花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了睡莲花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法。睡莲花器官发育基因NsAGL6，序列为SEQ ID NO.1，本发明所构建的表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6是由NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。将该植物表达载体用于植物遗传转化，NsAGL6基因在CaMV35S启动子的驱动下超量表达，大量合成AGL6蛋白，调控下游基因的表达，使之提前开花，改变植物花型。

权利要求

1.睡莲花器官发育基因NsAGL6，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

2.睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6与质粒pCAMBIA 1301-220构成。

3.根据权利要求2所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。

4.权利要求3所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)睡莲花器官发育基因NsAGL6的克隆

以睡莲小花蕾为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物并用高保真酶扩增NsAGL6基因，上游引物NsAGL6-F：SEQ ID NO.2

下游引物NsAGL6-R：SEQ ID NO.3

以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；

2)植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建从TOP10菌株中提取pMD19-T Simple-NsAGL6重组质粒，Sma I和BamH I双酶切后回收NsAGL6片段，再插入到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6构建成功。

说明书

花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及睡莲花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法。

背景技术

[0002] AGL6是参与花分生组织的建成和花器官形成过程中的一类重要转录因子。目前已经从玉米、矮牵牛、风信子、水稻等植物中克隆到了AGL6的同源基因，并对其功能进行了分析。研究发现，尽管这些植物的亲缘关系不尽相同，但其AGL6基因都参与了花发育的调控。这类基因的功能多集中于使植物提前开花和改变花器官形态、花部数目。AGL6类基因均含有高度保守的MADS结构域，并且在表达模式上具有一定的相似性。但迄今为止对AGL6基因的功能尚未完全确定。

[0003] 睡莲(Nymphaea ssp.)为睡莲属睡莲科多年生水生植物，具有很高观赏价值。由于花色艳丽，姿态优美，花态各异、其品种资源十分丰富。通过克隆控制睡莲花器官发育的关键基因，构建表达载体，转化其他植物，可培育出新花型、花期提前的植物新品种。

[0004] 在作物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将控制花发育的基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，使该转录因子在CaMV35S启动子的启动下超量表达，并调控下游目的基因的表达，改变植物形态建成，对于植物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

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发明内容

[0011] 本发明的目的在于为改良植物花型和花期，提供一个睡莲花器官发育基因NsAGL6，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

[0012] 本发明的另一目的在于提供睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体。

[0013] 本发明的又一目的在于提供睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制新花型、花期提前的新种质，可用于植物品种改良。

[0014] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

[0015] 睡莲花器官发育基因NsAGL6，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

[0016] 睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体，由所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6与质粒pCAMBIA 1301-220构成。

[0017] 上述的睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体，该植物表达载体是由NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。

[0018] 睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

[0019] 1)睡莲花器官发育基因NsAGL6的克隆

[0020] 以睡莲小花蕾为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物并用高保真酶扩增NsAGL6基因，

[0021] 上游引物NsAGL6-F：SEQ ID NO.2

[0022] 下游引物NsAGL6-R：SEQ ID NO.3

[0023] 以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；

[0024] 2)植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建

[0025] 从TOP10菌株中提取pMD19-T Simple-NsAGL6重组质粒，BamH I和Sma I双酶切后回收NsAGL6片段，再插入到经BamH I和Sma I双酶切得到的线性化的pCAMBIA 1301-220质粒，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6构建成功。

[0026] 将NsAGL6基因的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，方法如下：(1)农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化；(2)拟南芥花序浸染及种子筛选；(3)PCR鉴定及植物形态观察。

[0027] 本发明的有益效果：

[0028] 1.本发明提供的睡莲花器官发育基因NsAGL6基因是一个新的花发育基因，该基因可调控植物开花和花器官发育。

[0029] 2.本发明构建的睡莲花器官发育基因NsAGL6基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，改良植物花型和花期。

附图说明

[0030] 图1NsAGL6琼脂糖凝胶电泳分析：

[0031] M：DNAMarker(2Kb/1.5Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.3Kb/0.1Kb)

[0032] 1：NsAGL6开放阅读框扩增；

[0033] 2：pMD 19-T Simple-NsAGL6质粒Sma I和BamH I双酶切；

[0034] 3：pCAMBIA 1301-220-NsAGL6表达载体Sma I和BamH I双酶切检测图[0035] 图2植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建过程示意图。

[0036] 图3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定。

[0037] 图4植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6导致拟南芥提前开花。

[0038] 图5植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6导致拟南芥花瓣排列的改变。

具体实施方式

[0039] 实施例1植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建

[0040] 1.NsAGL6的克隆：

[0041] 选用睡莲栽培种‘黄公主’(Nymphaea sp.cv.‘Yellow Prince’)作为材料，提取花蕾总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照睡莲NsAGL6序列信息(NCBI登录号：AB495345)，经Primer Premier 5软件分析设计引物扩增NsAGL6；

[0042] 上游引物NsAGL6-F：5′-CGCGGATCCCTTTGAGTGATCATCGCAAGA-3′(SEQ ID NO.2)[0043] 下游引物NsAGL6-R：5′-TCCCCCGGGATGGTATGGATTACAGGACCC-3′(SEQ ID NO.3)[0044] 以花蕾cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×RCR Bμffer 5.0μL，-1 -1NsAGL6-F、NsAGL6-R引 物 各 1.0μL(20μmol·L )，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L )，TM
PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.8μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，反应33个循环，
72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T Simple载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，测定序列为SEQ ID NO.1。

[0045] 2.植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建

[0046] 提取含有目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA 1301-220质粒DNA并双酶切，酶切体系为：10×bμffer K 2.5μl，Sma I 2.0μl，BamH I 2.0μl，质粒DNA 10μl，ddH2O μp to50μl，37℃过夜充分酶切。将含有NsAGL6完整开放阅读框的片段和pCAMBIA1301-220线性化质粒片段分别回收，并将两个片段连接。连接反应体系为：T4Bμffer
2.0μl，T4连接酶1.0μl，载体回收液1.0μl，目的基因回收液4.0μl，dd H2O μp to
20μl，4℃过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA 1301-220-NsAGL6转化TOP10细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证。

[0047] 实施例2植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6转化拟南芥及花发育特性观察[0048] 1、农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

[0049] 从YEB(50mg/L利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50mg/L利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl2(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。

[0050] 取10μL pCAMBIA 1301-220-NsAGL6载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。

[0051] 2、拟南芥花序浸染及种子筛选

[0052] 将阳性单克隆接到50mL的YEB(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5.8，然后加200μL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养
12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。

[0053] 种子消毒与播种：将野生型和转基因拟南芥种子分别放入1.5mL的离心管中，加入1mL 75％酒精，添加0.1％的Triton X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95％的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置30分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上(1/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。

[0054] 3、PCR鉴定及植物形态观察。

[0055] 以经抗生素筛选的抗性植株总DNA为模板，以未转基因菊花苗为阴性对照进行PCR反应(如图3)。反应体系见实施例1。

[0056] 将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子同时播到栽培基质中，人工培养条件为：相对湿度80％，光照强度80-200μmol/M2/S，温光周期为16h光照，22℃/8h黑暗，17℃。记录每株开花的时间，并用体式显微镜观察花器官的变化。转基因苗相比野生型拟南芥，开花提前了6、9、10天(图4)；花瓣的排列也发生了变化，野生型的拟南芥花瓣呈辐射对称，而转基因的花瓣却不再是辐射对称(图5)。

[0057] 综上所述，本发明构建了含有睡莲花器官发育基因的植物表达载体pCAMBIA1301-220-NsAGL6，其中NsAGL6首次报道。所构建的植物表达载体可导入多种植物中，使之提前开花并改变植物花型。