ICP-MS后，仪器给出了各元素的工作曲线及线性关系。5种元素的线性回归方程、线性相关系数、线性范围及检出限如下表3。

[0056] 表3 线性方程和相关系数

[0057]元素 线性回归方程 线性相关系数 线性范围(μg•L-1) 检出限(μg•L-1)
Cr Y=3.53×102X+1.21×103 0.9998 0～1000 0.20
As Y=4.57×102X+9.57×10-1 0.9997 0～1000 5.65×10-2
Cd Y=9.48×102X+4.11 0.9998 0～1000 5.13×10-3
Pb Y=1.02×104X+9.80×102 0.9998 0～1000 1.57×10-2
Cu Y=6.54×102X+2.57×102 0.9996 0～1000 7.53×10-2

[0058] （3）方法的准确度实验：为了评价该方法的准确度，采用标准加入法测定各元素的回收率。在选定的测定条件下重复测定5次，分别测定了5种元素的回收率和相对标准偏差RSD，结果5个重金属元素平均回收率在99..2％～103.3%之间， RSD在0.69%～2.04％之间，表明此方法准确可靠，能满足样品中各元素的分析测定。

[0059] （4）样品测定结果：仪器点火，泵入高纯水，检测各元素的空白计数，然后泵入2 -1μg • L 的混合标准溶液，检测仪器的灵敏度。上述各步正常且仪器稳定后，即可按照仪器的工作参数开始测定。将消解好的样品溶液依次吸入ICP-MS仪，测定溶液中的各元素含-1
量，同时测定样品空白以及标准溶液，结果样品中Cu的含量为12.47 μg • g ；Cr的含量-1 -1 -1
为0.62 μg • g ；As的含量为0.30 μg • g ； Cd的含量为0.16 μg • g ；Pb的含量-1
为4.21 μg • g 。

[0060] 铬、镉、铅、铜、砷属重金属及砷盐，为有害元素，被人体吸收后可引起蓄积性中毒。铜虽为人体必需元素，但过量也有害。这些重金属及砷盐的限量指标主要依据《中国药典》和《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》来评价。参照此标准，即Cu≤20.0 μg · g -1 -1 -1 -1
， Cd≤0.3 μg · g ，Pb≤5.0 μg · g ，As≤2.0 μg · g ，此标准中没有铬，因-1
此参照绿色食品标准（Cr≤1.0 μg · g ）。上述试验测定结果表明，密茱萸总黄酮提取物中有害重金属元素Cd， Cr ，Pb，Cu、As的含量均低于限量标准，符合药用植物及其制剂进出口绿色行业标准及绿色食品标准。

[0061] 3、抗氧化试验结果

[0062] 1,1-二苯基苦基苯肼( 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH ) 是一种稳定的有机自由基, 通过检测生物试剂对DPPH 自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。近年来，国内外学者利用DPPH 溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定，并被证明是一种灵敏、简单易行的有效方法。本试验采用DPPH分光光度法用以评价密茱萸总黄酮提取物的抗氧化能力。

[0063] DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心自由基，DPPH·在溶液中可生成具有典型紫色的稳定溶液，并在517nm 处有强烈吸收。当它与自由基清除剂作用时， 由于清除剂与DPPH孤对电子配对而使其在517nm处的吸光度减小，使溶液的典型紫色变浅。，其吸光度的变化与其所接受的电子成定量关系。即吸光度越小，自由基清除剂清除自由基的能力越强，因而可用分光光度法进行定量分析。

[0064] （1）实验条件：Tecan Infinite M200酶标仪（瑞士）；UV-2102 PCS紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；101-3电热鼓风恒温干燥箱（杭州蓝天化验仪器厂）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；R201B旋转蒸发仪（上海申胜生物科技有限公司）。1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（1,1-Diphenyl-2 -picryl-hydrazyl, DPPH）购自sigma公司，酶标板： 96微孔板，其他试剂均为分析纯。

[0065] （2）DPPH溶液及供试品溶液的配制：DPPH溶液的配制：准确称取DPPH试剂30.4 mg，用75%乙醇溶解，并定量转入100 mL量瓶中，从中精密量取4.5 mL，用75 %乙醇定容至-125 mL，摇匀得质量浓度为54 μg · mL 的DPPH 贮备液，置于冰箱中冷藏备用。

[0066] 供试品溶液的制备：分别精确称取通过本发明方法提取纯化得到的密茱萸总黄酮提取物干粉（实施例1）适量，用75%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中。然后分别取50、100、200、400、600、800 μL样品溶液，用75%乙醇定容至1 mL 量瓶中，得到不同浓度的供试品溶液，置于4℃冰箱中保存待用。

[0067] （3）测定方法与结果：用点样用移液枪在96孔酶标板中分别加入不同浓度的供试品溶液20 μL和DPPH试液200 μL。样品加入后震荡30s， 26℃保温30 min后，在用Infinite M 200酶标仪在517 nm波长下测定其吸光值(Ap)，同时测定不加DPPH的样品空白（用200 μL75%乙醇代替DPPH）吸光值 (Ac) 和加DPPH但不加样品(用20 μL 75%乙醇代替样品)的吸光值(Amax)。样品测定过程中用Trolox作阳性对照，并以此换算出被测样品总的抗氧化能力，测定结果表示为达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox浓度。称该方法为TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)法。TEAC值表示的是Trolox的浓度，Trolox浓度越大，表明清除自由基能力越强。以Trolox (X)浓度为横坐标，以测得的自由基清除率(Y)为纵坐标绘制标准曲线，Y=7.261X+0.535，r=0.9970。

[0068] 样品抗氧化能力用TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity)表示，自由基的清除率= 1- (Ap-Ac)/Amax ×100%。

[0069] 计算结果实施例1的样品对DPPH清除能力的TEAC值为73.56 (mg GAE/g DW)，结果表明供试样品对DPPH自由基具有一定的清除率，且清除率随供试样品溶液浓度的增大而提高。。表明本发明制备的总黄酮提取物具有一定的抗氧化活性。

[0070] 以上结果表明密茱萸总黄酮对DPPH自由基的清除率较高，表明密茱萸提取物中的总黄酮具有一定的抗氧化活性，且在配制浓度范围内随浓度升高抗氧化能力增强。

[0071] 4、抑菌试验结果

[0072] 抑菌活性的测定采用琼脂扩散滤纸片法，根据抑菌环直径判断抑菌能力。滤纸片直径6.0 mm，灭菌干燥后备用。每个样品做3 次重复实验，数据采用SPSS1010进行分析，组间比较采用t 检验。

[0073] （1）供试样品溶液的配制：分别称取一定量由本发明制备的密茱萸总黄酮提取物（实施例1），平行称取3份，加蒸馏水定容至容量瓶中，然后依次稀释为不同浓度的水溶液，并以消毒蒸馏水做空白对照。

[0074] （2）菌种活化与灭菌处理：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌冷藏菌种分别接入2支营养琼脂斜面培养基活化，30℃培养24 h。培养基、其他实验所用器材和试剂均在120℃下湿热高压灭菌2 h。

[0075] （3）抑菌实验及抑菌圈的测定：抑菌圈测量是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂 培养基内成球形立体状扩散，抑制试验菌的繁殖，在抑菌物质的周围形成的透明圈。将无菌小滤纸片高温蒸汽灭菌干燥后备用。用无菌移液管吸取各种菌悬液加入无菌培养皿中，用镊子夹取浸透样品溶液的滤纸片，将其放在培养基表面。将放好滤纸片的含菌培养皿分别在恒温箱中培养，到时取出，测量并记录形成的抑菌环的直径。每组实验重复3次，实验结果取平均值。

[0076] （4）最小抑菌浓度(MIC)测定结果：MIC的测定采用二倍稀释法。将不同浓度的样品溶液分别用移液管移入各个平皿内，倒入已经高温灭菌的培养基中充分混匀，冷却凝固后，每皿中加入菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀进行培养。取出，观察结果，以不长菌的溶液浓度做为最低抑菌浓度MIC，结果供试样品对金黄色葡萄球菌的抑菌试验结果MIC为37.22 -1 -1μg · mL ，抑菌环直径18.47 mm；对大肠杆菌的抑菌试验结果MIC为64.19 μg · mL ，抑菌环直径11.55mm。

[0077] 该试验结果表明，供试样品的水溶液对供试菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有较强的抑制作用,且随浓度的增加抑菌效果增强。在相同浓度条件下供试样品对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显大于大肠杆菌，该试验结果表明密茱萸总黄酮具有一定的抑菌活性。

[0078] 经初步体外活性试验表明，密茱萸总黄酮具有一定的抗氧化及抗菌活性，因此具有很好的开发应用价值。