玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用

摘要

本发明提供了玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用，克隆达托霉素合成基因簇中非核糖体蛋白合成酶(NRPS)基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，将ET12567与玫瑰孢链霉菌共培养，通过结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，然后通过安普霉素抗性筛选转化子，通过PCR进一步确认。本发明构建的玫瑰孢链霉菌基因工程菌可直接用于达托霉素的工业化生产，可提高产量降低成本。

权利要求

1.达托霉素基因工程菌的构建方法，其特征是：设计引物将NRPS上游的dptE和dptF基因克隆入出发载体得重组表达载体，然后利用结合转移的方法转移入玫瑰孢链霉菌获得的基因工程菌株；或，将NRPS下游的dptG、dptH、dptI和dptJ基因克隆入出发载体得重组表达载体，然后利用结合转移的方法转移入玫瑰孢链霉菌获得的基因工程菌株。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述表达载体为整合型载体或高拷贝数的质粒载体。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是所述表达载体中NRPS附属基因的启动子为ermE*；表述载体的出发载体为pIB139。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征是步骤如下：

⑴设计PCR引物扩增NRPS基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ；

⑵将克隆得到的目的基因插入pIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位点；

⑶然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；

⑷将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37℃共培养20小时，然后用含有25μg/ml萘啶酮酸和50μg/ml安普霉素的无菌水将平板覆盖，再在30℃培养48小时，筛选转化子。

5.达托霉素基因工程菌的应用，其特征是：

⑴在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces rosesporus基因工程菌HP-GJ01或HP-EF01的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；其中HP-EF01和HP-GJ01,保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.3734和CGMCC No.3733；

⑵取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，

180～220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；

⑶以1%～4%的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中，在发酵培养中30℃培养，在0～

30h，控制pH 6.5，溶氧45%；在30h～144h，控制pH7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以

0.10mL/h的速度开始流加1:1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为

0.25mL/L·h，发酵144小时；

⑷通过HPLC检测发酵液中的达托霉素浓度。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是所述发酵培养发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L， L-天冬素0.12g/L，K2SO4

0.6g/L，初始pH 7.0。

7.达托霉素基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces rosesporus）HP-EF01和HP-GJ01,保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.3734和CGMCC No.3733。

说明书

玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其在生产达托霉素中的应用。

背景技术

[0002] 达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁酸脂质(LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理，对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素，在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年和2006年达托霉素(Daptomycin，LY146032)先后被美国FDA和了欧洲药品评价署(EMEA)的认证和批准上市。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但是菌种原始，达托霉素的产量低，生产成本很高，因此通过基因工程技术选育高产优良菌株，进一步提高达托霉素的产量，具有重要的经济价值和社会意义。

发明内容

[0003] 本发明提供一种达托霉素的基因工程菌的构建方法，与出发菌株相比实例菌株的达托霉素产量的到了显著提高。

[0004] 达托霉素在玫瑰孢链霉菌中由非核糖体蛋白合成酶(NRPS)指导合成。达托霉素合成基因簇一共有64个开放阅读框。其中位于NRPS基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ在达托霉素合成过程中起着关键作用。dptE、dptF分别编码乙酰辅酶A连接酶和酰基载体蛋白ACP，在生物功能上紧密相关，一同酰化游离的癸酸，酰化的癸酸与达托霉素直链尾部的色氨酸的缩合开启了达托霉素合成的第一步。dptG能够调控NRPS基因簇或促进合成的抗生素排泄胞外，以减低对宿主的毒害。dptH编码硫脂酶，对达托霉素合成过程起到纠错的作用。dptI编码甲基化酶，以腺苷蛋氨酸为甲基供体催化α-酮戊二酸转化为三甲基化的α-酮戊二酸，然后在转氨酶的作用下催化其合成达托霉素重要前体3m-Glu。dptJ编码色氨酸双加氧酶，催化色氨酸的有氧降解，合成达托霉素重要前体Kyn。因此过表达NRPS基因上下游附属关键基因，可显著提高达托霉素的合成效率。

[0005] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0006] 达托霉素基因工程菌的构建方法，利用PCR扩增NPRS上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ，将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。

[0007] 所述表达载体为整合型载体或高拷贝载体质粒载体。所述表达载体中NRPS附属基因的启动子为ermE*；表述载体的出发载体为pIB139。

[0008] 达托霉素基因工程菌的构建方法，步骤如下：

[0009] (1)设计PCR引物扩增NRPS基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ；

[0010] (2)将克隆得到的目的基因插入pIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位点；

[0011] (3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；

[0012] (4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37℃共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30℃培养48小时，筛选转化子。

[0013] 达托霉素基因工程菌的应用，其特征是：

[0014] (1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus基因工程菌HP-GJ01或HP-EF01的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；

[0015] (2)取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；

[0016] (3)以1％～4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中，在发酵培养中30℃培养，在0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％；在30h～144h，控制pH 7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时；

[0017] (4)通过HPLC检测发酵液中的达托霉素浓度。

[0018] 所述的培养基组成及质量含量为：

[0019] 种子液体培养基组成及质量含量为：糊精1g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，K2HPO4·3H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05，CaCO3 0.02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7.0。

[0020] 所述的发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K2SO4 0.6g/L，初始pH 7.0。

[0021] 本发明的达托霉素基因工程菌，为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces reseosporus)HP-EF01和HP-GJ01，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.3734和CGMCCNo.3733。

[0022] 本发明的效果和作用是：

[0023] 本发明提供了能提高达托霉素产量的基因工程菌的构建方法。属于基因重组技术。该方法包括以下过程：克隆达托霉素合成基因簇中非核糖体蛋白合成酶(NRPS)基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ(如图1)，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，将ET12567与玫瑰孢链霉菌共培养，通过结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，然后通过安普霉素抗性筛选转化子，通过PCR进一步确认。本发明构建的玫瑰孢链霉菌基因工程菌可直接用于达托霉素的工业化生产，可提高产量10％-45％，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低达托霉素生产成本。

附图说明

[0024] 图1：达托霉素结构及非核糖体蛋白合成酶(NRPS)基因簇示意图；

[0025] 图2：过表达重组载体构建流程。

具体实施方式

[0026] 实施例1

[0027] 基因工程菌HP-EF01的构建(CGMCC 3734)

[0028] 设计引物PCR克隆位于NRPS上游的dptE和dptF(dptEF)。(上下游引物分别为：上引：GGAGTGCATATGGTGAGTGAG (下划线为NdeI酶切位点)；下引：CATCTATCTAGAATCCCCTCAGG(下划线为XbaI酶切位点)。将PCR产物和表达载体pIB139分别用NdeI/XbaI双酶切，回收后，将dptEF和pIB139以3∶1～1∶1的比例用T4连接酶在16℃连接2小时构建重组表达载体pEF139(如图2)，然后用热激法导入ET12567大肠杆菌感受态细胞，在LB培养基活化培养一小时后涂到氨苄抗性平板。然后挑取转化子提取质粒严证。然后用结合转移的方法将重组表达载体pEF139导入玫瑰孢链霉菌。

[0029] 具体步骤如下：

[0030] (1)将ET12567单克隆挑进10ml含50μg/ml氯霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml的安普霉素过夜培养

[0031] (2)取1ml过夜培养的菌液接种到50ml含氯霉素，卡那霉素，安普霉素各50mg/ml的培养基中，37℃培养到OD值达到0.5-0.8；

[0032] (3)用等体积的不含抗生素的LB培养基清洗2次，重悬于0.1体积的LB培养基中；

[0033] (4)在洗大肠杆菌的同时，加大概108个链霉菌的孢子于500μl的2×YT培养基中，50℃下热击10分钟，然后37℃活化2小时；

[0034] (5)加500μl大肠杆菌细胞于0.5ml的热击过的孢子或菌丝体中，快速混合，离心。扔掉大部分上清液，重悬细胞；

[0035] (6)将混合细胞涂布于含0.01mol/LMgCl2的MS琼脂培养基上，30℃培养16-20h，在涂布之前将MS板于超净风中吹1h，有利于吸掉下一步涂布的水；

[0036] (7)用含0.5mg的萘啶酮酸和1mg安普霉素的水覆盖；

[0037] (8)挑选转化子于选择性高氏一号培养基上(含有50μg/ml安普霉素和25μg/ml的萘啶酮酸)。

[0038] (9)结合转移菌株的筛选：结合转移LB平板上生长2天后，得到了结合转化子，接菌到含50ug/ml的安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号选择培养基上，基本确认为接合转移株，但尚需进一步验证，准备接种到液体培养基上培养，提取基因组，利用载体上的PCR进行确认验证。所用的测序引物序列：上引：TTGCGCCCGATGCTAGTCG；下引：GCACGACAGGTTTCCCGACTG

[0039] 最后将筛选获得的dptEF过表达基因工程菌命名为HP-EF01。

[0040] 发酵应用：

[0041] 在室温下取玫瑰孢链霉菌S.reseosporus HP-EF01的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时；然后以1％～4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中；然后，30℃，在0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％；30h～144h，控制pH 7.0，通气量控制
0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。
达托霉素发酵产量达到698mg/L，比出发菌株提高了15％。

[0042] 实施例2

[0043] 基因工程菌HP-GJ01的构建(CGMCC 3733)

[0044] 设计引物PCR克隆位于NRPS下游的dptG，dptH，dptI和dptJ(dptGHIJ)。上下游引物分别为：上引：TCCGTGCATATGAGGAAACAT(下划线为NdeI酶切位点)；下引：CGTCAGTCTAGAGACGCTTGC(下划线为XbaI酶切位点)。将PCR产物和表达载体pIB139分别用NdeI/XbaI双酶切，切胶回收后，将dptGHIJ和pIB139以3∶1～1∶1的比例用T4连接酶在16℃连接2小时构建重组表达载体pGJ139(如图2)，然后用热激法导入ET12567大肠杆菌感受态细胞，在LB培养基活化培养一小时后涂到氨苄抗性平板。然后挑取转化子提取质粒严证。然后用结合转移的方法将重组表达载体pGJ139导入玫瑰孢链霉菌。具体步骤如下：

[0045] (1)将ET12567单克隆挑进10ml含50μg/ml氯霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml的安普霉素过夜培养

[0046] (2)取1ml过夜培养的菌液接种到50ml含氯霉素，卡那霉素，安普霉素各50mg/ml的培养基中，37℃培养到OD值达到0.5-0.8；

[0047] (3)用等体积的不含抗生素的LB培养基清洗2次，重悬于0.1体积的LB培养基中；

[0048] (4)在洗大肠杆菌的同时，加大概108个链霉菌的孢子于500μl的2×YT培养基中，50℃下热击10min，然后37℃活化2小时；

[0049] (5)加500μl大肠杆菌细胞于0.5ml的热击过的孢子或菌丝体中，快速混合，离心。扔掉大部分上清液，重悬细胞；

[0050] (6)将混合细胞涂布于含0.01mol/LMgCl2的MS琼脂培养基上，30℃培养16-20h，在涂布之前将MS板于超净风中吹1h，有利于吸掉下一步涂布的水；

[0051] (7)用含0.5mg的萘啶酮酸和1mg安普霉素的水覆盖；

[0052] (8)挑选转化子于选择性高氏一号培养基上(含有50μg/ml安普霉素和25μg/ml的萘啶酮酸)。

[0053] (9)结合转移菌株的筛选：结合转移LB平板上生长2天后，得到了结合转化子，接菌到含50ug/ml的安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号选择培养基上，基本确认为接合转移株，但尚需进一步验证，准备接种到液体培养基上培养，提取基因组，利用载体上的PCR进行确认验证。所用的测序引物序列：上引：TTGCGCCCGATGCTAGTCG；下引：GCACGACAGGTTTCCCGACTG

[0054] 最后将筛选获得的dptEF过表达基因工程菌命名为HP-GJ01。

[0055] 发酵应用：

[0056] 在室温下取玫瑰孢链霉菌S.reseosporus HP-GJ01的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时；然后以1％～4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中；然后，30℃，在0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％；30h～144h，控制pH 7.0，通气量控制
0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时。达托霉素发酵产量达到818mg/L，比出发菌株提高了34.5％。

[0057] 本发明的生物保藏说明：

[0058] 1.(Streptomyces reseosporus)HP-EF01达托霉素基因工程菌，为玫瑰孢链霉菌；

[0059] 保藏单位：保藏于中国微生物菌种保藏管理中心；

[0060] 保藏编号：CGMCC No.3734；

[0061] 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

[0062] 保藏日期2010年4月16日。

[0063] 2.(Streptomyces reseosporus)HP-GJ01达托霉素基因工程菌，为玫瑰孢链霉菌；

[0064] 保藏单位：保藏于中国微生物菌种保藏管理中心；

[0065] 保藏编号：CGMCC No.3733；

[0066] 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

[0067] 保藏日期2010年4月16日。