一种阿维菌素产生菌及其制备方法

摘要

本发明公开了一种阿维菌素产生菌及其制备方法，该菌株保藏名称为FT26-9，保藏编号CGMCC No.4341，保藏日期2010年11月12日。其制备方法为对出发菌株进行紫外线复合氯化锂诱变处理；诱变株的筛选；亚硝基胍诱变、筛选；硫酸二乙酯诱变、筛选；羟胺诱变、筛选；5-溴尿嘧啶复合紫外线诱变、筛选；最终获得FT26-9菌株，该菌株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B组分，减少阿维菌素A组分；其应用于阿维菌素工业生产中可提高发酵单位40％左右，降低生产成本35％左右。

权利要求

1.一种阿维菌素产生菌(streptomyces avermitilis)FT26-9，其特征在于所述菌的保藏编号为CGMCC No.4341，保藏日期2010年11月12日，保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

说明书

一种阿维菌素产生菌及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及阿维菌素产生菌及其制备方法，具体地说是阿维菌素产生菌的变异株及其制备方法。技术背景

[0002] 阿维菌素(avermectin，AVM)是一类由除虫链霉菌(streptomycesavermitilis)经液体发酵产生的一类大环内酯类抗生素，是一种全新的无公害生物农兽药，其具有高效低毒与环境友好的特点，对蔬菜、果树、棉花、水稻等多种作物的相关害虫有良好防效，是目前世界上最有前途的生物杀虫杀螨剂。目前除虫链霉菌发酵产生的阿维菌素中包括有结构类似的8种组分(AVMA1aAVMA1b AVMA2a AVMA2b AVMB1a AVMB1b AVMB2a AVMB2b)。其中B组分的生物活性优于A组分，尤以B1a活性最强。因此如何减低工业发酵产物中的A组分、提高B1a组分已成为人们研究的重点。例如，天津大学化工学院制药工程系李燕霞等人利用紫外线、亚硝基胍并结合L-异亮氨酸诱变手段对除虫链霉菌进行诱变处理，获得了可显著提高B1a组分产量的菌株，发酵单位比出发菌株提高12.86％(工业微生物2008年第38卷第一期)。CN200410009639.2公开了一种利用紫外线和亚硝基胍诱变筛选得到阿维菌素高产菌株的方法；CN200610149617.5公开了一株仅产生B1a和B2a的新菌株；但上述技术方案的生产水平仍有待进一步提高。

发明内容

[0003] 本发明的目的之一就是要提供一种新的阿维菌素产生菌，以大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分。

[0004] 本发明的第二个目的就是要提供该菌株的制备方法。

[0005] 本发明所提供的阿维菌素产生菌(streptomyces avermitilis)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏名称为FT26-9，保藏编号CGMCC No.4341，保藏日期2010年11月12日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心建议的分类命名为除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)。

[0006] 本发明菌株(以下简称FT26-9)是发明人通过对阿维链霉菌MF800-6(以下简称初始出发菌株)经过紫外线复合氯化锂、亚硝基胍、羟胺、5-溴尿嘧啶诱变剂的依次诱变，然后再对诱变株进行筛选获得。该菌株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B组分，减少阿维菌素A组分；其应用于阿维菌素工业生产中可提高发酵单位40％左右，降低生产成本35％左右。

[0007] 本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下：

[0008] 菌落颜色：灰褐色。

[0009] 黑色好氧生长：生长。

[0010] 菌体大小/mm：2～6mm。

[0011] 适宜生长温度：27.0-28.5℃。

[0012] 适宜生长pH：6.0-7.5。

[0013] 菌体外表：菌落呈圆形，有褶皱，无光泽，边沿整齐。

[0014] 革兰氏染色：阳性。

[0015] 光吸收峰/nm：245nm。

[0016] 本发明所提供的阿维菌素产生菌的制备方法，它包括以下步骤：

[0017] a、紫外线复合氯化锂诱变处理：

[0018] (1)孢子悬浮液制备：将普通阿维菌素产生菌的孢子制成孢子悬液，调整孢子浓6
度为10 个/毫升，于波长253.7nm，进行紫外线诱变；

[0019] (2)诱变处理：将紫外线诱变后孢子悬液系列稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、-6 -710 、10 ，取0.1毫升各浓度的稀释液，涂在含氯化锂的平板培养基上，28±0.5℃培养7-9天。

[0020] b、诱变株的筛选：

[0021] 将诱变后培养的单菌落转接至斜面培养基中，并对应点种到另一培养皿培养基上，28±0.5℃培养7天后，取单菌落菌块，用甲醇浸泡18～24小时，震荡后，测定各菌株浸取液的效价，留取10％的高效价菌株，用摇瓶发酵法进行复筛，最终挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株I；

[0022] c、亚硝基胍诱变、筛选：

[0023] (1)孢子悬浮液制备：在含有磷酸缓冲液的新鲜试管斜面内，将上述出发菌株I的6
孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10 个/毫升，过滤，除去大部分菌丝及培养基；

[0024] (2)诱变处理：将上述孢子悬浮液加入亚硝基胍母液，使亚硝基胍含量为1.0mg/ml，充分混匀后，于28±0.5℃，220rpm振荡处理40-60分钟；诱变处理完毕后，终止亚硝基胍诱变，分别吸取0.1ml不同浓度的稀释液涂平板，28±0.5℃培养7-10天；

[0025] (3)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株II；

[0026] d、硫酸二乙酯诱变、筛选：

[0027] (1)孢子悬浮液制备：在含有磷酸缓冲液的新鲜试管斜面内，用上述出发菌株II6
的孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10 个/毫升，过滤，除去大部分菌丝及培养基；

[0028] (2)诱变处理：将上述孢子悬浮液与硫酸二乙酯充分混合，使硫酸二乙酯含量为1mg/100ml，于28±0.5℃，震荡处理，诱变处理完毕后，终止硫代硫酸钠诱变；分别吸取0.1ml不同浓度的稀释液涂平板，28±0.5℃培养7-10天；

[0029] (3)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株III。

[0030] e、羟胺诱变、筛选

[0031] (1)孢子悬液的制备：取15毫升已灭菌的ph为7.0磷酸缓冲液，倒入一支培养好6
的III菌株试管斜面内，做成孢子浓度为10 个/毫升的悬浮液。

[0032] (2)诱变处理：将制备好的孢子悬液进行梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、-710 ，取0.1ml各浓度稀释液，涂在已制备好的含有羟胺的平板上，28±0.5℃倒置培养7-9天。

[0033] (3)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株IV；

[0034] f、5-溴尿嘧啶复合紫外线诱变、筛选：

[0035] (1)孢子悬浮液制备：将出发菌株IV孢子刮下制成孢子悬液，调整孢子浓度为106个/ml，过滤，除去大部分菌丝及培养基；

[0036] (2)诱变处理：孢子悬液中加入5-溴尿嘧啶，使5-溴尿嘧啶含量为1.0-1.5mg/ml，于28±0.5℃，转速220rpm条件下处理5-8小时；将诱变处理过的孢子悬液紫外线照射35-60秒。

[0037] (3)分别吸取处理液进行梯度稀释，吸取0.1ml各浓度稀释液涂平板，在28±0.5℃培养7-9天。

[0038] (4)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，最终获得FT26-9菌株。

[0039] 本发明方法制备的菌株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B组分，减少阿维菌素A组分，且其传代稳定好，菌株连续传代15次后，其生长速度、革兰氏染色结果、菌体形态大小、活菌体光谱吸收峰都无明显变化，表明本发明菌株完全符合工业化生产菌种需要。

[0040] 本发明方法中所用的培养基的配方及制备方法如下：

[0041] 单菌落培养基的配方组成及配制(也是阿维菌素常规培养基)。

[0042] 配方(W/V)：牛肉膏0.1-0.3％、酵母膏0.2-0.5％、蛋白胨0.5-1.0％、葡萄糖0.5-0.8％、硫酸亚铁0.001％(配成0.1％母液按比例加入，用时现配)、琼脂粉2.0-2.5％、余量为蒸馏水。pH 7.2-7.5，培养5-8天。

[0043] 单菌落培养基优选的配方为(为便于表述，以下简称1号培养基)：

[0044] 牛肉粉(膏)0.1％、酵母膏0.2％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.56％、琼脂粉2.5％、硫酸亚铁0.001％，余量为水。

[0045] 制备方法：按照上述配方称取葡萄糖、牛肉粉(膏)、蛋白胨、酵母膏，用蒸馏水溶解并充分混匀，加入硫酸亚铁1mL/100mL(提前配制为0.1％的溶液)，用蒸馏水定容至配料体积，用10％的稀盐酸或20％的氢氧化钠溶液调节pH至7.2，加入琼脂粉，液化后分装入500mL的三角瓶中，每瓶装300-400ml，塞好棉塞，用脱脂纱布、牛皮纸依次包好，放入高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.1MPa的条件下灭菌30分钟。当温度降至50℃～60℃时，将培养基以无菌操作方式倒入同样灭菌条件灭过菌的培养皿中20ml～25ml的培养基，平放在工作台上，待其冷却凝固后备用

[0046] 斜面菌种培养基的配方组成及配制方法：

[0047] 配方(W/V)：牛肉膏0.3-0.5％、蛋白胨0.2-0.5％、葡萄糖1.5-2.0％、氯化钴0.001-0.003％、硫酸镁0.15-0.025％、磷酸二氢钾0.3-0.5％、天门冬酰胺0.05-0.07％、琼脂2.0-2.5％，余量为蒸馏水。pH 7.0-7.4，培养7-10天。

[0048] 斜面菌种培养基优选的配方为(为便于表述，以下简称2号培养基)：

[0049] 牛肉膏0.5％蛋白胨0.2％、葡萄糖1.5％、氯化钴0.003％、硫酸镁0.15％、磷酸二氢钾0.5％、天门冬酰胺0.05％、琼脂2.5％，余量为蒸馏水。pH 7.0-7.4，培养7-10天[0050] 制备方法：按照上述配方称取葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、天门冬酰胺分别用蒸馏水溶解，氯化钴提前配制为3％(g/ml)的溶液，然后充分混匀，用蒸馏水定容至配料体积，用10％的稀盐酸或20％的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，加入琼脂粉，液化后分装到250mL茄瓶中，每瓶70mL～80mL，塞好棉塞，用脱脂纱布、牛皮纸依次包好，放入高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.1MPa的条件下灭菌30分钟。灭菌完毕待培养基温度降至50℃～60℃时，在缓冲间摆好斜面，凝固后放入接种间内备用。

[0051] 种子摇瓶培养基的配方组成及配制方法：

[0052] 配方(W/V)：玉米淀粉2.0-2.5％、黄豆饼粉0.5-1.0％、花生饼粉0.8-1.2％、酵母粉0.5％-1.0％、酵母膏0.4-0.6％、氯化钴0.001％-0.003％，余量为水。

[0053] 种子摇瓶培养基优选的配方为(为便于表述，以下称为3号培养基)：

[0054] 玉米淀粉2.5％、黄豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.4％、氯化钴0.003％，余量为水。

[0055] 制备方法：按照上述配方称取玉米淀粉、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、酵母膏、氯化钴溶液(提前配制为3％(g/ml)的溶液)，向玉米淀粉中加入配料体积80％的自来水，将玉米淀粉液化，然后加入其他成分，准确定容至配料体积。用10％的氢氧化钠或20％的盐酸调PH值至7.2，定量分装到250ml三角瓶中，每瓶35ml，用棉塞塞口，纱布、牛皮纸依次包好，放入灭菌锅内在121℃、0.1MPa的条件下灭菌30min。

[0056] 发酵摇瓶培养基的配方组成及配制方法：

[0057] 配方(W/V)：玉米淀粉13-15％、黄豆饼粉2.5-3.0％、酵母粉1-1.5％、硫酸铵0.025-0.05％、碳酸钙0.05％-1.0％、硫酸锰0.00025％、钼酸钠0.002-0.005％、氯化钴
0.001-0.003％，余量为水。

[0058] 发酵摇瓶培养基优选的配方为(为便于表述，以下称为4号培养基)：

[0059] 玉米淀粉13％、黄豆饼粉2.5％、酵母粉1％、硫酸铵0.025％、碳酸钙0.05％、硫酸锰0.00025％、钼酸钠0.002％、氯化钴0.001％，余量为水。

[0060] 制备方法：按照上述配方称取玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵、碳酸钙、硫酸锰1ml/1000ml(提前配制为0.23％的溶液)、钼酸钠1ml/1000ml(提前配制为2％的溶液)、氯化钴1ml/1000ml(提前配制为2％的溶液)向淀粉中加入配料体积80％倍的自来水、淀粉重量0.05％淀粉酶将淀粉液化，然后加入豆粉、酵母粉、硫酸铵、硫酸锰、氯化钴、钼酸钠，准确定容至配料体积，用10％的氢氧化钠或10％的盐酸调PH值至7.5，再加入碳酸钙，定量分装250ml三角瓶，每瓶40ml(边分装边搅动，防止碳酸钙沉淀)，用棉垫塞口，用牛皮纸包好，放入灭菌锅内在121℃、0.1MPaMPa的条件下灭菌30min。

[0061] 种子罐的培养基的配方组成及配制方法：

[0062] 配比(W/V)：玉米淀粉2.0-2.5％、黄豆饼粉0.5-1.0％、花生饼粉0.8-1.2％、酵母粉0.5％-1.0％、酵母膏0.4-0.6％、氯化钴0.001％-0.003％、余量为水。

[0063] 种子罐的培养基优选的配方为(为便于表述，以下简称5号培养基)：

[0064] 玉米淀粉2.5％、黄豆饼粉0.8％、花生饼粉1％、酵母粉0.5％、酵母膏0.4％、氯化钴0.003％、泡敌，0.02％余量为水。

[0065] 制备方法：按10m3种子罐计为例

[0066] 1按配方核查原材料种类是否齐全，数量是否准确。用输水管向种子罐内注入7m3的自来水，开启搅拌，依次将淀粉、豆饼粉、花生饼粉、酵母膏、泡敌等投入罐内并用高压水枪将罐内及罐口冲洗干净，称量规定量的微量元素Cocl2加入罐内，称量一定量的氢氧化钠加入罐内，调节PH至7.0-7.5。

[0067] 发酵罐培养基(为便于表述，以下简称6号培养基)的配方组成及配制方法：

[0068] 配比(W/V)：玉米淀粉12-15％、黄豆饼粉2.5-3.0％、酵母粉1-1.5％、硫酸铵0.025-0.035％、碳酸钙0.05-1.5％、硫酸锰0.0002-0.0003％、钼酸钠0.002-0.005％、氯化钴0.002-0.003％、泡敌0.02-0.06％，余量为水。

[0069] 发酵罐培养基优选的配方为(为便于表述，以下简称6号培养基)：

[0070] 配比(W/V)：

[0071] 玉米淀粉14％、黄豆饼粉2.5％、酵母粉1.2％、硫酸铵0.025％、碳酸钙0.05％、硫酸锰0.0002％、钼酸钠0.002％、氯化钴0.001-％、泡敌0.05％，余量为水。

[0072] 制备方法：

[0073] 向投料池内注入4-5m3水，并开启搅拌，按以上配方分别将玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、泡敌等原料倒入投料池内，搅拌成浆液，用泵打至指定发酵罐内，按配方准确称取硫酸铵、硫酸锰、钼酸钠、氯化钴等微量元素，直接从发酵罐接种口加入罐内，向发酵罐内补加清水至定容体积，称量一定量的氢氧化钠加入罐内，调节PH至7.3-7.8。

附图说明

[0074] 图1是初始出发菌株(MF800-6)代谢产物液相色谱分析图谱，图中所表示的数据参数详见表1。

[0075] 图2是FT26-9菌株代谢产物液相色谱分析图谱，图中所表示的数据参数详见表2。

[0076] 图3是本发明菌株的菌种制备的流程示意图。

具体实施方式

[0077] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步的详述。

[0078] 实施例1

[0079] 以现有生产阿维菌素的阿维链霉菌(简称MF800-6)为初始出发菌株，按照图3所示流程及以下方法步骤进行：

[0080] a、紫外线复合氯化锂诱变处理：

[0081] (1)孢子悬浮液制备：取15毫升已灭菌的生理盐水，倒入一支培养好的新鲜试管斜面内(培养基为1号培养基)，用无菌接种针轻轻将MF800-6孢子刮下做成孢子悬液，用6
血球计数板计数，调整孢子浓度为10 个/毫升。取10ml孢子悬浮液于φ90无菌培养皿，并加入磁棒，置于紫外诱变箱磁力搅拌器上，于波长253.7nm，功率30W的紫外灯20厘米处将制备好的孢子悬液进行紫外线诱变，照射时打开皿盖、磁力搅拌，边照射边搅拌，照射时-1 -2 -3 -4 -5
间30-60秒。(2)诱变处理：将紫外线诱变后孢子悬液系列稀释为10 、10 、10 、10 、10 、-6 -7
10 、10 ，取0.1毫升各浓度的稀释液，涂在已制备好的含氯化锂的平板培养基上，用涂布器刮均匀，28±0.5℃培养7-9天。

[0082] 注：氯化锂平板的制备：用1号培养基作平板，准确称取氯化锂，用少量水溶解，当灭菌后的培养基温度降至60-70℃时，将氯化锂用微孔滤膜过滤加入，至氯化锂的浓度为0.15％，倒平板，冷凝后备用。

[0083] b、诱变株的筛选

[0084] 将诱变后培养的单菌落编号，转接至2号培养基中，并用灭过菌的牙签对应点种到另一培养皿培养基上，28±0.5℃培养7天后，用直径略大于单菌落直径的打孔器打出菌块，用甲醇浸泡24小时并震荡1分钟，用液相色谱法测定各菌株浸取液的效价，淘汰90％的低效价菌株。相对应的较高效价菌株对应的斜面用摇瓶发酵法进行复筛，用液相色谱测定发酵液的B1a效价及总效价，经过如此初筛、复筛和最后终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株(为表述方便，该出发菌株简称菌株I)。

[0085] c、亚硝基胍诱变、筛选：

[0086] (1)孢子悬浮液制备：取15毫升已灭菌的pH 6.0磷酸缓冲液，倒入一支培养好的新鲜试管斜面内，用无菌接种针轻轻将a菌株I的孢子刮下做成孢子悬液，用血球计数板计6
数，调整孢子浓度为10 个/毫升。过滤，除去大部分菌丝及培养基。

[0087] (2)诱变处理：取2.70ml已制备好的孢子悬浮液加入0.3ml亚硝基胍母液，使亚硝基胍终浓度为1.0mg/ml，充分混匀后，于28±0.5℃，220rpm振荡处理40-60分钟。诱变处理完毕后，立即取1毫升处理液进行大量稀释终止亚硝基胍的诱变作用，吸取处理液进-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7行系列稀释10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 ，将每个梯度浓度的稀释液，分别吸取0.1ml涂平板并用涂布器刮均匀，放置在28±0.5℃培养箱中培养培养7-10天。

[0088] 注：亚硝基胍母液制备：精确称取4mg亚硝基胍，加入2-3滴丙酮(或甲酰胺)溶液，于水浴中充分溶解后，加磷酸缓冲液制成10mg/ml的亚硝基胍母液。

[0089] (3)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株，(为表述方便，该出发菌株简称菌株II)。

[0090] d、硫酸二乙酯诱变、筛选：

[0091] (1)孢子悬浮液制备：取20毫升已灭菌的pH 7.0磷酸缓冲液，倒入一支培养好的新鲜试管斜面内，用无菌接种针轻轻将菌株II的孢子刮下做成孢子悬液，用血球计数板计6
数，调整孢子浓度为10 个/毫升。过滤，除去大部分菌丝及培养基。

[0092] (2)诱变处理：吸取16ml pH 7.0磷酸缓冲液、4ml孢子悬浮液、0.2ml硫酸二乙酯充分混合，使硫酸二乙酯终浓度为1％，于28±0.5℃，转速220rpm条件下震荡处理30-60分钟，结束后取1毫升处理液加入0.5毫升硫代硫酸钠溶液终止反应。吸取1毫升处理液-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7进行梯度稀释10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 ，吸取0.1ml各浓度稀释液涂平板并用涂布器涂匀，28±0.5℃培养7-10天。

[0093] (3)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株，(为表述方便，该出发菌株简称菌株III)。

[0094] e、羟胺诱变、筛选

[0095] (1)孢子悬液的制备：取15毫升已灭菌的ph为7.0磷酸缓冲液，倒入一支培养好的III菌株试管斜面内，用无菌接种针轻轻将孢子刮下做成孢子悬液，用血球计数板计数，6
调整孢子浓度为10 个/毫升。过滤，除去大部分菌丝及培养基。

[0096] (2)诱变处理：将制备好的孢子悬液进行梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、-710 ，取0.1ml各浓度稀释液，涂在已制备好的含有羟胺的平板上，28±0.5℃培养7-9天。

[0097] 注：含有羟胺平板的制备：待灭菌后的单菌落培养基温度降至60-70℃时加入适量羟胺，使羟胺浓度为0.01％-0.015％(g/ml)，摇匀，倒平板，冷凝后备用。

[0098] (3)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株，(为表述方便，该出发菌株简称菌株IV)。

[0099] f、5-溴尿嘧啶复合紫外线诱变、筛选：

[0100] (1)孢子悬浮液制备：将菌株IV的孢子刮下做成孢子悬液，用15ml生理盐水做成6
菌悬液，孢子浓度为10 个/ml，过滤，除去大部分菌丝及培养基。

[0101] (2)诱变处理：孢子悬液中加入5-溴尿嘧啶，使5-溴尿嘧啶含量为1.0-1.5mg/ml，于28±0.5℃，转速220rpm条件下处理5小时；将经5-溴尿嘧啶诱变处理过的孢子悬液在波长253.7nm，功率30W的紫外灯下20厘米处进行紫外线诱变，照射时打开皿盖、开磁力搅拌，边照射边搅拌，进行紫外诱变处理，照射时间45秒。

[0102] 5.3.3、分别吸取处理液进行梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，吸取0.1ml各浓度稀释液涂平板并用涂布器刮匀，28±0.5℃培养7-9天。

[0103] (3)筛选：按照b步方法对诱变株进行筛选，最终获得FT26-9菌株。

[0104] 所得FT26-9菌株经效价检测，该菌株发酵产物中的B1a效价(摇瓶发酵)达到9000ug/ml左右，与现有的普通阿维菌素生产菌相比较，B1a的含量提高了50％左右，B2a的含量提高了80-90％；无效组分A1a、A2a分别降低90-94％和90-94％的突变株。与已在专利文献中CN200410009639.2公开的菌株AVHF-66相比BIa效价提高72％。

[0105] 实施例2摇瓶发酵法复筛高效价菌株

[0106] a、摇瓶菌种的制备

[0107] 按照3号培养基的配比及配置过程配制种子摇瓶培养基，取培养好的高效价菌3
株斜面上1cm 左右菌块，无菌操作接种于种子摇瓶内，用棉塞封口，2层纱布包好后放入
200-220r/min摇床上，28℃±0.5℃培养40～50小时。

[0108] b、发酵摇瓶制备与接种

[0109] 按照4号培养基的配比及配置过程配制发酵摇瓶培养基，将以上制备好的种子无菌操作向每个发酵摇瓶中移入5-8％的种子液，棉垫封口后，放入200-220r/min摇床上，28℃±0.5℃培养10-11天，放瓶按照实施例5液相色谱测定B1a效价。

[0110] 实施例3种子罐的种子扩大培养

[0111] 孢子悬浮液的制备

[0112] 取1-4瓶FT26-9菌株斜面试管，加入50-100毫升无菌蒸馏水，在超净工作台上用无菌接种针轻轻刮下斜面孢子，塞上接种针头，用12层纱布及牛皮纸包好，放入4℃冰箱备用。

[0113] b、按照5号培养基的配比配制种子培养基，灭菌前用氢氧化钠调pH7.0-7.5，蒸汽灭菌在121℃、0.1MPa的条件下灭菌30min，待温度降至28-30℃时，用压差法将孢子接入种子罐内，密封，培养。培养条件：通气比1∶0.6-1.2、温度28±0.5℃，搅拌转速为150-300rpm.培养至40-60小时，镜检菌丝粗壮分枝多，染色均匀，无杂菌，可转入发酵罐中。

[0114] 实施例4发酵罐培养

[0115] 按照6号培养基的配比配制发酵罐培养基，灭菌前用氢氧化钠调pH7.3-7.8，蒸汽灭菌在121℃、0.1MPa的条件下灭菌30min，待温度降至28-30℃时，将种子罐种子转入发酵罐中进行培养。培养条件：罐压0.03-0.07；通气比1-14小时1∶0.6-1.2、14-放罐1∶0.3-0.6：；温度27-28.5℃，搅拌转速为100rpm左右.周期280-330小时，在菌丝自容pH上升前放罐，过程中每8小时检测B1a效价、总糖、还原糖、pH、菌浓、滤速、镜检杂菌。
发酵结束后升温放罐，进入提取过程。

[0116] 实施例5

[0117] 不同阿维菌素产生菌发酵液中阿维菌素B1a效价检测：

[0118] 仪器设备：高效液相色谱议(具有可变性波长紫外检测器)；漩涡混合器；10ml具塞离心管；离心机；50ul微量进样器；色谱数据处理机(工作站)；色谱柱：
150m m×4.6m m(id)不锈钢柱C18、5um。

[0119] 试剂：丙酮、乙酸乙酯、无水甲醇

[0120] 高效液相色谱操作条件：

[0121] 流动相：色谱甲醇+水＝(80-85)％+(10-15)％；流量：1.0ml/min；柱温：室温；检测波长：245nm；

[0122] 操作步骤：

[0123] a、样品制备：

[0124] 用10ml移液管准确吸取发酵液5ml，置于10ml离心管中，离心(3500-4500转/分)分离10-15分钟，倒掉上层清液，用2ml移液管向菌丝体沉降物加入2ml丙酮，于振荡器上振荡1-2分钟，停机10分钟，如此反复振荡45分钟(注意：振荡时应避免管中溶液流出)，用5ml移液管加3ml乙酸乙酯后再振荡二次，每次约一分钟，然后静置以使上清液澄清，离心。用微量进样器吸取上清液50ul于一离心管中，加入2.0ml色谱甲醇，振荡摇匀。

[0125] b、标样的制备

[0126] 准确称取阿维菌素标准品0.04克(精确至0.0002克)溶于50毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。用移液管转移1毫升到10毫升容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，备用。

[0127] 在上述条件下，待仪器稳定后，注入标样溶液，待连续两针阿维菌素(B1A)峰面积相对变化小于1.5％后，再把制备的样品溶液注入仪器，进行检测。

[0128] 计算方法：

[0129]

[0130] 式中：S---B1a峰面积；f---校正因子；2.05---样品加入2毫升甲醇的体积；0.05---吸取样品的毫升数。

[0131] 经液相色谱议效价检测，

[0132] 实施例1所制备的FT26-9菌株发酵代谢产物与出发菌株MF800-6相比较具有显著的差异。详见图1、图2，表1、表2、表3、表4、表5。

[0133] 表1：出发菌株MF800-6代谢产物液相分析含量表。

[0134]

[0135] 表2：FT26-9代谢产物液相分析含量表。

[0136]

[0137] 表3FT26菌株不同发酵时间发酵产物中B1a效价检测结果。

[0138]

[0139] 表4MF800菌株不同发酵时间发酵产物中B1a效价测定结果。

[0140]

[0141] 表5MF800菌株与FT26大生产发酵产物中B1a效价对比结果。

[0142]

[0143] 注：表3、表4、表5是应用到发酵大生产中分别取10罐其详细的对比数据。

[0144] 从图1、图2，可以看出，MF800-6代谢产物中有效成分B1a、B2b的峰高较FT26-9低、峰面积也小，无效A1a、A2a及其他无名杂峰高且多。表1、表2表3、表4、表5可以看出MF800-6代谢产物中主要组分的相对含量分别为：B1a 32.09％、B2b 19.67％、A1a 8.5％、A2a 20.32％，B1a效价5355ug/ml；FT26-9菌株代谢产物中主要组分相对含量分别为B1a48.25％、B2a 35.75％、A1a 0.63％、A2a 1.64％，B1a效价8923ug/ml。即FT26-9菌株的代谢产物较MF800-6的代谢产物B1a提高了50.4％、B2a提高了81.7％、无效组分A1a降低了92.6％、A2a降低了91.9％。