一种复合益生菌喷施剂的制备方法

摘要

本发明涉及的是微生物领域，具体的说是一种复合益生菌喷施剂的制备方法。按重量百分比1％-4％的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，而后混合按照重量百分比3％-4％接种于液体发酵培养基中，最后在温度25-37℃下，发酵培养48-72h。本发明叶面喷施剂可延长蔬菜生长期、提高蔬菜产量、品味，蔬菜产量可以提高5.5-10.0％；延长花卉观赏期，花卉观赏期可以延长8-10天。

权利要求

1.一种复合益生菌喷施剂的制备方法，其特征在于：

1）复合菌种的增殖培养：将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比1%-4%的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期；

2）复合微生物的发酵物：将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3%-4%接种于液体发酵培养基中，在25-37℃下，发酵培养48-72h，所得发酵物再分别与上述培养至对数生长期的慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合得复合微生物的发酵物，混合比例为共同发酵物占40％，每单一培养细菌分别占10％；

3）喷施剂：将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。

2.按权利要求1所述的复合益生菌喷施剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中各菌种的培养基分别为：产朊假丝酵母的培养基：马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水加至1000mL，

121℃高压灭菌20分钟；

乳酸链球菌的培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾

0.2%，乙酸钠0.5%，柠檬酸铵0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，琼脂1.5-2%，pH6.5，

121℃高压灭菌20分钟；

嗜酸乳杆菌的培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾

0.2%，乙酸钠0.5%，柠檬酸铵0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，琼脂1.5-2%，pH6.5，

121℃高压灭菌20分钟；

枯草芽孢杆菌的培养基：蛋白胨10g，琼脂20g，氯化钠5g，肉浸粉10g，水加至1000mL，pH7.2，121℃高压灭菌20分钟；

生脂固氮螺菌的培养基：甘露醇10g，酵母膏1g，K2HPO40.15g，NaCl0.11g，Rh溶液4mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.0；121°C高压灭菌20分钟；所述Rh溶液为NaMoO45g，H3BO45g，蒸馏水1000mL，pH3.0；

巨大芽孢杆菌的培养基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠（NaCl）5g，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2；121℃高压灭菌20分钟；

慢生大豆根瘤菌培养基：甘露醇10g、K2HPO40.5g、酵母粉0.4g、MgSO4·7H2O0.2g、NaCl0.1g、CaCl2·6H2O0.1g、蒸馏水1000mL、pH6.8-7.0，121℃高压灭菌20分钟；

沼泽红假单孢菌培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.3％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.03％，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0；121℃高压灭菌20分钟;胶质芽孢杆菌培养基：蔗糖10g，酵母膏0.2g，(NH4)2SO40.5g，MgSO40.1g，KCl0.1g，Na2HPO40.1g，CaCO31.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0,121℃高压灭菌20分钟;圆 褐 固 氮 菌 培 养 基 :葡 萄 糖 10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g，CaSO4·7H2O0.2g，CaCO35.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，113℃灭菌30分钟。

3.按权利要求1所述的复合益生菌喷施剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中的液体发酵培养基为葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％。

说明书

一种复合益生菌喷施剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及的是微生物领域，具体的说是一种复合益生菌喷施剂的制备方法。

背景技术

[0002] 微生物叶面肥是微生物肥料的一种，是喷施于植物表面的含有活微生物的特定制品，使用的目的在于增加肥料来源、调节植物体环境微生物平衡、改善植物体营养代谢水平，促进植物的生长，提高抗病虫害的能力。随着人们对可用作微生物肥料的微生物种类的逐渐探明，固氮菌、芽孢杆菌、光合细菌以及纤维分解菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌等多种微生物均可用作开发微生物肥料。并且，不同微生物种类在作为微生物肥料的促生长机理不同，功能也有所差异，因此，探讨复合菌群用作微生物肥料是有效的解决途径。

[0003] 但是，在复合微生物的生产过程中，由于菌种复杂，条件限制因素多，因此，开发安全有效的生产方法是解决复合微生物生产的重要研究课题。本发明针对上述问题，基于目前有关生物肥料的有效微生物研究结果，开发了多种功能性微生物复合组合的针对性生产方法，解决复合微生物肥料生产困难的问题。其产品具有功能效果稳定、全面的特性，生产方法具有成本低、效果好、可操作性强的特定。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种复合益生菌喷施剂的制备方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0006] 一种复合益生菌喷施剂的制备方法：

[0007] 1)复合菌种的增值培养：将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比1％-4％的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。

[0008] 2)复合微生物的发酵物：将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3％-4％接种于液体发酵培养基中，在25-37℃下，发酵培养48-72h，所得发酵物再与分别上述培养至对数生长期的慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合得复合微生物的发酵物，混合比例为共同发酵物占40％，每单一培养细菌分别占10％；

[0009] 3)喷施剂：将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。

[0010] 所述步骤1)中各菌种的培养基分别为：

[0011] 产朊假丝酵母的培养基：马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水加至1000mL，121℃高压灭菌20分钟；

[0012] 乳酸链球菌的培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸铵0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，琼脂1.5-2％，pH6.5。121℃高压灭菌20分钟；

[0013] 嗜酸乳杆菌的培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸铵0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，琼脂1.5-2％，pH6.5。121℃高压灭菌20分钟；

[0014] 枯草芽孢杆菌的培养基：蛋白胨10g，琼脂20g，氯化钠5g，肉浸粉10g，水加至1000mL，pH7.2。121℃高压灭菌20分钟；

[0015] 生脂固氮螺菌的培养基：甘露醇10g，酵母膏1g，K2HPO4 0.15g，NaCl0.11g，Rh溶液4ml，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.0；

[0016] 巨大芽孢杆菌的培养基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠(NaCl)5g，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2；

[0017] 慢生大豆根瘤菌培养基：甘露醇10g、K2HPO4 0.5g、酵母粉0.4g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.1g、CaCl2·6H2O 0.1g、蒸馏水1000mL、pH6.8-7.0。121℃高压灭菌20分钟。

[0018] 沼泽红假单孢菌培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.3％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.03％，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0；121℃高压灭菌20分钟。

[0019] 胶质芽孢杆菌培养基：蔗糖10g，酵母膏0.2g，(NH4)SO4 0.5g，MgSO4 0.1g，KCl0.1g，Na2HPO4 0.1g，CaCO3 1.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。121℃高压灭菌20分钟；

[0020] 圆褐固氮菌培养基：葡萄糖10g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·7H2O 0.2g，CaCO3 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，113℃灭菌30分钟。

[0021] 所述Rh溶液为NaMoO45g，H3BO45g，蒸馏水1000mL，pH3.0。所述步骤2)中的液体发酵培养基为葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％。

[0022] 上述菌株均购自中国农业微生物菌种保藏中心，其产朊假丝酵母于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC20060；乳酸链球菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10653；嗜酸乳杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC6005；枯草芽孢杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC20037；慢生大豆根瘤菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC15402；生脂固氮螺菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10481；沼泽红假单孢菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10649；巨大芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC02991；胶质芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC02983；圆褐固氮菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10098。

[0023] 本发明所具有的优点：

[0024] 1.本发明叶面喷施剂采用复合微生物肥料的菌种复合组合，该组合可协调发挥促生长作用，具有功能互补性；

[0025] 2.本发明叶面喷施剂有利于发酵，pH值在4.5-7.5之间，活微生物数量在30亿/mL以上，微生物活力稳定；

[0026] 3.本发明叶面喷施剂的效果良好，效果试验表明，可提高蔬菜的品味、产量，其产量可以提高5.0％-10.0％；同时可延长花卉的观赏期和草坪绿期8-10天。

具体实施方式

[0027] 实施例1

[0028] 1)复合菌种的增值培养：将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比3％的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。

[0029] 2)复合微生物的发酵物：将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌按体积比1∶1∶1∶1混合，而后将混合后菌种按照重量百分比4％接种于液体发酵培养基中，在30℃下，发酵培养70h，发酵物pH值为4.5-7.5，每毫升培养基中的有益菌总量达到30亿以上，其中液体发酵培养基为葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，余量为蒸馏水，然后将发酵产物分别与慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌和巨大芽孢杆菌混合，发酵产物占40％、慢生大豆根瘤菌占10％、生脂固氮螺菌占10％、沼泽红假单孢菌占10％、巨大芽孢杆菌占10％、胶质芽孢杆菌占10％和圆褐固氮菌占10％，混合后得到复合微生物的发酵物。

[0030] 上述菌株均可分别按照常规方法培养，本实施例给出的知识众多培养条件中的一种，分别为：

[0031] 产朊假丝酵母的培养基：马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水加至1000mL，121℃高压灭菌20分钟。产朊假丝酵母增殖培养条件28℃培养24-48h。

[0032] 乳酸链球菌的培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸铵0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，琼脂1.5-2％，pH6.5。121℃高压灭菌20分钟。乳酸链球菌增殖培养条件30℃培养48-72h。

[0033] 嗜酸乳杆菌的培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸铵0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，琼脂1.5-2％，pH6.5。121℃高压灭菌20分钟。嗜酸乳杆菌增殖培养条件37℃培养48-72h。

[0034] 枯草芽孢杆菌的培养基：蛋白胨10g，琼脂20g，氯化钠5g，肉浸粉10g，水加至1000mL，pH7.2。121℃高压灭菌20分钟。枯草芽孢杆菌增殖培养条件30℃培养48-72h。

[0035] 慢生 大豆 根瘤菌 的培 养基：甘 露醇10g、K2HPO4 0.5g、酵母粉 0.4g、MgSO4·7H2O0.2g、NaCl0.1g、CaCl2·6H2O0.1g、蒸馏水1000mL、pH6.8-7.0。121℃高压灭菌20分钟。慢生大豆根瘤菌增殖培养条件28℃培养48-72h。

[0036] 生脂固氮螺菌的培养基：蔗糖10g，K2HPO4 0.5g，NaCl0.1g，酵母膏1g，柠檬酸铁(1％)1mL，CaSO40.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4(1％)1mL，NaMoO4(1％)1mL，硼酸(1％)1mL，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0；121℃高压灭菌20分钟。生脂固氮螺菌增殖培养条件在25-30℃条件下，培养48-72h。

[0037] 嗜沼泽红假单孢菌的培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.3％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.03％，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0；121℃高压灭菌20分钟。嗜沼泽红假单孢菌增殖培养条件在30℃条件下，培养72-96h。

[0038] 巨大芽孢杆菌的培养基：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，蒸馏水1000mL，pH7.0；121℃高压灭菌20分钟。巨大芽孢杆菌增殖培养条件在30℃条件下，培养
24-48h。

[0039] 胶质芽孢杆菌培养基：蔗糖10g，酵母膏0.2g，(NH4)SO4 0.5g，MgSO4 0.1g，KCl0.1g，Na2HPO4 0.1g，CaCO3 1.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。121℃高压灭菌20分钟；增殖培养条件在32-36℃条件下，培养20-40h。

[0040] 圆褐固氮菌培养基：葡萄糖10g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g，CaSO4·7H2O0.2g，CaCO3 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，113℃灭菌30分钟。增殖培养条件在28-36℃条件下，培养24-48h。

[0041] 上述菌株均购自中国农业微生物菌种保藏中心，其产朊假丝酵母于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC20060；乳酸链球菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10653；嗜酸乳杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC6005；枯草芽孢杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC20037；慢生大豆根瘤菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC15402；生脂固氮螺菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10481；沼泽红假单孢菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10649；巨大芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC02991；胶质芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC02983；圆褐固氮菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10098。

[0042] 3)喷施剂：将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。

[0043] 使用方法：将所述喷施剂按1∶1000水稀释后，喷施于植物叶片上。

[0044] 试验材料：温室内栽培的番茄，按照常规管理。

[0045] 试验设计：试验设计对照组和微生物叶面喷施剂施用组(用量为1.5mL/m2，水稀2
释1000倍)，每个处理组4个重复，每个重复15m。

[0046] 产量测定：测定试验期内采收的可上市番茄总重量。

[0047] 试验结果：对照组的番茄产量为5.3kg/m2，喷施组为6.2kg/m2，产量提高了16.9％。

[0048] 实施例2

[0049] 1)复合菌种的增值培养：将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比1％的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。

[0050] 2)复合微生物的发酵物：将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3％接种于液体发酵培养基中，在25℃下，发酵培养72h，所得发酵物再与分别上述培养至对数生长期的慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合得复合微生物的发酵物，混合比例为共同发酵物占40％，每单一培养细菌分别占10％；

[0051] 3)喷施剂：将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。

[0052] 实施例2

[0053] 1)复合菌种的增值培养：将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比2％的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。

[0054] 2)复合微生物的发酵物：将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3％接种于液体发酵培养