本发明公开了一种毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，该方法采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris C13，保藏编号：CGMCC No.4437为菌种，包括一级种子培养，二级种子培养，发酵罐培养和诱导表达，对诱导表达后的发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、凝胶柱层析、沉淀脱色、离子交换层析和超滤脱盐，得到重组类人胶原蛋白。本发明和其它纯化方法相比，工艺简单，目的蛋白产率高，回收率达到60％以上，纯度达95％以上，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产重组类人胶原蛋白。
1.一种毕赤酵母在表达重组类人胶原蛋白的应用，其特征在于，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris C13，保藏编号：CGMCC No.4437。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母在表达重组类人胶原蛋白的应用，其特征在于，包括一级种子培养，二级种子培养，发酵罐培养和诱导表达，对诱导表达后的发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、凝胶柱层析、沉淀脱色、离子交换层析和超滤脱盐，得到重组类人胶原蛋白；
菌种：巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris C13，保藏编号：CGMCC No.4437，保藏日期：
酵母浸出粉 10g/L 胰蛋白胨 20g/LpH6.0磷酸钾缓冲溶液 100mmol/L YNB 13.4g/LBiotin 0.2mg/L 甘油 10mL/L；
甘油 40g/L K2SO4 18.2g/LH3PO4 26.7mL/L CaSO4·2H2O 0.93g/LMgSO4 14.9g/L KOH 4.13g/LPTM1 4.35mL；
CuSO4·5H2O 6.0g/L KI 0.088g/LMnSO4·H2O 3.0g/L Na2MoO4·2H2O 0.2g/LH3BO3 0.02g/L CoCl2·6H2O 0.5g/LZnCl2 20.0g/L FeSO4·7H2O 65.0g/LBiotin 0.2g/L 浓H2SO4 5.0mL/L；
将甘油保存的菌种接种至含有300mL种子培养基的摇瓶中，30℃，250r/min培养24小时～36小时；
将一级种子液全部转接入含有4L发酵培养基的5L发酵罐中，30℃培养，用氨水调节并控制pH值为5.0，溶氧控制在20％～30％，培养至OD600达到2.0～6.0；
将二级种子液转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中，30℃培养，用氨水调节并控制pH值为5.0，通气量为55L/min，搅拌速率为650r/min，当溶氧陡然上升时，预示培养基中的甘油已耗尽，此阶段耗时20小时，开始流加补甘油，pH值控制为5.0，溶氧控制在20％以上，补甘油6小时后饥饿1小时使甘油耗尽，然后开始甲醇诱导，诱导阶段温度为28℃，pH值控制在5.0，溶氧控制在20％～40％，甲醇补料速度从3.6mL/h/L逐渐增大到8.0mL/h/L，诱导36小时～48小时后达到平台期，诱导72h后出罐；其中，3.6mL/h/L是指1L发酵液中1h补加3.6mL甲醇，8.0mL/h/L是指1L发酵液中1h补加8.0mL甲醇，将出罐后的发酵液利用大容量冷冻离心机离心去除菌体，收集上清液，将上清液超滤浓缩至5L，并过滤去除机械杂质；
采用Sephacryl S-100凝胶装柱，取3L Sephacryl S-100凝胶装于规格为80cm×12cm的纯化柱中，用去离子水平衡2～3个柱体积，上800mL浓缩样品，流速为40mL/min，去离子水洗脱，用核酸蛋白仪检测，收集蛋白峰；
用稀HCl调节粗蛋白液的pH值至4.0，静置沉淀脱色，收集上清液；
将沉淀脱色后收集的上清液以pH值为8.0的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制成上样液，阴离子填料选用DEAE Sepharose FF，用10倍柱体积的pH值为8.0的洗脱液洗脱，收集目标蛋白溶液；所述洗脱液为含有50mmol/L Tris-HCl和0.5mol/L NaCl的水溶液；
用截留分子量为50KDa的超滤膜组件对阴离子交换层析收集的目标蛋白溶液进行脱盐并浓缩；
毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法。
背景技术
[0002] 胶原蛋白是体内含量最多的一种蛋白质，约占人体蛋白质的25％～33％，其广泛分布于机体各个组织器官，如皮肤、骨骼、软骨、角膜、血管等，尤其在人体的皮肤和结缔组织中，含有大量的胶原蛋白。胶原蛋白作为一种结缔组织的粘合物质，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有重要作用。
[0003] 胶原蛋白作为天然的生物资源，已广泛的应用在生物医药、化妆品、食品等行业中。目前，市场对胶原蛋白的需求量越来越大，其主要来源是利用酸碱法从动物机体中提取获得，但这种胶原蛋白虽然产量较高，但其具有水溶性差、纯度低，在临床上易出现排斥反应且存在病毒隐患等缺点，从而抑制了胶原蛋白在各行业的应用。随着生物技术的发展，人们利用转基因及基因重组技术表达胶原蛋白也获得了成功，如利用哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统及大肠杆菌表达系统等，哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂，表达水平低，规模化生产成本较高，不易普遍推广使用，而大肠杆菌表达系统虽然表达量较高，但存在着易形成包涵体，产生较多杂蛋白等问题，从而导致后期的纯化困难，回收率低。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种工艺简单，蛋白产率高、收率高及纯度高，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产的毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法。
[0005] 本发明所用菌种是巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris C13，该菌种已于2010年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.4437。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，其特征在于，该方法采用巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris C13，保藏编号：CGMCC No.4437为菌种，包括一级种子培养，二级种子培养，发酵罐培养和诱导表达，对诱导表达后的发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、凝胶柱层析、沉淀脱色、离子交换层析和超滤脱盐，得到重组类人胶原蛋白。
[0007] 上述的毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，所述凝胶柱层析的凝胶层析柱填料为Sephacryl S-100。
[0008] 上述的毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，所述沉淀脱色过程中调节粗蛋白液pH值为4.0。
[0009] 上述的毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，所述离子交换层析过程中，离子交换柱填料为DEAE Sepharose FF，以pH值为8.0的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制上样液，以pH值为8.0的洗脱液洗脱，所述洗脱液中含有50mmol/L的Tris-HCl和0.5mol/L的NaCl。
[0010] 本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明采用巴斯德毕赤酵母基因工程菌表达重组类人胶原蛋白，酵母是单细胞真核生物，它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性，同时又具有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，使表达产物具有天然结构和生物活性，而且毕赤酵母均为分泌型表达，更利于后期的纯化，另外，毕赤酵母发酵培养基采用无机盐，其配制简单、价格低廉，适合大规模发酵生产。本发明和其它纯化方法相比，工艺简单，目的蛋白产率高，回收率达到60％以上，纯度达95％以上，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产重组类人胶原蛋白。
[0011] 本发明涉及的生物材料为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris C13，其保藏日期为2010年12月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.4437。
[0012] 下面结合附图和实施例，对本发明技术方案做进一步的详细说明。
附图说明
[0013] 图1为本发明发酵液离心后上清液的HPLC检测图。
[0014] 图2为本发明DEAE阴离子层析后洗脱液的HPLC检测图。
[0015] 图3为本发明发酵液纯化前后的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
[0016] 毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法包括：一级种子培养，二级种子培养，发酵罐培养和诱导表达，对诱导表达后的发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、凝胶柱层析、沉淀脱色、离子交换层析和超滤脱盐，得到重组类人胶原蛋白。
[0017] 1、菌种：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris C13，保藏编号：CGMCCNo.4437，保藏日期：2010年12月8日；
[0018] 2、培养基：
[0019] (1)种子培养基为BMGY培养基，组成为：
[0020] 酵母浸出粉 10g/L 胰蛋白胨 20g/L
[0021] pH6.0磷酸钾缓冲溶液 100mmol/L YNB 13.4g/L
[0022] Biotin 0.2mg/L 甘油 10mL/L。
[0023] (2)发酵培养基组成为：
[0024] 甘油 40g/L K2SO4 18.2g/L
[0025] H3PO4 26.7mL/L CaSO4·2H2O 0.93g/L
[0026] MgSO4 14.9g/L KOH 4.13g/L
[0027] PTM1 4.35mL；
[0028] 其中PTM1组成为：
[0029] CuSO4·5H2O 6.0g/L KI 0.088g/L
[0030] MnSO4·H2O 3.0g/L Na2MoO4·2H2O 0.2g/L
[0031] H3BO3 0.02g/L CoCl2·6H2O 0.5g/L
[0032] ZnCl2 20.0g/L FeSO4·7H2O 65.0g/L
[0033] Biotin 0.2g/L 浓H2SO4 5.0mL/L。
[0034] 3、发酵
[0035] (1)一级种子培养
[0036] 将甘油保存的菌种接种至含有300mL种子培养基的摇瓶中，30℃，250r/min培养24小时～36小时；
[0037] (2)二级种子培养
[0038] 将一级种子液全部转接入含有4L发酵培养基的5L发酵罐中，30℃培养，用氨水调节并控制pH值为5.0，溶氧控制在20％～30％，培养至OD600达到2.0～6.0；
[0039] (3)发酵罐培养和诱导表达
[0040] 将二级种子液转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中，30℃培养，用氨水调节并控制pH值为5.0，通气量为55L/min，搅拌速率为650r/min，当溶氧陡然上升时(预示培养基中的甘油已耗尽，此阶段耗时约20小时)，开始流加补甘油，pH值控制为5.0，溶氧控制在20％以上，补甘油6小时后饥饿1小时使甘油耗尽，然后开始甲醇诱导，诱导阶段温度为28℃，pH值控制在5.0，溶氧控制在20％～40％左右，甲醇补料速度从3.6mL/h/L(1L发酵液中1h补加3.6mL甲醇)逐渐增大到8.0mL/h/L(1L发酵液中1h补加8.0mL甲醇)，诱导
36小时～48小时后达到平台期，诱导72h后出罐；
[0041] 4、将出罐后的发酵液利用大容量冷冻离心机离心去除菌体，收集上清液，将上清液超滤浓缩至5L左右，并过滤去除机械杂质；
[0042] 5、采用Sephacryl S-100凝胶装柱，取3L Sephacryl S-100凝胶装于规格为80cm×12cm的纯化柱中，用去离子水平衡2～3个柱体积，上800mL浓缩样品，流速为40mL/min，去离子水洗脱，用核酸蛋白仪检测，收集蛋白峰；
[0043] 6、用稀HCl调节粗蛋白液(收集液)的pH值至4.0，静置沉淀脱色，收集上清液；
[0044] 7、将沉淀脱色后收集的上清液以pH值为8.0的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制成上样液，阴离子填料选用DEAE Sepharose FF，用10倍柱体积的pH值为8.0的洗脱液洗脱，收集目标蛋白溶液；所述洗脱液为含有50mmol/L Tris-HCl和0.5mol/L NaCl的水溶液；
[0045] 8、用截留分子量为50KDa的超滤膜组件对阴离子交换层析收集的目标蛋白溶液进行脱盐并浓缩；
[0046] 9、真空冷冻干燥得到重组类人胶原蛋白。
[0047] 经检测，本发明的目的蛋白(重组类人胶原蛋白)的回收率达到60％以上，纯度达到95％以上，利用双缩脲法测定纯化之后胶原蛋白浓度，蛋白表达量可达到5.0g/L。和其它纯化方法相比，本发明工艺简单，蛋白产率、收率及纯度高，且能达到完全脱色的目的，适合于工业化大规模生产重组类人胶原蛋白。
[0048] 图1为本发明发酵液离心后上清液的HPLC检测图，图中目标峰为重组类人胶原蛋白，同时含有杂蛋白(检测柱型号：Shodex Protein KW-802.5，流动相：50mM PBS(pH7.0)+0.3M NaCl，流速：1.0ml/min)。
[0049] 图2为本发明DEAE阴离子层析后洗脱液的HPLC检测图，图中峰为重组类人胶原蛋白，波峰单一，纯度较高(检测柱型号：Shodex ProteinKW-802.5，流动相：50mM PBS(pH7.0)+0.3M NaCl，流速：1.0ml/min)。
[0050] 图3为本发明发酵液纯化前后的SDS-PAGE电泳图，图中M代表蛋白Marker，1为纯化前蛋白，2为纯化后蛋白。
