一种微泡菌BS03的培养基及其制备方法

摘要

一种微泡菌BS03的培养基及其制备方法。涉及微生物培养基，提供一种可高效培养微泡菌BS03、并显著提高其细胞密度和杀藻活性物质产量的培养基及其制备方法。培养基的组成可为在1L的蒸馏水中含有：蛋白胨1～20g/L，蔗糖1～15g/L。培养基的制备方法为：将胰蛋白胨、蔗糖加入蒸馏水中定容至1L，灭菌后即得微泡菌BS03的培养基。以2216E为基础培养基，采用多种方法优化培养条件，开发出了一个适合高密度培养微泡菌BS03的复合培养基。

权利要求

1.一种微泡菌BS03的培养基，其特征在于所述微泡菌BS03已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2010218；

所述微泡菌BS03的培养基的组成是在1L的蒸馏水中含有蛋白胨10.50g，蔗糖8g；

所述微泡菌BS03的培养基由以下方法制备：将蛋白胨、蔗糖加入蒸馏水中定容至1L，灭菌后即得微泡菌BS03的培养基。

说明书

一种微泡菌BS03的培养基及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物培养基，特别涉及一种微泡菌BS03的培养基及其制备方法。

背景技术

[0002] 近年来，由于沿岸水域严重污染和富营养化，赤潮发生频率急剧增加，规模不断扩大，新的赤潮藻种不断出现，有毒赤潮藻种比例上升，危害的区域面积也越来越大，目前已在美国、日本、中国、加拿大、法国、瑞典、挪威、菲律宾、印度、印度尼西亚、马来西亚、韩国、香港等30多个国家和地区频繁发生。降低水体富营养化程度，寻求有效的赤潮及其毒素污染防治途径势在必行，赤潮防治成为当前国内外急需解决的难题。

[0003] 目前，藻类的控制技术可归纳为3种，即物理方法、化学方法和生物方法。物理方法主要是通过添加絮凝剂或粘土等使藻细胞絮凝沉淀；化学方法是指向水华水体中加入一些化学杀藻剂如硫酸铜等杀灭藻细胞，这两种方法成本均较高，可选择性差，处理过程中会连同一些有益生物一起杀死，在杀死藻细胞同时还会导致细胞内毒素的突然释放，对环境存在二次污染等种种局限性。生物方法主要是指利用生物之间的相互生态关系，在特定水体中建立控制因子-宿主的动态平衡体系，以防止藻类污染的发生或治理已发生的藻类污染的一种方法。目前，国内外对水华和赤潮的爆发和消亡的生物学机理的研究也刚起步，其中的溶藻细菌作为对有害赤潮的生物防治更是国内外研究的热点。

[0004] 溶藻细菌(algicidal bacteria)是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。当前，国内外对溶藻细菌的研究尚处于初步阶段，对于细菌溶藻活性代谢产物的研究也是刚刚开始。杀藻细菌中见诸报道最多的是倚靠释放胞外物质杀藻，而分泌胞外物质的多少通常与细胞密度的高低相关联，优化培养基则是一种提高细胞密度的有效方法。为了获取一定量的杀藻物质用于后续活性物质的有效分离及杀藻机制的研究工作的展开，细菌培养基及培养条件的优化工作就显得尤为重要。

[0005] 培养基是人为提供给微生物生长的最重要的培养环境，是影响微生物生长增殖和代谢产物合成的重要因素。影响微生物生长过程的因素有很多，主要包括培养基(成分、浓度)以及培养条件(温度，pH值，转速，接种量，通氧量)等。由于发酵培养基成分众多，且各因素常存在交互作用，因此培养基优化工作量大且复杂。数学统计学中的多种优化方法已开始广泛应用于微生物培养基的优化工作，其中比较常用的实验方法有单因素法、正交实验设计法、均匀设计法、全因子实验设计法和响应面设计法等方法。

[0006] 传统的优化方法如单因素法优化培养基一次只能考虑一个因子水平的影响，工作量大，需要多次的实验和较长的试验周期，也无法显示各因素之间的相互作用关系。因此，结合单因素法和现有数学统计法的新型培养基优化法已受到越来越多的应用。均匀设计法是我国数学家方开泰和王元创造的一种多因素优化法(1、方开泰，王元.均匀设计与均匀设计表[M].北京：科学出版社，1994，21-23)。该方法将数论的原理和多元统计相结合，近几年来在微生物培养基的优化方面已取得不少成功的例子。均匀设计的基本思路就是尽量使实验点充分均匀分散，使每个试验点具有更好的代表性，但同时舍弃整齐可比的要求，以减少试验次数；然后通过多元统计方法来弥补这一缺陷，使试验结论同样可靠。因此均匀设计法是一种考虑试验点在试验范围内充分均匀散布的试验设计方法，在试验数相同的条件下，均匀设计的偏差远比正交设计小。由于均匀设计不再考虑正交试验的整齐可比性，因此其试验结果用逐步回归法进行二次回归拟合，最后根据拟合方程用单因素轮换法可求出各因素的最佳值。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种可高效培养微泡菌BS03、并显著提高其细胞密度和杀藻活性物质产量的微泡菌BS03的培养基。

[0008] 本发明的另一目的在于提供一种微泡菌BS03的培养基的制备方法。

[0009] 所述微泡菌BS03已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2010218，中国典型培养物保藏中心的地址为中国武汉，武汉大学。

[0010] 所述微泡菌BS03的培养基的组成是在1L的蒸馏水中含有蛋白胨1～20g/L，蔗糖1～15g/L。

[0011] 所述微泡菌BS03的培养基的组成最好是在1L的蒸馏水中含有蛋白胨10.50g，蔗糖8g。

[0012] 所述微泡菌BS03的培养基的制备方法为：

[0013] 将胰蛋白胨、蔗糖加入蒸馏水中定容至1L，灭菌后即得微泡菌BS03的培养基。

[0014] 所述灭菌，可采用高压灭菌，所述高压灭菌的条件可为：121℃，20min。

[0015] 本发明首先以2216E培养基为基础培养基，采用单因素法探索优化培养条件，即控制其他条件不变，对pH、盐度、无机盐分别选取不同梯度和类型进行实验，考察其对菌体生长和杀藻活性物质产量的影响，找出主要影响因素进行均匀设计。由于培养基优化是一项量大且复杂的工作，本发明中首先选择几种复合营养源，即那些既可以作为碳源又可以作为氮源的营养物质(如蛋白胨、酵母粉)，然后在它们的基础上添加不同微量成分，考察各成分对菌体生长和杀藻效率的影响。最终选择蛋白胨、蔗糖、培养时间、pH值、接种量为重要影响因子，利用均匀设计法，以菌液浊度、菌体干重和半致死浓度(LD50)为评价指标，进行5因素15水平的混合均匀设计，再利用DPS7.0软件对实验值进行二次多项式回归分析，最后建立回归模型。优化后的培养基组分为：蛋白胨10.50g/L，蔗糖8g/L，培养时间32h，接种量3.00％、初始pH值7.5。

附图说明

[0016] 图1为本发明实施例中不同培养基对微泡菌BS03生长和杀藻效率的影响图。在图1中，横坐标为培养基，从左到右依次为PYS培养基、LBK培养基、2216E培养基、BK培养基、B培养基、A培养基，右纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD600，左纵坐标为半致死率LD50(％)；柱状图为为半致死率LD50，折线图为OD600。

[0017] 图2为本发明实施例中不同碳源对微泡菌BS03生长和杀藻效率的影响图。在图2中，横坐标为碳源，从左到右依次为葡萄糖(Glucose)、麦芽糖(Maltose)、可溶性淀粉(Solublestarch)、蔗糖(Cane sugar)、乳糖(Lactobiose)，左纵坐标为半致死率LD50(％)，右纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD600，柱状图为为半致死率LD50，折线图为OD600。

[0018] 图3为本发明实施例中不同氮源对微泡菌BS03生长和杀藻效率的影响图。在图3中，横坐标为氮源，从左到右依次为大豆蛋白胨(Soya Peptone)、蛋白胨(Peptone)、牛肉膏(Beefextract)、KNO3、酵母粉(Yeast Powder)、NaNO3，左纵坐标为半致死率LD50(％)，右纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD600，柱状图为为半致死率LD50，折线图为OD600。

[0019] 图4为本发明实施例中不同氮源对微泡菌BS03生长和杀藻效率的影响图。在图4中，横坐标为无机盐，从左到右依次为NaNO3、KBr、FeSO4、CaCl2、K2HPO4，，左纵坐标为半致死率LD50(％)，右纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD600，柱状图为为半致死率LD50，折线图为OD600。

[0020] 图5为本发明实施例中不同氮源对微泡菌BS03生长和杀藻效率的影响图。在图5中，横坐标为pH值，从左到右依次为5～9，，左纵坐标为半致死率LD50(％)，右纵坐标为波长在600nm下的光密度值OD600，柱状图为为半致死率LD50，折线图为OD600。

具体实施方式

[0021] 以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

[0022] 菌种：微泡菌BS03由厦门大学应用与环境微生物研究所分离保藏，初步鉴定为微泡菌属(Microbulbifer sp.)，已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010218。

[0023] 藻种：Alexandrium tamarense(AT)无菌株，藻种系由暨南大学水生生物研究所提供，经本申请人无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株。藻类所用培养液为f/2培养液。藻类置于室内三角瓶中培养，温度为20±1℃，光照条件为12h光照，12h黑暗。

[0024] 初始培养基(2216E)：蛋白胨(Peptone)5g，酵母提取物(Yeast Extract)1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉10g(固体培养基)，pH7.0～7.2，陈海水定容到1L。

[0025] 浊度测定法：取适当原液或是稀释的菌体发酵液，以空培养基做对照，在波长600nm下测定光密度(OD)值。

[0026] 细胞干重(DCW)：吸取发酵液10ml，8000r/min离心10min，弃去上清后用去离子水洗涤菌体3次，80℃恒温烘至恒重，称重计算DCW(g/L)。

[0027] LD50：取发酵培养后的无菌细胞滤液，按照0.5％、1.0％、1.5％三种不同浓度添加入测试藻类中，作用24h后用卢戈氏液固定，在光学显微镜下计数。应用蓝宙LD50软件，计算半数致死剂量(LD50)。

[0028] 实施例1

[0029] 采用2216E为基础培养基，进行单因素法优化培养条件的探索。

[0030] 温度的影响：分别设定培养温度为20、25、28、30和35℃，pH7.0～7.2，1％接种量，250ml三角摇瓶装液量为50ml，180r/min摇床培养24h后，取菌液测定OD600和LD50。

[0031] 转速的影响：分别设定摇床震荡速度为120、150、180和210r/min，其余条件与上述相同，培养24h后取发酵液测定OD600和LD50。

[0032] 初始pH的影响：分别选用2.0mol/l的HCl与2.0mol/l的NaOH调培养基的pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，温度28℃，1％接种量，250ml三角摇瓶装液量为50ml，180r/min摇床培养24h后，取菌液测定OD600和LD50。

[0033] 盐度的影响：用人工海水分别设定培养基的盐度为10、20、30、40和50‰，初始pH7.0～7.2，温度28℃，1％接种量，250ml三角摇瓶装液量为50ml，180r/min摇床培养24h后，，然后取发酵液测定OD600和LD50。

[0034] 实验结果显示：温度在微生物生长过程中对于菌株的生物量和活性代谢产物的分泌起着重要的作用，该BS03菌株在20～30℃间菌细胞密度随着温度的升高而增大，当温度大于30℃时，菌密度有所下降。温度改变过程中，菌体生长和杀藻物质的产生规律是一致的。考虑到节省能源故选择28℃为培养条件。微生物培养过程中转速的改变直接影响的就是微生物的溶氧量，过高或过低的的溶氧速率都不利于菌体生长，在转速为180r/min时，该BS03菌株生物量和LD50分别为1.726，0.648，该值为适宜菌体生长和产活性物质的摇床转速。pH在微生物生长过程中影响较大，该菌在pH为5.0～8.0的培养条件下，其生物量随着pH值的升高而增大，而LD50在pH值为7.0时最低，即此时菌体产活性物质的能力最强。当pH值大于8.0和小于6.0时菌体的生物量和产活性物的能力都受限制。故该菌最适合在中性偏碱性条件下生长。盐度对于海洋微生物的生长增值有着重要意义，由结果可知，BS03生长及其杀藻活性物质的产生都受到盐浓度变化的显著影响。当培养基盐度为10‰时，菌体生长缓慢，产溶藻活性物质的能力低，此时LD50为4.105。随着盐度增加菌体生长迅速，溶藻活性物质分泌能力也明显增强。当盐度大于30‰，该菌的杀藻率虽有略微增加，但菌体生长明显减慢。因此30‰的是适合微泡菌BS03的盐度范围。

[0035] 故此，BS03的最佳培养条件为：培养温度为28℃，适宜的培养基初始pH为7.0，盐度为30‰，转速为180r/min。

[0036] 实施例2

[0037] 在本实施例中首先选择几种复合营养源即那些既可以作为碳源又可作氮源的营养物质(如蛋白胨、酵母粉等)和两种无机氮源。然后在它们的基础上添加不同微量成分，考察各成分对微泡菌的生长及产活性物质的影响(参见图1～5)。

[0038] 以2216E为基础培养基(无碳源和氮源)，用5.0g/L大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉为复合营养源及NaNO3和KNO3为无机氮源。其余组分含量同于基础培养基。培养条件为：接种量为1％，28℃，180r/min，pH为7，盐度为30‰，摇瓶培养24h后测定OD600和LD50。结果显示，BS03菌株更适合生长在有机氮中。无机氮中菌体的生物量较低，KNO3、NaNO3的OD600值分别为0.071、0.06133，有机氮中牛肉膏条件下菌体的生物量达到最大OD600为1.126，蛋白胨次之1.003，但此时菌株BS03溶藻活性物质的分泌能力不如蛋白胨培养条件下强。故综合分析BS03菌株培养基选择蛋白胨作为其最佳氮源，继续后续的实验。

[0039] 在5.0g/L胰蛋白胨的基础上分别加入1g/L的可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖充当碳源，并以仅加有蛋白胨作为对照1，其余组分含量同于基础培养基，2216E为对照2。培养条件为：接种量为1％，28℃，180r/min，pH为7，盐度为30‰，摇瓶培养24h后测定OD600和LD50。结合生长量和LD50考察加入的组分是否对BS03菌株存在促进作用。结果表明：不同试验组培养基BS03的发酵液生物量均比对照2(原培养基2216E)多，但差别不大。而各组的溶藻效果区别很明显，可能由于培养基成分及配比不同影响了BS03产生活性杀藻物质的能力。

[0040] 仅加有蛋白胨的对照1无论是生长量还是杀藻率都明显低于对照2，即原基础培养基；碳源添加组分中，添加葡萄糖和蔗糖的培养基其细胞胞滤液的LD50为1.021、0.965，皆低于原基础培养基的1.201，而其他几种添加碳源的培养基其细胞胞滤液的LD50都高于原基础培养基的细胞胞滤液的LD50，这表明这些碳源成分中葡萄糖和蔗糖对微泡菌BS03分泌活性物质有促进作用；因考虑成本问题故后续实验选择蔗糖为菌株BS03培养基的最佳碳源。

[0041] 在微生物发酵过程中，菌体的接种量和发酵时间也是影响微生物菌体生物量的产生及活性代谢物分泌的重要因素。故后续的实验将菌体的接种量和发酵时间列入影响菌株BS03发酵的影响因子，参与培养基优化过程。

[0042] 说明该方程对菌体干重的模拟预测是可信的。由以上均匀设计实验，可知各因素对杀藻率和菌体生长量均有一定的影响，该微泡菌BS03的的最佳培养基方案为：pH值7.5，培养时间32h，蛋白胨10.50g/L，蔗糖8.0g/L，接种量为3.0％。

[0043] 实施例3

[0044] 根据前期试验，选择蛋白胨、蔗糖、pH、接种量、培养时间为影响因子进行5因素15水平的均匀设计，其余组分同于初始培养基。五个因素分别为自变量X1、X2、X3、X4和X5，菌体干重和OD600为因变量Y1、Y2。培养条件选择：28℃，180r/min，盐度为30‰。各因素均设置15水平，将实验结果经DPS软件数据处理系统二次多项式逐步回归分析，并对该模型进行显著性检验(参见表1，表2)

[0045] 表1

[0046]

[0047] 回归方程为：

[0048] Y ＝ 5.38134906+113.60189202X1×X1-3.793014914X2×X2+2.5854730603X3×X3-28.422411492X4×X4-0.15092230997X5×X5-65.98236457X1×X3-270.25223629X1×X5-10.298424271X2×X3+20.758363788X2×X4+49.38660676X2×X5+28.185002912X3×X4+145.52421280X3×X5-135.09790077X4×X5。

[0049] 相关系数R＝0.99982，F值＝209.8485，显著水平p＝0.0540，剩余标准差S＝0.06049，调整后的相关系数Ra＝0.99743，Durbin-Watson统计量d＝1.72。

[0050] 表2

[0051]

[0052] 回归方程为：

[0053] Y ＝ 10.83501238-172.80147120X3+432.5156109X5+8.067639869X3×X3-0.03230489278X4×X4-0.014902212031X1×X2-0.03589177354X1×X5+2.7406271234X2×X3-6.868578732X2×X5+0.017883024404X3×X4-20.232457027X3×X5。

[0054] 相关系数R＝0.98340，F值＝11.7502，显著水平p＝0.0149，剩余标准差S＝0.25665，调整后的相关系数Ra＝0.94063，Durbin-Watson统计量d＝2.91。

[0055] 由以上均匀设计实验，得该微泡菌BS03的的最佳培养基方案为：pH7.5，培养时间32h，蛋白胨10.50g/L，蔗糖8.0g/L，接种量为3.0％。结果与以干重为指标的结果一致。

[0056] 实施例4

[0057] 通过上述优化实验，得到了微泡菌BS03的最适培养基配方和最佳培养条件。将初始培养基和优化培养基分别用于BS03的摇瓶培养，培养条件采用优化培养条件。优化后的菌体发酵增产效果显著(参见表3)。在摇瓶中培养32h后，其稳定期的菌体干重值可高达4.725g/L，超过与回归模型的预测值的3.498g/L，且比优化前的基础培养基提高了0.4倍；
优化后的菌株OD值达2.807，也超过回归模型的预测值2.619。说明利用均匀设计优化实验不仅可行性高的，而且效果显著。

[0058] 表3

[0059]