一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法，包括提取待检样品的DNA，制备成模板，使用上、下游引物和探针进行实时荧光PCR，根据Ct值，确定样品的种类。本方法快速、稳定可靠、灵敏度高，适用于蔗扁蛾不同虫态的检测。该方法为我国的鳞翅目谷蛾科扁蛾属在分子水平上的分类和近缘种的快速鉴定奠定了基础。研究结果可直接应用于进出境植物检疫中蔗扁蛾的检疫鉴定，这对保护我国农林业生产安全及维持生态平衡方面有极为重要的意义。

权利要求

1.一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA，制备模板DNA，-20℃保存备用；

取上游扩增引物ITSTF402：5'-CTCCAACCGCCGCCTCCTCCTCAGT-3'（SEQ ID NO： 1）和下游引物ITSTR596：5'-CCAAGTCGCATCCGTGACGGTTCG-3'（SEQ ID NO： 2）及探针ITS194TM：

5'-FAM-GAACCGCACCCGAGCGCGAGACG-TAMRA-3'、Premix Ex Taq和ddH2O，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系，反应体系的总体积为25μl，各成分组成如下：12.5μl Premix Ex Taq(2×)、上、下游引物各0.75μl，浓度为10pmol/μl，5.5μl的ddH2O，0.5μl的探针，其浓度为10pmol/μl；5μl模板DNA；

PCR反应条件为：95℃ 3min预变性；然后95℃ 10s，60℃ 30s，循环45次；

读取Ct值判断检测结果。

说明书

一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物物种的分子鉴定方法，特别涉及一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法。

背景技术

[0002] 蔗扁蛾Opogona sacchari (Bojer)为我国新增检疫性有害生物，该虫在欧洲地区植物保护组织(EPPO)、亚太地区植物保护组织(APPO)和北美地区植物保护组织(NAPPO)等地区也被列为检疫性昆虫。1997年首次在北京园林植物中发现。该虫寄主广泛，已报道的有24科46种；可危害香蕉、甘蔗、巴西木Dracaena fragrana (L.)、发财树Pachira macrocarpa 等园林植物。据报道，蔗扁蛾最早在毛里求斯发现，然后其附近的马达加斯加及北部的塞舌尔群岛相继发现该虫。不久，该虫又传入南非。1928年，大西洋上的加纳利(Canary)群岛开始出现蔗扁蛾，1972年传入荷兰, 1974年传入英国和意大利。1975年在南美首次发现蔗扁蛾，并在巴西的圣保罗定殖。20世纪80年代末，蔗扁蛾在北美有分布报道，目前在美国的佛罗里达州和夏威夷群岛已有分布。此外，日本和印度也相继发现该虫。说明该虫的适生范围广，定殖能力强。

[0003] 扁蛾属(Opogona Zeller, 1853)与其近缘种类在外形上很类似，单纯依靠外部形态对其进行种类鉴定比较困难。依靠形态学鉴定要求检验人员需具备非常专业的技术，而一线检验鉴定人员大部分不具备这样的技术要求。此外，形态学鉴定对虫态的要求比较高，这无形中也增加了其检疫难度。

[0004] CN 101787394A公开了通过扩增蔗扁蛾线粒体基因组中的COI基因，并将其导入E.coli 中克隆纯化，之后筛选得到高效表达蔗扁蛾的特征、蔗扁蛾复合种的种间差异的基因或基因片段，设计蔗扁蛾特异性引物CF720和CR1113，通过判断扩增特异性片断的存在情况确定检疫结果。这种方法操作难度大，很难获得足够的COI基因，后续的分析也会耗费大量的时间。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法。

[0006] 本发明所采取的技术方案是：

[0007] 一种基于ITS基因的蔗扁蛾实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

[0008] 取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA，制备模板DNA，-20℃保存备用；

[0009] 取上游扩增引物ITSTF402：5'-CTCCAACCGCCGCCTCCTCCTCAGT-3'和下游引物ITSTR596：5'-CCAAGTCGCATCCGTGACGGTTCG-3'及探针ITS194TM：5'-FAM-GAACCGCACCCGAGCGCGAGACG-TAMRA-3'、Premix Ex Taq和ddH2O，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系，反应体系的总体积为25μl，各成分组成如下：12.5μl Premix Ex Taq(2×)、上、下游引物各0.75μl，浓度为10pmol/μl，5.5μl的ddH2O，0.5μl的探针，其浓度为10pmol/μl；5μl模板DNA；

[0010] PCR反应条件为：95℃ 3min预变性，95℃10s，60℃ 30s，循环45次；

[0011] 读取Ct值判断检测结果。

[0012] 本发明方法，克服了传统形态学检测的局限，实现了对蔗扁蛾的快速、准确和稳定的检测。同时，本发明的检出限低，可以检出0.1pg/μl浓度的样品，可以更为准确地检测出样品蔗扁蛾的种类。本发明方法，还可以用于扁蛾属的分类和近缘种的快速鉴定，适用于不同虫态的检测。有助于保护我国农林生产安全、维持生态平衡，保证公共卫生安全。

附图说明

[0013] 图1是不同样品的实时荧光PCR检测图。

具体实施方式

[0014] 编码核糖体RNA的基因(rDNA)是真核生物中最为保守的结构基因，它以衔接重复的方式排列，每一个重复包括三个编码区(分别编码18S，5.8S和28S RNA基因)，编码区之间被两个ITS（Internal Transcribed Spacers）所分隔，重复之间分别被一个ETS（External Transcribed Spacer）和一个IGS（Integenic Spacer）所分隔，由于rDNA在基因组内有数百个拷贝（增加了检测的灵敏度）和ITS及IGS区域在种内的稳定性及种间的差异，使其成为许多生物遗传变异研究的重要对象，也是近年来昆虫遗传变异、系统进化及分子鉴定研究中的一个热点，已有的研究表明：许多昆虫同一类群不同种的ITS区域在碱基序列的长度上高度保守，并无明显的差异，而核苷酸序列的却具有高度变异性，是非常理想的昆虫分子标记基因。

[0015] 本申请通过实验克隆鉴定了蔗扁蛾O. sacchari的两个地理种群, 及其4个近缘种类O. thiadelpha, O. arista, O. vica, O. nigerovena和1个近缘属的种 Wegneria cerodelta 的ITS序列，用于对扁蛾属种间遗传差异进行研究，结果显示ITS序列在扁蛾属种内高度保守，种间又有一定程度的变异，是比较好的研究扁蛾属不同种间系统发育关系的标记基因。

[0016] 引物的优劣、反应体系、反应条件对检测结果有着直接的影响。

[0017] 下面结合实施例，进一步说明本发明。

[0018] 取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA，制备模板DNA，-20℃保存备用；

[0019] 建立PCR反应体系：

[0020] 取特异性扩增引物及特异性探针ITS TF402、ITS TR596和ITS 194 TM；Takara (大连宝生物) Premix Ex Taq (2×)和ddH2O，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系；其中所述上游引物ITS TF402、下游引物ITS TR596和引物探针ITS 194 TM的核苷酸序列分别为：

[0021] 上游引物ITS TF402：5'-CTCCAACCGCCGCCTCCTCCTCAGT-3'；（SEQ ID NO： 1）[0022] 下游引物ITS TR596：5'-CCAAGTCGCATCCGTGACGGTTCG-3'；（SEQ ID NO： 2）[0023] 引物探针ITS 194 TM：5'-FAM-GAACCGCACCCGAGCGCGAGACG-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；

[0024] 进行PCR扩增，实时荧光PCR反应条件为：95℃ 3min预变性；然后95℃ 10s，60℃30s，循环45次；

[0025] 荧光PCR仪读取Ct值判断检测的结果。

[0026] 上述PCR反应体系的反应总体积为25 μl，各成分组成如下：12.5 μl Takara premix Ex Taq (2×)；上下游引物各0.75 μl (10pmol/ μl)；5.5 μl双蒸水；0.5 μl 探针(10 pmol/ μl)；5μl模板DNA。

[0027] 受试样本编号及来源如下表所示。

[0028]

[0029] 实时荧光PCR体系的建立

[0030] 总体积为25 μl，各成分组成如下：12.5 μl Takara premix Ex Taq (2×)；上、下游引物各0.75 μl (10pmol/ μl)；5.5 μl双蒸水；0.5 μl 探针(10 pmol/ μl)；5 μl模板DNA。

[0031] PCR反应条件是：95 ℃ 3 min预变性；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环45次。

[0032] 其中，上游引物为ITS TF402：5'-CTCCAACCGCCGCCTCCTCCTCAGT-3'（SEQ ID NO：1）；下游引物ITS TR596：5'-CCAAGTCGCATCCGTGACGGTTCG-3'（SEQ ID NO： 2）；引物探针ITS 194 TM：5'-FAM-GAACCGCACCCGAGCGCGAGACG-TAMRA-3'。

[0033] 对所有供试样本进行实时荧光PCR反应，以检测ITS TF402/ ITS TR596/ITS 194 TM的特异性。结果如图1所示，图中，基线上方分别为1-2: O. sacchari；基线下方分别为3: O. thiadelpha ；4: O. arista；5: O. vica ；6: O. nigerovena；7-8: Wegneria cerodelta ；9: ddH2O。

[0034] 由图1可知，蔗扁蛾的2个不同地理种群样本都出现了荧光扩增信号，Ct值大约在18个循环左右，但是其近缘种O. thiadelpha; O. arista; O. vica; O. nigerovena; Wegneria cerodelta 等样品都没有荧光扩增信号，表明该方法能够对蔗扁蛾可进行特异性扩增。

[0035] 由上述实验可知，本方法是一种快速、稳定可靠、灵敏度高的蔗扁蛾快速分子鉴定方法，适用于蔗扁蛾不同虫态的检测。该方法为我国的鳞翅目谷蛾科扁蛾属在分子水平上的分类和近缘种的快速鉴定奠定了基础。研究结果可直接应用于进出境植物检疫中蔗扁蛾的检疫鉴定，这对保护我国农林业生产安全及维持生态平衡方面有极为重要的意义。