本发明公开一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，包括如下步骤：1)将菌种接入含有诱导物培养基中，摇床培养生产壳聚糖酶的发酵产酶工艺；2)酶纯化工艺；其中所述的海洋草酸青霉菌属诱导型产酶菌种，已于2010年12月在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)登记保藏，保藏号为CCTCC M2010349。整个生产方法培养方法简单，生产成本低廉，同时简化了下游的纯化工序，具有较高的经济和使用价值，有利于实现工业化生产。
1.一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于包括如下步骤：1）将菌种接入含有诱导物的培养基中，摇床培养生产壳聚糖酶的发酵产酶工艺；2）酶纯化工艺；其中所述菌种为海洋草酸青霉菌，属诱导型产酶菌种，已于2010年12月在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)登记保藏，保藏号为CCTCC NO：M2010349，保藏名称为草酸青霉菌PCS-7（Penicillium oxalicum PCS-7）。
2.如权利要求1所述的一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于所述的发酵产酶工艺为：将海洋草酸青霉菌斜面活化后接入种子培养基pH7.2，在25℃下培养2天；
再按9%的接种量接入含有诱导物的发酵培养基中，离心去除杂质与菌体，得到发酵后的粗酶液。
3.如权利要求2所述的一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于：所述的种子培养基(g/L)组成为：淀粉10g/L，酵母膏1g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，（NH4）
2SO42.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，K2HPO40.002g/L，NaCl4g/L，CaCO36g/L，壳聚糖10g/L。
4.如权利要求2所述的一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于：所述的含有诱导物的发酵培养基为寡营养培养基，其组成的质量百分比为2～4%盐度的海水、
5.如权利要求4所述的一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于：所述的发酵培养基的pH为自然，培养温度为25℃，摇床100rpm培养4天。
6.如权利要求1所述的一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于所述的酶纯化工艺为：将发酵产酶后的粗酶液，利用0.45微米滤膜过滤或10000rpm离心分离，即得到较纯的酶。
一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种海洋草酸青霉菌（PCS-7）产壳聚糖酶的方法。
背景技术
[0002] 目前大部分研究的微生物产壳聚糖酶活力还普遍较低，而真正产酶量大、适用于工业化大规模生产的菌株很少，生产成本高、生成产物不易控制等原因导致商品壳聚糖酶价格据高不下。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供了一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法。整个培养、生产方法简单，生产成本低廉，同时简化了下游的纯化工序，具有较高的经济和使用价值，有利于实现工业化生产。
[0004] 为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
[0005] 一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法，包括如下步骤：1）将菌种接入含有诱导物的培养基中，摇床培养生产壳聚糖酶的发酵产酶工艺；2）酶纯化工艺；其中所述菌种为海洋草酸青霉菌，属诱导型产酶菌种，已于2010年12月在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)登记保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2010349，保藏名称为草酸青莓菌PCS-7（Penicillium oxalicum PCS-7）。
[0006] 该菌株是从福建崇武海边的海螺、贝壳及其附着物的微生物中筛选得到的，在产壳聚糖酶过程中分泌酸性物质，并且具有一定的耐酸性，在发酵过程对抑制其他微生物的生长、增加环境中壳聚糖的溶解度、达到利用壳聚糖和维持自身生长起到一定的作用。
[0007] 所述的发酵产酶工艺为：将海洋草酸青霉菌斜面活化后接入种子培养基，在25℃下培养2天；再按9%的接种量接入含有诱导物的发酵培养基中，离心去除杂质与菌体，得到发酵后的粗酶液。
[0008] 所述的种子培养基(g/L)组成为：淀粉10g/L，酵母膏1g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，（NH4）2SO4 2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，K2HPO40.002g/L，NaCl 4g/L，CaCO3 6g/L，壳聚糖10g/L，pH7.2。
[0009] 所述的含有诱导物的发酵培养基为寡营养培养基，其组成的质量百分比为2～4%盐度海水、0.2%～3%黄豆粉和0.5%～2.5%诱导物，pH自然。
[0010] 所述的发酵培养条件：温度为25℃，摇床100rpm培养4天。
[0011] 所述的酶纯化工艺为：将发酵产酶后的粗酶液，利用0.45微米滤膜过滤或10000rpm离心分离，即得到较纯的酶。
[0012] 本发明的有益效果为：本发明开发海洋微生物蕴涵着次生代谢物质多样性的巨大潜在资源，从海洋生物及其附着物中筛选出产壳聚糖酶的海洋微生物—海洋草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），利用海水取代常用培养基中的无机盐离子和各种微量元素，接入易得低价的培养基、仅添加少量碳源、氮源、诱导物，在25℃条件下发酵产壳聚糖酶；发酵液粗酶活为8.5U/mL（3000U/g粗酶干重）左右，是目前发表文献中发酵温度较低的一种产酶菌。该酶适宜反应条件：温度50℃、pH6.0；在pH2-9的范围内都有较高的酶活性，具有良好的耐酸性。整个培养、生产方法简单，生产成本低廉，本发明培养基成本不足原发酵培养基成本的5%。同时简化了下游的纯化工序，为微生物工业化应用生产壳聚糖酶提供了直接的理论和实验基础，具有较高的经济和使用价值，有利于实现工业化生产。
附图说明
[0013] 图1为本发明实施例电子显微镜下菌种形态；
[0014] 图2为普通发酵液经离心或透析后样品的电泳图；
[0015] 图3为本发明实施例黄豆海水培养基发酵液经膜过滤或离心后样品的电泳图。
具体实施方式
[0016] 实施例1
[0017] 本实施例的一种海洋草酸青霉菌产壳聚糖酶的方法包括如下步骤：1）将菌种接入含有诱导物的培养基中，摇床培养生产壳聚糖酶的发酵产酶工艺：所采用的海洋草酸青霉菌属诱导型产酶菌种，电子显微镜下菌种形态如图1所示，已于2010年12月在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)登记保藏，保藏号为CCTCC M 2010349。
[0018] 该菌株是从福建崇武海边的海螺、贝壳及其附着物的微生物中筛选得到的，在产壳聚糖酶过程中分泌酸性物质，并且具有一定的耐酸性，在发酵过程对抑制其他微生物的生长、增加环境中壳聚糖的溶解度、达到利用壳聚糖和维持自身生长起到一定的作用。将该菌斜面活化后接入种子培养基(g/L)：淀粉10g/L，酵母膏1g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，（NH4）2SO42.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，K2HPO40.002g/L，NaCl 4g/L，CaCO36g/L，壳聚糖10g/L，pH7.2，在25℃下培养2天，再按9%的接种量接入发酵培养基：寡营养培养基（2～
4%盐度海水+0.2%～3%黄豆粉+0.5%～2.5%诱导物），所述的诱导物可以采用脱乙酰度
50%的几丁质；脱乙酰度91%，分子量13万的壳聚糖；脱乙酰度68%，分子量6万的壳聚糖；
脱乙酰度8.5%，分子量0.3万的低聚糖中的一种。摇床100rpm培养4天，离心去除杂质与菌体，得到发酵液粗酶活为8.5U/mL（3000U/g纯化后干酶粉）左右，具有培养基成本低的特色。
[0019] 2）酶纯化工艺：将发酵产酶后的粗酶液，利用0.45微米滤膜过滤或10000rpm离心分离，即可得到较纯的酶，如图2、图3所示；图（2）普通发酵培养基发酵产酶后发酵粗酶液经离心或透析后样品的电泳图：平行点样20微升，样品与样品缓冲液1：1。其中图（2）中左边的条带为发酵液10000rpm离心10min后的样品。图（2）中右边的条带为透析后再经10000rpm离心10min的样品。图（3）为本实施例黄豆海水培养基发酵液经膜过滤或离心后样品的电泳图：图（3）中左边的条带为发酵液经过0.45微米滤膜过滤后样品。图（3）中中间的条带为发酵液经过10000rpm离心后样品，上样10微升。图（3）中右边的条带为marker。
由图2，图3对比可得:普通发酵培养基发酵产酶后,经过透析和10000rpm离心后,从电泳图(2)中看出还含有很多杂质,酶需要进一步纯化.而采用黄豆海水培养基发酵产酶后,经简单滤膜过滤或10000rpm离心,就可以得到相对较纯的酶(只有一条带).说明方法简单方便、成本低。
