一种应用1308酿酒酵母生产纤维乙醇的方法

摘要

本发明涉及一种应用1308酿酒酵母生产纤维乙醇的方法，其主要特点是通过在秸秆纤维素水解液中的耐受性的三次驯化，使1308酿酒酵母菌株能够耐受秸秆纤维素水解液中乙酸、糠醛等有毒有害物质影响，适应水解液中的成分，不仅具有高效转化葡萄糖为乙醇的特点，而且具备较强的抗发酵抑制物能力，因而能把水解液中葡萄糖高效转化为乙醇。本发明生产纤维乙醇方法的实施，能使葡萄糖向乙醇的转化率达到理论转化率的80%，为秸秆乙醇的规模化生产、降低生产成本提供可靠的基础条件。

权利要求

1.一种经过训化的酿酒酵母菌株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC4479，保藏日期2010.12.16，分类命名：酿酒酵母，TG-II株。

2.权利要求2的酿酒酵母菌株在乙醇制备中的应用。

3.权利要求3的应用，其特征在于，酿酒酵母菌株接种到纤维素水解液进行培养，得到纤维乙醇。

4.权利要求3的应用，其特征在于，步骤如下：

挑取长势良好的酿酒酵母菌株接入酿酒酵母1308一级种子培养基中, 28～30℃、

150rpm的条件下培养8～12h，制得一级菌种，然后按10%接种量接入发酵培养基中进行培养，温度控制在28～30℃，通风比0.05～0.1vvm，培养12～16h；培养成熟的种子以10%接种量接入纤维素水解液中，发酵2～3天；

其中,所述酿酒酵母1308一级种子培养基为12°Bx麦芽汁；

所述发酵培养基为1%玉米浆，其余为纤维素水解产物原液，pH值5.0的培养基。

说明书

一种应用1308酿酒酵母生产纤维乙醇的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),保藏编号为CGMCC 1308（南阳混合酵母）的新用途，具体的说是在利用秸秆原料制取燃料乙醇生产中，纤维素水解产物发酵为乙醇工艺中的应用。

背景技术

[0002] 随着化石燃料的日益匮乏，单纯依靠化石能源难以实现经济社会和环境的可持续发展。发展可再生能源已经成为缓解能源供需矛盾，减少环境污染，增加农民收入的重要途径。以非粮物质—秸秆原料生产乙醇，不仅是保证国家能源安全、粮食安全的需要，而且也是保护环境，提高农民收入的有效手段。

[0003] 秸秆乙醇的工艺路线是：①秸秆切断：秸秆经除杂装置进行除杂后，经皮带输送机输送至切草机进行切段处理；②秸秆预处理：切段后的秸秆送入预处理工段，进行预处理，使木质素和纤维素分离；③酶解糖化：预处理后的秸秆进入酶解罐，采用复合酶进行降解，得到可发酵糖；④发酵：酶解糖化结束，将酶解液输送到发酵罐接种酿酒酵母进行发酵，把可发酵糖转化为乙醇；⑤蒸馏：发酵成熟的醪液进入蒸馏工序进行蒸馏制得乙醇。 [0004] 秸秆纤维素水解产物的主要成分：葡萄糖、木糖、纤维二糖的混合糖浓度10%，这些物质可以转化为乙醇。另外由于受秸秆预处理工艺的影响，水解液中还含有乙酸、糠醛和酚类化合物等抑制酵母菌生长或影响其发酵性能的物质，这些物质的浓度分别为：乙酸5000～10000ppm、糠醛1000～2000ppm，并含有酚类及芳香烃类化合物。这些物质严重影响着酵母菌把可利用单糖转化为乙醇的能力，因此，用于发酵的菌株除具有高效转化葡萄糖为乙醇的特点外，还应具备较强的抗发酵抑制物能力，才能提高秸秆纤维素水解单糖的糖醇转化率。

[0005] 寻找或驯化酵母菌株，对秸秆纤维素水解产物进行发酵，高效代谢葡萄糖，对降低秸秆纤维素生产乙醇的成本，进行大规模工业化生产有重大意义。

发明内容

[0006] 酿酒酵母1308（南阳混合酵母）原有特性是以淀粉质原料水解单糖为主，正常情况下发酵性能为：糖醇转化率43～46%，残余还原糖0.5g/100ml左右，该酵母是淀粉质原料乙醇发酵工艺中普遍使用的发酵菌种。但以淀粉质为原料的糖化水解液中，没有乙酸、糠醛、等抑制其生长和发酵性能的物质。

[0007] 本发明目的在于提供一种应用酿酒酵母1308在秸秆纤维素水解产物发酵中的应用，

[0008] 为此本发明提供一种秸秆纤维素水解制备纤维乙醇的方法，该方法包括以下步骤：

[0009] 步骤1，对酿酒酵母1308进行驯化；

[0010] 步骤2，将驯化后的酿酒酵母接种到纤维素水解液进行培养，得到纤维乙醇。

[0011] 本发明步骤1中所述酿酒酵母1308，是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，编号为CGMCC 1308（南阳混合酵母）的酿酒酵母，属于现有技术。

[0012] 本发明利用该酵母的优点，经过进一步的驯化得到更加优良的菌种。 [0013] 本发明步骤1中的驯化方法如下：

[0014] 驯化方法：

[0015] 第一次驯化：挑取长势良好的酿酒酵母1308接入1308酵母一级种子培养基中,28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得一级菌种，然后按10%接种量接入发酵培养基中进行扩配，温度控制在28～30℃，通风比0.05～0.1vvm，培养12～16h。培养成熟的种子以10%接种量接入20%纤维素水解液中，28～30℃、150rpm的条件下发酵2～3天； [0016] 第二次驯化：挑取长势良好的第一次驯化得到的酵母接入1308酵母一级种子培养基中, 28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得一级菌种，然后按10%接种量接入发酵培养基中进行扩配，温度控制在28～30℃，通风比0.05～0.1vvm，培养12～16h。
培养成熟的种子以10%接种量接入50%纤维素水解液中，28～30℃、150rpm的条件下发酵
2～3天；

[0017] 第三次驯化：挑取长势良好的第二次驯化得到的酵母接入1308酵母一级种子培养基中, 28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得一级菌种，然后按10%接种量接入发酵培养基中进行扩配，温度控制在28～30℃，通风比0.05～0.1vvm，培养12～16h。培养成熟的种子以10%接种量接入100%纤维素水解液中，28～30℃、150rpm的条件下发酵
2～3天。

[0018] 本发明步骤2中的乙醇的制备：

[0019] 挑取长势良好的第三次驯化得到的酵母接入1308酵母一级种子培养基中, 28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得一级菌种，然后按10%接种量接入发酵培养基中进行扩配，温度控制在28～30℃，通风比0.05～0.1vvm，培养12～16h。培养成熟的种子以10%接种量接入纤维素水解液中，发酵2～3天。

[0020] 以上所述的培养基为：

[0021] （1）1308酵母一级种子培养基：12°Bx麦芽汁。

[0022] （2）发酵培养基：1%玉米浆，其余为纤维素水解产物原液 ，pH值5.0。 [0023] 通过1308菌株在秸秆纤维素水解液中的耐受性的三次驯化后，该菌株已经能够适应水解液中的成分，发酵结束葡萄糖向乙醇的转化率达到理论转化率的80%。本发明经过三次驯化后的菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC№4479，保藏日期2010.12.16，分类命名：酿酒酵母，TG-II株，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。因此本发明还包括编号为CGMCC№4479的酿酒酵母菌株在乙醇制备中的应用。所述应用包括，CGMCC№4479的酿酒酵母菌株接种到纤维素水解液进行培养，得到纤维乙醇的步骤。

[0024] 具体实施方式

[0025] 下面通过具体实施方法来说明本发明的实质。

[0026] 实施方法1：

[0027] 本发明对1308菌株的耐受性驯化采取的技术方案：

[0028] ①菌种选择：驯化用菌株采用保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 1308（南阳混合酵母）的酿酒酵母。

[0029] ②培养基：平板培养和斜面保藏培养基, 12°Bx麦芽汁，2%琼脂粉，混匀后121℃、30min灭菌处理。种子培养基，12°Bx麦芽汁，121℃、30min灭菌处理。发酵培养基，葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，加水混匀后经121℃、30min灭菌处理。 [0030] （3）添加乙酸驯化试验：

[0031] 驯化方案：在平板培养基中加入2000ppm的乙酸，培养结束挑选长势良好的单菌落接种斜面，30℃培养3～5d,冰箱4℃保存备用。将活化后的斜面菌种接入添加2000ppm的乙酸的种子培养基中, 28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得发酵菌种,按10%接种量接入同样加入2000ppm乙酸的发酵培养基中，温度控制在30～32℃，发酵2～3天，检测乙醇含量，计算糖醇转化率。

[0032] 发酵结束选取长势良好、糖醇转化率高的菌株进行下一高浓度的乙酸驯化实验，依此类推，驯化结果如下。

[0033]

[0034] （4）添加糠醛驯化试验：

[0035] 驯化方案：在平板培养基中加入400ppm的糠醛，培养结束挑选长势良好的单菌落接种斜面，30℃培养3～5d,冰箱4℃保存备用。将活化后的斜面菌种接入添加400ppm糠醛的种子培养基中, 28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得发酵菌种,按10%接种量接入同样加入400ppm糠醛的发酵培养基中，温度控制在30～32℃，发酵2～3天，检测乙醇含量，计算糖醇转化率。

[0036] 发酵结束选取长势良好、糖醇转化率高的菌株进行下一高浓度的糠醛驯化实验，依此类推，驯化结果如下。

[0037]

[0038] （4）添加乙酸、糠醛混合物驯化试验：

[0039] 驯化方案：在平板培养基中加入400ppm的糠醛和2000ppm的乙酸，培养结束挑选长势良好的单菌落接种斜面，30℃培养3～5d,冰箱4℃保存备用。将活化后的斜面菌种接入添加400ppm糠醛和2000ppm乙酸的培养基中, 28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得发酵菌种,按10%接种量接入同样加入400ppm的糠醛和2000ppm的乙酸发酵培养基中，温度控制在30～32℃，发酵2～3天，检测乙醇含量，计算糖醇转化率。

[0040] 发酵结束选取长势良好、糖醇转化率高的菌株进行下一高浓度的糠醛驯化实验，依此类推，驯化结果如下。

[0041]

[0042] 由表1～3可以看出，驯化后的南阳混合酵母1308具有高效转化葡萄糖生成乙醇的能力，同时具有可以耐受发酵抑制剂乙酸6000～8000ppm糠醛1200～1600ppm的能力。 [0043] 挑取添加8000ppm糠醛和1200ppm的平板培养基上长势良好的菌落进行斜面保藏和下一步的驯化实验。

[0044] 本发明进一步通过对菌种的驯化，提高菌种对秸秆纤维素水解液的耐受性能，下面是驯化方法。

[0045] 实施方法2：

[0046] 本发明对1308菌株对秸秆纤维素水解液的耐受性训化采取的技术方案：

[0047] （1）培养基：1308酵母种子培养基，12°Bx麦芽汁。

[0048] （2）发酵培养基：1%玉米浆，其余为纤维素水解产物原液 ，pH值5.0。 [0049] （3）驯化方案：挑取长势良好的斜面菌种接入一级种子扩大培养基中, 28～30℃、150rpm的条件下培养8～12h，制得一级菌种，然后按10%接种量接入种子培养基中进行扩配，培养基同上，温度控制在28～30℃，通风比0.05～0.1vvm，培养12～16h。培养成熟的种子以10%接种量接入纤维素水解液中，28～30℃、150rpm的条件下发酵2～3天，检测检测乙醇含量，计算糖醇转化率。

[0050]

[0051]

[0052] 通过实施方法2可以看出， 1308菌株在秸秆纤维素水解液中的耐受性驯化后，该菌株已经能够适应水解液中的成分，发酵结束葡萄糖向乙醇的转化率达到理论转化率的80%，因此考虑对第三次驯化得到的CGMCC4479的酿酒酵母菌株进行水解液的耐受性放大生产试验。

[0053] 实施方法3：

[0054] 1308菌株在20吨秸秆纤维素水解液的生产放大方案：

[0055] （1）培养基：1308酵母一级种子培养基，12°Bx麦芽汁；