一种透明质酸的制备方法转让专利
申请号 : CN201110006226.9
文献号 : CN102154405B
文献日 : 2013-03-20
发明人 : 毛自朝 , 杨发祥 , 尚海丽 , 程倩
申请人 : 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司
摘要 :
本发明是一种生产透明质酸的方法。该方法是通过构建透明质酸合成酶基因Has和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中共表达的重组表达载体，将该重组表达载体转化大肠杆菌获得工程大肠杆菌，发酵该工程大肠杆菌得到透明质酸。该方法提高生产透明质酸的产量达到2.5g/L,比现有技术通过大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas获得的最高HA产量提高近10倍。
权利要求 :
1.一种透明质酸的制备方法，其特征在于用工程大肠杆菌pHK/JM109生产透明质酸的摇瓶培养合成按以下进行： 在500ml-2500ml 三角瓶中，以总体积100ml-500ml 含
25-50 mM K2HPO4•3H2O, pH6.5-7.2，2-4mM MgSO4•7H2O, 20-40 mM 柠檬酸, 1-2 mM MnCl2,
300-400 mM 葡萄糖，50-75 mM 氮乙酰葡萄糖胺,5-10 mM 乳糖，10-30 g/L 甘油，3-5g/L酪蛋白酸水解物的体系中加入已表达pmHas和kfiD的pHK/JM109，使菌体细胞浓度达4-5% W/V, 发酵条件为30-33 ℃，250 rpm，并用28% V/V的氨水调节pH至中性，发酵反应时间为30-36小时，工程大肠杆菌pHK/JM109 分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏号为CGMCC No.3926。
2.一种透明质酸的制备方法，其特征在于用工程大肠杆菌pHK/JM109生产透明质酸的发酵罐培养合成按以下进行：从Amp50-100μg/ml+Km25-100μg/ml的LB平板上挑起3-5个经划线并过夜培养的pHK/JM109单菌落，置于100ml TB培养基，过夜培养；该培养物经离心收集菌体，菌体用20-50ml TB悬浮，全部转入1-5L的发酵罐，发酵罐培养基为TB培养基并含Amp50- 100μg/ml+Km25-100μg/ml，总体积为600-3000 ml，控制温度37℃，转速
1200 rpm, 通入流量为60 ml/min 的混合气体，即氧气：空气为1：10 v/v，并用28% V/V氨水及4 mol/L HCl 调节pH至6.8-7.2 ，培养4 小时，当培养物OD600达到5时，加入IPTG使其终浓度达0.5-1 mM，同时将反应温度调节至30-33 ℃培养2 小时，此时加入50% W/V葡萄糖和10% W/V磷酸铵 pH6.8 ，使发酵液中葡萄糖和磷酸铵含量分别为50 g/L和1 g/L,
30 ℃培养10 小时后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸铵使其浓度分别为0.5 mM、50 g/L和1 g/L，混合液30 ℃培养14－30小时后完成发酵，得到2-3 g/L浓度的透明质酸，工程大肠杆菌pHK/JM109 分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏号为CGMCC No.3926。
说明书 :
一种透明质酸的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物的基因工程技术领域，具体是以质粒形式或以基因组整合方式构建的工程大肠杆菌生产透明质酸的制备方法。
背景技术
[0002] 大肠杆菌K12株系因清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组的易操作性而被广泛应用在代谢工程领域，以生产各式各样的高附加值产品。目前尚未发现天然的大肠杆菌菌株有生产透明质酸的能力。
[0003] 透明质酸(Hyaluronic acid，HA)最早从牛眼中分离得到的一种具有高黏度氨4 6
基多糖。透明质酸广泛存在人和动物组织内，其分子量在5×10 到8×10 道尔顿之间，是由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖醛酸及β-1,3-糖苷键连接的氮乙酰基葡萄糖胺（β1-4 D-Glucuronic acid, GlcA ，β1-3 D-N-acetylglucosamine , GlcNAc）交替连接而成的直链聚合物。研究证实，该多糖作为结构与信号分子参与了哺乳动物的受精、胚胎发育、血管再生和关节润滑等众多生理活动；同时在炎症与损伤修复、维持皮肤的水分与弹性方面也有重要作用。
基多糖。透明质酸广泛存在人和动物组织内，其分子量在5×10 到8×10 道尔顿之间，是由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖醛酸及β-1,3-糖苷键连接的氮乙酰基葡萄糖胺（β1-4 D-Glucuronic acid, GlcA ，β1-3 D-N-acetylglucosamine , GlcNAc）交替连接而成的直链聚合物。研究证实，该多糖作为结构与信号分子参与了哺乳动物的受精、胚胎发育、血管再生和关节润滑等众多生理活动；同时在炎症与损伤修复、维持皮肤的水分与弹性方面也有重要作用。
[0004] 研究发现，特定长度的HA寡糖链在抗肿瘤免疫异常修复等方面发挥着重要功能。由于透明质酸独特的化学特性与生理功能， HA及源于HA的寡糖链被广泛应用于眼科手术、关节炎治疗、抗肿瘤、给药方式、化妆品工业等诸多方面，仅2008年HA做为原料，在全球市场的交易金额约为10亿美元并有逐年增加的趋势。
[0005] 自然界中HA广泛存在，如动物组织哺乳动物病原菌的细胞被膜及病毒PBCV-1浸染的小球藻等。目前商用HA主要从动物组织(如鸡冠，脐带、牛眼、关节滑液)，和培养人与高等哺乳动物的病原菌（如链锁状球菌, Streptococci ）中提取。出于资源限制、成本问题及药物安全等诸方面的考虑，上述生产绝非理想方式，国际社会极力探索更为经济、安全和持续的生产HA的方法。
[0006] 分子生物学及生物技术的发展，为上述问题的解决提供了重要的手段。对HA在动物与微生物中合成机理，诸多HA的合成过程必需基因的克隆等研究，都为通过代谢工程的手段，在安全的宿主生物中重建或改造合成途径来生产HA奠定了坚实的基础。
[0007] 2004年 日本学者祡谷滋郎等(中国专利申请号为200480022328.8)通过在转基因植物中表达从人类和草履虫病毒（PBCV-1）中得到的HA合成基因（Has）来尝试HA在植物组织中的合成。Widner B 等 (Bill Widner et al .,Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtilis Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(7): 3747–3752) 在枯草芽孢杆菌中成功表达从革兰氏阳性的链锁状球菌中得到的HA合成基因，工程芽孢杆菌在普通的三角瓶中发酵获0.5-0.6g／L HA 含量。
[0008] 然而在植物中生产透明质酸，因植物的转化难，生长周期受季节限制，许多保守环保人士反对转基因植物，及转基因植物本身存在对环境安全的潜在危害等而受到应用限制。对于枯草芽孢杆菌，因该菌有产生内毒素，各种大环脂类和脂肽类抗生素的报道，而会导致经发酵、用于医药领域HA的分离纯化成本增高，产率降低等系列问题。
[0009] 许多来源于人体肠道的大肠杆菌是维护肠道微生物平衡及人体健康的有益细菌。加之大肠杆菌K12株系具清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组可操作性，而被广泛应用在代谢工程领域以生产高附加值的生物产品。对于用大肠杆菌为宿主进行工程改造生产透明质酸的首次报道是美国麻省理工学院的Stephanopoulos G研究组。
2008该研究组通过在大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas 和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的seHas基因，该研究获得最高约 0.2g/L的HA产量。该工程大肠杆菌因HA合成产率低而难以获得产业化运用。
2008该研究组通过在大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas 和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的seHas基因，该研究获得最高约 0.2g/L的HA产量。该工程大肠杆菌因HA合成产率低而难以获得产业化运用。
发明内容
[0010] 本发明的目的是提供一种以高效产透明质酸工程大肠杆菌生产的透明质酸的制备方法。克服现有技术中生产透明质酸的资源短缺、安全性问题以及在工程大肠杆菌中较低透明质酸合成的问题。
[0011] 本发明用一种表达透明质酸合成酶基因（hyaluronic acid synthase Has）和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因（UDP-glucose Dehydrogenase）的高效产透明质酸工程大肠杆菌来生产透明质酸。
[0012] 含有透明质酸合成酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的高效产透明质酸工程大肠杆菌是通过以下方法构建获得的：
[0013] （1）构建表达透明质酸合成酶基因Has的载体， 具体是将PCR克隆的Has连接入大肠杆菌的表达载体(如pQE80l)中；
[0014] （2）构建表达尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的载体，将PCR克隆的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因连接入大肠杆菌的表达载体(如pQE80l)中；
[0015] （3）构建含有透明质酸合成酶基因Has,和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因,在大肠杆菌中共同表达的重组载体；以(2)中构建的含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因表达载体为PCR的模板，扩增含驱动子（如T5）驱动kfiD表达的PCR产物，并连入（1）中构建的表达透明质酸合成酶基因Has的表达载体中而获得含有透明质酸合成酶基因Has和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因，且能在大肠杆菌中共同表达的重组载体。
[0016] （4）将（3）中获得含有透明质酸合成酶基因Has 和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体,转化大肠杆菌（如JM109菌株），经筛选而获高效产透明质酸的工程大肠杆菌。
[0017] 本发明中所用的含有透明质酸合成酶基因Has和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的高效产透明质酸的工程大肠杆菌是pHK/JM109 ，分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏号为CGMCC No.3926，于2010年6月17日在中国北京市的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏。
[0018] 所述的高效产透明质酸的工程大肠杆菌CGMCC NO:3926中所述的透明质酸合成酶基因Has 来源于多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因PmHas；所述的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因来源于大肠杆菌k5菌株中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD。所述的表达载体宿主菌株，大肠杆菌JM109购于Promega 公司。
[0019] 通过共表达透明质酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的工程大肠杆菌pHK/JM109，并使其利用简单糖类（如葡萄糖）合成透明质酸。
[0020] 为进一步提高本发明工程大肠杆菌生产透明质酸的产量，通过改变发酵培养的通气条件，培养基中添加氮乙酰葡萄胺、柠檬酸等发酵底物而使得透明质酸的产量得到了大量提高。
[0021] 用工程大肠杆菌pHK/JM109生产透明质酸的方法如下：
[0022] （1）摇瓶培养合成
[0023] 摇瓶培养合成：
[0024] 在500ml 三 角 瓶中，以 总 体 积100ml-500ml 含25-50 mM K2HPO4•3H2O, pH6.5-7.2，2-4mM g/L MgSO4•7H2O, 20-40 mM/L 柠檬酸, 1-2 mM MnCl2, 300-400 mM 葡萄糖50-75 mM 氮乙酰葡萄糖胺,5-10 mM 乳糖、10-30 g/L 甘油、3-5g/L Casamino acid(酪蛋白酸水解物)的体系中加入已表达pmHas 和kfiD的pHK/JM109，使菌体细胞浓度达4-5%（W/V）, 发酵条件为30-33 ℃，250 rpm，并用28% V/V（以下同）的氨水调节pH至中性，发酵反应时间为30-36小时。
[0025] 经测定HA含量可达0.75-1 g/L左右（图1）。因HA的合成需氧及较稳定的pH,为进一步提高工程菌的产量，本发明进行了发酵罐HA合成的培养。
[0026] （2）发酵罐培养合成：
[0027] 从（氨苄青霉素）Amp50-100ug/ml+Km（卡纳霉素）25-100ug/ml的LB平板上挑起3-5经划线并过夜培养的pHK/JM109单菌落，置于100ml TB培养基(Terrific Broth：12 g/L 蛋白胨（Tryptone），24 g/L 酵母提取物（Yeast extract），9.4 g/L K2 HPO4 和2.2 g/L KH2PO4，pH6.8）过夜培养；该培养物经离心收集菌体，菌体用20-50ml TB悬浮，全部转入
1-5L的发酵罐，发酵罐培养基为TB培养基并含Amp50- 100 ug/ml+Kmn25-100 ug/ml，总体积为600-3000 ml，控制温度37 ℃，转速1200 rpm, 通入流量为60 ml/min 的混合气体（氧气：空气1：10 v/v），即氧气：空气1：10 v/v，并用8% V/V氨水及4 mol/L HCl 调节pH至6.8-7.2 ，培养4 小时，当培养物OD600达到5时，加入IPTG使其终浓度达0.5-1 mM，同时将反应温度调节至30-33 ℃培养2 小时，此时加入50% W/V葡萄糖和10% W/V磷酸铵 pH6.8 ，使发酵液中葡萄糖和磷酸铵含量分别为50 g/L和1 g/L, 30 ℃培养10 小时后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸铵使其浓度分别为0.5 mM、50 g/L和1 g/L，混合液30 ℃培养14－30小时后完成发酵，得到2-2.5 g/L浓度的透明质酸。
1-5L的发酵罐，发酵罐培养基为TB培养基并含Amp50- 100 ug/ml+Kmn25-100 ug/ml，总体积为600-3000 ml，控制温度37 ℃，转速1200 rpm, 通入流量为60 ml/min 的混合气体（氧气：空气1：10 v/v），即氧气：空气1：10 v/v，并用8% V/V氨水及4 mol/L HCl 调节pH至6.8-7.2 ，培养4 小时，当培养物OD600达到5时，加入IPTG使其终浓度达0.5-1 mM，同时将反应温度调节至30-33 ℃培养2 小时，此时加入50% W/V葡萄糖和10% W/V磷酸铵 pH6.8 ，使发酵液中葡萄糖和磷酸铵含量分别为50 g/L和1 g/L, 30 ℃培养10 小时后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸铵使其浓度分别为0.5 mM、50 g/L和1 g/L，混合液30 ℃培养14－30小时后完成发酵，得到2-2.5 g/L浓度的透明质酸。
[0028] 在发酵罐中进行HA的生产，细胞浓度得到极大的提高，OD600可达25-30，HA 含量获2-3g/L,大大提高了合成能力，为规模化生产准备了条件（见图1）。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0030] 1、本发明的工程大肠杆菌能产透明质酸2g/L～2.5g/L,比现有技术中通过大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas 和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的seHas基因获得的最高约0.2g/L的透明质酸产量提高近10倍。）[0031] 2、本发明第一次用在革兰氏阴性菌来源的透明质酸合成酶基因pmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD在革兰氏阴性宿主中表达来生产透明质酸。
附图说明
[0032] 图1是本发明的高效产透明质酸大肠杆菌ｐＨＫ/ＪＭ１０９合成透明质酸后的形态变化图，其中：A,C: pQE80l /JM109（对照菌株）分别用普通显微镜和环境扫描电镜（ESEM）的观测；B,D: pHK/JM109分别用普通显微镜和环境扫描电镜（ESEM）的观测；B中a,b,c,d:显示透明质酸合成后，菌体变大，两细菌个体间相互粘联的状况。
[0033] 图2是本发明的通过三角瓶培养发酵过程中HA积累变化图；图中显示pHK/JM109产透明质酸能力大于pQHK/JM109，而空载体菌株无透明质酸的产生。
[0034] 图3是本发明菌株pHK/JM109发酵纯化过程中透明质酸（HA）在上清中的富积图，A:pHK/JM109,B:对照（pQE80l/JM109）无透明质酸生成。
[0035] 图4是本发明中经摇瓶发酵生产最佳透明质酸工程菌株pHK/JM109，在发酵罐中发酵后细胞浓度、透明质酸的积累及底物的消耗变化图。图中显示细胞浓度得到极大的提高，OD600可达25-30，HA 含量获2-2.5g/L,大大提了合成能力，为规模化生产准备了条件。
具体实施方式
[0036] 实施例1
[0037] pHK/JM109中透明质酸的摇瓶培养合成：
[0038] 在500ml 三角瓶中，以总体积100ml 含50 mM K2HPO4•3H2O,（pH7.0） 4mM g/L MgSO4•7H2O, 20mM/L 柠檬酸, 1mM MnCl2, 300mM 葡萄糖50 mM 氮乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）, 10mM 乳糖 、10g/L 甘油、5g/LCasamino acid（水解酪蛋白氨基酸）的体系中加入已表达pmHas 和kfiD的pHK/JM109, 使菌体细胞浓度达5%（W/V），发酵条件为30℃，250rpm ，并用28%（V/V）的氨水调节pH至中性，发酵反应时间为36小时。经测定HA含量可达0.75-1 g/L左右（见图2）。
[0039] 实施例2
[0040] 在2500l 三角瓶中，以总体积500ml 含25 mM K2HPO4•3H2O,（pH6.5） 2mM g/L MgSO4•7H2O, 40mM/L 柠檬酸, 2mM MnCl2, 400mM 葡萄糖75 mM 氮乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）,5mM 乳糖、30g/L 甘油、3g/L水解酪蛋白氨基酸（Casamino acid）的体系中加入已表达pmHas和kfiD的pHK/JM109，使菌体细胞浓度达4%（W/V）, 发酵条件为33℃，250rpm ，并用28%（V/V）的氨水调节pH至中性，发酵反应时间为30小时。
[0041] 经测定HA含量可达0.7-8.5 g/L左右。因HA的合成需氧及较稳定的pH,为进一步提高工程菌的产量，本发明进行了发酵罐HA合成的培养。
[0042] 实施例3
[0043] pHK/JM109中透明质酸的发酵罐培养合成：
[0044] 从Amp100ug/ml+Km100 ug/ml的LB平板上挑起3-5个经划线并过夜培养的pHK/JM109单菌落，置于100ml TB培养基(Terrific Broth):12 g/L 胰化蛋白胨（Tryptone），24 g/L 酵母提取物（Yeast extract），9.4 g/L K2 HPO4 和2.2 g/L KH2PO（4 pH6.8)，过夜培养。该培养物经离心收集菌体，菌体用20ml TB悬浮，全部转入1L的发酵罐（Bioreactor, BIOSTAT Bplus Sartoris BBI system 德国产品 ）。发酵罐培养基为TB含氨苄青霉素（Amp）100ug/ml+卡那霉素（Km）100 ug/ml，总体积为600ml 。控制温度37℃，转速1200rpm, 通入流量为60ml/min 的混合气体（氧气：空气1：10 v/v，），并用28% 氨水及4 mol/L HCl 自动调节pH至6.8。培养约4小时，当培养物OD600达5时，加入IPTG使其终浓度达1mM，同时将反应温度调节至30℃培养2小时以诱导pmHas 和kfiD的表达，此时加入50%（W/V）葡萄糖和10%（W/V）磷酸铵（pH6.8）使发酵液中葡萄糖和磷酸铵含量分别为50g/L和1g/L, 30℃培养10个小时后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸铵使其浓度分别为0.5mM、50g/L和
1g/L，混合液30℃培养14小时后，完成共30小时发酵反应,获得平均约为2-3 g/L HA.[0045] 实施例4
1g/L，混合液30℃培养14小时后，完成共30小时发酵反应,获得平均约为2-3 g/L HA.[0045] 实施例4
[0046] pHK/JM109中透明质酸的发酵罐培养合成：
[0047] 从Amp50ug/ml+Km25 ug/ml的LB平板上挑起3-5个经划线并过夜培养的pHK/JM109单菌落，置于100ml TB培养基(Terrific Broth):12 g/L 胰化蛋白胨（Tryptone），24 g/L 酵母提取物（Yeast extract），9.4 g/L K2 HPO4 和2.2 g/L KH2PO（4 pH6.8)，过夜培养。该培养物经离心收集菌体，菌体用50ml TB悬浮，全部转入5L的发酵罐（Bioreactor, BIOSTAT Bplus Sartoris BBI system 德国产品）。发酵罐培养基为TB含氨苄青霉素（Amp）
50ug/ml+卡那霉素（Km）25 ug/ml，总体积为3000ml 。控制温度37℃，转速1200rpm, 通入流量为300ml/min 的混合气体（氧气：空气1：10 v/v，），并用28% 氨水及4 mol/L HCl 自动调节pH至7.2。培养约4小时，当培养物OD600达5时，加入IPTG使其终浓度达1mM，同时将反应温度调节至33℃培养2小时以诱导pmHas 和kfiD 的表达，此时加入50%（W/V）葡萄糖和10%（W/V）磷酸铵（pH6.8），使发酵液中葡萄糖和磷酸铵含量分别为50g/L和1g/L, 30℃培养10个小时后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸铵使其浓度分别为0.5mM、50g/L和
1g/L，混合液30℃培养14小时后，完成共30小时发酵反应,获得平均约为2-3 g/L HA.[0048] 从图4可见，在发酵罐中进行HA的生产，细胞浓度得到极大的提高，OD600可达
25-30，HA 含量获2-2.5g/L,大大提了合成能力，为规模化生产准备了条件。
50ug/ml+卡那霉素（Km）25 ug/ml，总体积为3000ml 。控制温度37℃，转速1200rpm, 通入流量为300ml/min 的混合气体（氧气：空气1：10 v/v，），并用28% 氨水及4 mol/L HCl 自动调节pH至7.2。培养约4小时，当培养物OD600达5时，加入IPTG使其终浓度达1mM，同时将反应温度调节至33℃培养2小时以诱导pmHas 和kfiD 的表达，此时加入50%（W/V）葡萄糖和10%（W/V）磷酸铵（pH6.8），使发酵液中葡萄糖和磷酸铵含量分别为50g/L和1g/L, 30℃培养10个小时后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸铵使其浓度分别为0.5mM、50g/L和
1g/L，混合液30℃培养14小时后，完成共30小时发酵反应,获得平均约为2-3 g/L HA.[0048] 从图4可见，在发酵罐中进行HA的生产，细胞浓度得到极大的提高，OD600可达
25-30，HA 含量获2-2.5g/L,大大提了合成能力，为规模化生产准备了条件。
[0049] 透明质酸的提取与分离：
[0050] 上述发酵生产的反应混合物，加入1/10体积20% 十六烷基溴化乙胺( Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide CTAB)和2倍体积的无水乙醇，混匀后放置10min 。用14000rpm 离心10分钟取沉淀。（有时因透明质酸含量过高，溶液分为三层（见图3），透明质酸不易沉淀，这种情况下可适当对初始的反应混合物进行稀释）。沉淀再次用1倍体积，1M的氯化钠在42℃悬浮提取约2小时，12000rpm离心收集上清液，相应沉淀再次用1/10体积
1M的氯化钠重悬10min后，重悬混合再次离心，上清溶液合并后丢弃沉淀。合并的上清溶液加入2.5倍的无水乙醇，混匀，放置5分钟，离心取沉淀，沉淀用70%乙醇洗涤后，干燥或重溶于1M NaCl溶液中用于HA含量及分子量测定。
1M的氯化钠重悬10min后，重悬混合再次离心，上清溶液合并后丢弃沉淀。合并的上清溶液加入2.5倍的无水乙醇，混匀，放置5分钟，离心取沉淀，沉淀用70%乙醇洗涤后，干燥或重溶于1M NaCl溶液中用于HA含量及分子量测定。
[0051] pHK/JM109合成透明质酸后菌体形态的观测：
[0052] 在HA 合成的反应体系中取大约2μl混合物，置于载玻片上让液体风干，风干的细菌用0.1%多染试剂染色5分钟（多染试剂，Stains all为Sigma产品,http://www.sigmaaldrich.com）该染液用溶剂（甲酰胺：异丙醇，v/v7:3）配制。染色后多余的燃料用蒸馏水冲洗后，直接1000X显微观查并用CCD收集图片。为进一步提高分辨率来观查透明质酸合成后细菌细胞的形态变化，反应体系中pHK/JM109细胞用环境扫描电镜（ESEM）进行直接观测。结果发现，HA的合成导致大肠杆菌菌体加粗,末端着色深、菌体粘联（图4）。在ESEM下对照细胞（pBQ/JM109）比较光滑，而HA 合成细胞（pHK/JM109）则表面粗糙（见图4）且菌体两端有明显的物质堆积，说明细胞合成了HA, 并积累于菌体表面上。从观测到的细菌两端着色深，推测两端可能是菌体活跃分泌HA的主要位点（见图1）。
[0053] 透明质酸的酶促降解鉴定：
[0054] 为进一步证实上述提取物确实为透明质酸，利用Sigma 公司从解透明质酸链霉菌（Streptomyces hyalurolyticus）中纯化的，能专一水解透明质酸的透明质酸酶（Sigma 产品货号：H 1136），进行水解，并用戴安公司（Dionex BioLC）离子交换型HPLC进行分析鉴定。以250mU酶/mgHA比例，37 ℃水解共10小时，分别于0、2.5 、5和10小时取样进行水解混合物中透明质酸4寡糖的生成检测。离子交换型HPLC分析的具体过程是，酶解混合样品经100℃、5min 终止反应，混合物经13000rpm离心,0.2uM的过滤器过滤后，上Dionex BioLC系统(Sunnyvale, CA，美国)进行分析，该系统用CarboPac PA20柱进行分离，电化学检测器（Dionex ED50 electrochemical detector）进行信号监测，该检测器的具体参设置为(waveform: t = 0.41 sec, p = -2.00 V; t = 0.42 sec, p = -2.00 V; t = 0.43 sec, p = 0.60 V; t = 0.44 sec, p = -0.10 V; t = 0.50 sec, p = -0.10 V). 分析过程中用从Sigma 公司购买的寡糖，Oligo-HA4，（产品号：O9140-5MG）为标准品进行鉴定（Dionex BioLC系统分析的出峰时间约为15min）。层析的流动项为A 溶液（脱气处理的200 mM NaOH， B溶液（脱气处理含 200 mM NaOH 和1M NaCl），流速为 0.5 ml/min，在整个分析过程中A液和B液均用惰性气体氦充气，且梯度洗脱过程中各自的比例关系变化如下: t = 0 min, 5:95 (A液: B液，下同); t = 5 min, 5:95; t = 10 min, 20:80; t = 20 min, 20:80; t = 21 min, 100:0; t = 30 min, 100:0; t = 35 min, 5:95; t = 50 min。由表1可知，所提取物质能被专一降解透明质酸，来源于解透明质酸链霉菌（Streptomyces hyalurolyticus）的透明质酸酶所降解。从而确证pmHas 和kfiD在大肠杆菌中高效表达，使天然条件下不能合成HA 的大肠杆菌JM109菌株转变HA合成菌株。
[0055]
[0056] 透明质酸含量的测定：
[0057] 常规的透明质酸的分析方法用Bitter 等人（Bitter T et al, A modified uronic acid carbazole reaction .Anal. Biochem. 1962 4, 330–334. ）的咔唑（carbazole）分析方法。该方法中透明质酸的含量由其水解产物，葡萄糖醛酸（ glucuronic acid），的含量来计算。具体过程取经不同稀释的样品1 mL。在冰水浴中加入6 mL浓硫酸，摇匀后，放于85 ℃水浴中保持20 min，然后取出置于冰上冷至室温，加0.2 mL咔唑液(50 mg咔唑溶于50 mL 95%乙醇)，置于100 ℃水浴中保持10 min后，取出置于冰上冷至室温，测定530 nm的吸收. 标准曲线用sigma 公司葡萄糖醛酸标准样品制作。上述常规测定方法通过透明质酸结合蛋白的免疫分析方法来加以校正。具体采用透明质酸放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所产品，http://www.bnibt.com，）来分析，该分析试剂盒采用竞争放射免疫分析法，即标准或待测样品中的HA和125I-HA共同与限量的透明质酸结合蛋白（HABP）在适宜的条件下进行竞争性结合反应。一部分125I-HA与HABP结合形成复合物，而另一部分呈游离状态。125I-HA与HABP结合的比例取决于标准或待测样品中非标记HA的含量，非标记HA的含量越高，125I-HA与HABP形成的复合物越少。HA-HABP复合物与HABP抗体和第二抗体形成交联的聚合物沉淀下来，测定沉淀物的放射性计数。经过数据处理后可获得标准曲线及回归方程，从标准曲线上查出被测样品的HA含量。通过校正后开始用咔唑（carbazole）分析方法进行日常分析。分析结果显示摇瓶发酵透明质酸浓度可达05g/L而发酵罐或生物反应器中发酵可使浓度达2.5g/L。
[0058] 透明质酸分子量分布的测定：
[0059] 为进行HA分子量分布的测定，上述透明质酸的提取与分离，溶于1M氯化钠透明质酸，加入1/10体积 3M乙酸纳（pH5.5）,等体积酚：氯仿（(1:1v/v)抽提一次后,水相加入2.5倍乙醇沉淀透明质酸，沉淀物重溶于0.5M 乙酸和 0.3 M Na2SO4 中后，用水相凝胶排阻层析((ASEC, aqueous size exclusion chromatography)方法来测定HA的分子量。具体分析是在岛晶 （Shimadzu） HPLC系统上进行，用Viscotek TSK Viscogel PWXL 保护柱，G3000，G4000 和G6000 共串联作为分析柱，以 RID-10A折射率检测器(refractive Index detector)检测信号。层析的流动相组成为 0.5M 乙酸和 0.3 M Na2SO4，流速由岛晶LC-20AD溶剂传递系统控制为 0.6 mL/min.因缺乏已知，不同分子量的透明质酸标准分子，用从sigma 公司购买，40-2000kD的 葡聚糖（具体Dextran分别是产品号31389， Mw ～
40,000 (Sigma)， 产品号31390 Mw ～70,000 (Sigma) ，产品号09184， Mw ～100,000 (Fluka) 和产品号95771 Mw ～2,000,000 (Sigma)）为标准分子量来制作标准曲线后，并用分子量已知透明质酸（Select-HA™ Hyaluronan 150K, mol wt 125-175 kDa， sigma产品号S0201-1MG） 来进行校正后，估测本发明的工程大肠杆菌所生产的透明质酸的分子量范围。分析结果表明本发明的工程大肠杆菌生产的透明质酸平均分子量在130-150kD之间，但相对于Sigma公司透明质酸，本发明的工程大肠杆菌合成的透明质酸的分子分布范围（Mw/Mn）约4-4.5大于Sigma标准透明质酸2.9（ 见表2）。
40,000 (Sigma)， 产品号31390 Mw ～70,000 (Sigma) ，产品号09184， Mw ～100,000 (Fluka) 和产品号95771 Mw ～2,000,000 (Sigma)）为标准分子量来制作标准曲线后，并用分子量已知透明质酸（Select-HA™ Hyaluronan 150K, mol wt 125-175 kDa， sigma产品号S0201-1MG） 来进行校正后，估测本发明的工程大肠杆菌所生产的透明质酸的分子量范围。分析结果表明本发明的工程大肠杆菌生产的透明质酸平均分子量在130-150kD之间，但相对于Sigma公司透明质酸，本发明的工程大肠杆菌合成的透明质酸的分子分布范围（Mw/Mn）约4-4.5大于Sigma标准透明质酸2.9（ 见表2）。
[0060]
[0061] 备注：* 商品化从 HA sigma， Mw:多聚体的平均分子量（ weight average of polymer）， Mn: 多聚体的平均数（ number average of polymer），Mw/Mn:多聚物的分子分布范围 。
[0062] 以上表明，在大肠杆菌中通过表达透明质酸合成酶pmHas和鸟苷二磷酸脱氢酶基因 kfiD，在表达细胞上积累了HA并导致外观结构的改变；工程菌在普通三角瓶中发酵培养能获得约1g/L HA 含量,用较优化的发酵罐培养，大大提了合成能力，能获2-2.5g/L HA 含量,生产透明质酸能力明显优于以前报道的合成透明质酸的大肠杆菌工程菌株。
[0063] 以上所述的高效产透明质酸工程大肠杆菌（pHK/JM109）按以下方法制备：
[0064] （1）构建含有透明质酸合成酶基因的表达载体pQEpmHas，用PCR扩增方法克隆源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因（Pasteurella multocidahyaluronic acid synthase PmHas）， 其PCR扩增克隆所用引物设计如下:
[0065] 上游引物pmHas P1 为 5'-TAGGATCCATGAACACATTATCACAAGCAAT-3'，(序列表中SEQ ID No:3) 含Bam H I位点GGATCC和起始密码子ATG；
[0066] 下游引物为pmHasP2 为 5'-TAGAGCTCTTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3' (序列表中SEQ ID No:4)，含Sac I位点GAGCTC和终止密码子TAA；
[0067] PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经Bam H I和Sac I双酶切后,连接入商用载体pQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA 测序确证无突变后,将所获载体命名为pQEpmHas，基因为pmHas（序列表中SEQ ID No:１）[0068] （2）构建含尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的表达载体pQEkfiD，用PCR扩增方法克隆源自源于大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）菌株k5（E. coli Ｋ５）中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因（K5 capsule gene D，kfiD），扩增的引物设计如下:
[0069] 上游引物KfiD P1: 5'- TGGAGATCTATGTTCGGAACACTAAAAATAACT G-3'(序列表中SEQ ID No:5)，含Bgl II 位点AGATCT，和起始密码子ATG)；
[0070] 下游引物kfiD P2： 5'-TTCTCGAGTTAGTCACATTTAAA CAAATCGCGAC-3'(序列表中SEQ ID No:6)，含Xho I位点CTCGAG和终止密码子TAA ；
[0071] PCR的模版为大肠杆菌菌k5菌株ATCC 23500的基因组ＤＮＡ,成功扩增并纯化的产物, 经Ｂgl II和Xho I双酶切后,连接入Qiagen 公司的商用载体pQE80L的Bam H I和Sal I位点,所得载体经DNA 测序分析确证插入片段无突变后，所获载体命名为pQEkfiD，相应基因命名为kfiD基因（序列表中SEQ ID No:2）；
[0072] （3）构建大肠杆菌中共同表达透明质酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体：
[0073] 根据构建好的pQEkfiD载体的DNA 序列设计PCR引物，扩增T5 启动子驱动kfiD表达的片段 T5:kfiD，具体引物序列设计如下：
[0074] 上游引物T5kfiD P1：5'-TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCACGTCGAGA-3'（序列表中SEQ ID No:7），该引物含有 Sac I 位点,GAGCTC，其中下标G 表示将原始pQE80L载体中C突变为G，以消除其Xhol 位点,CTCGAG；
[0075] 下游引物T5kfiD P2：5'-TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'（序列表中SEQ ID No:8），该引物含 Xho I site, CTCGAG ；
[0076] PCR的模版用pQEkfiD载体，纯化的T5:kfiD扩增产物, 首先连接入pGEM-T-Vector（Promega 产品， www.promega.com） 并转化大肠杆菌JM109菌株，获中间载体pT-T5KfiD，该载体中T5:kfiD（序列表中SEQ ID No:9）片段，经测序分析证实核苷酸顺序无突变后，该插入T5:kfiD（片段经Sac I和Xho I 双酶切后,连接入表达载体pQEpmHas的Sac I和sal I 位点而获pmHas 和kfiD基因在大肠杆菌中共表达的重组载体pQHK ； [0077] （4）pHK的构建
[0078] 根据德国MoBiTec公司的革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)设计引物：
[0079] 上游引物PBBR P1:5'-TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中SEQ ID NO：10)；含有SalI酶切位点，GTCGAC
[0080] 下游引物PBBR P1：5'-TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3' (序列表中SEQ ID NO：11) ，含有SalI酶切位点，GTCGAC)；
[0081] 用上述引物扩增质粒pBBR122中包含其复制位点及卡那霉素抗性基因在内的片段，PCR 扩增的参数为：95℃、2 min , 1个循环；94℃，30s, 55℃、30s， 72℃、3 min , 25个循环；72℃、10 min 1个循环，纯化约3.2 kb扩增产物,用Sal I 酶解后，加入连接酶让其自连，自身连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，并用卡那霉素筛选获质粒pRP(序列表中SEQ ID NO：12)，提取质粒pRP,经SalI酶解后，连接入上述能在大肠杆菌中共表达pmHas和kfiD基因的pQHK的XhoI 位点，而获在革兰氏阴性菌中共表达pmHas 和kfiD来合成透明质酸的表达载体pHK；
[0082] （5）将该重组载体pHK转入大肠杆菌JM109中获得所述的高效产透明质酸的工程大肠杆菌pHK/JM109（CGMCC NO:3926）。
[0083] 以上所述的大肠杆菌菌株ｐＨＫ/JM109为高效产透明质酸工程大肠杆菌, 其中pHK为表达载体，其宿主菌株为E.coli JM109 。
[0084] 本发明所涉及的DNA序列说明：
[0085] 序列表中SEQ ID NO：1所示的是源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida 中的透明质酸合成酶基因pmHas 编码区核苷酸序列。
[0086] 序列表中SEQ ID NO：2所示的是源自大肠杆菌k5菌株（中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD 的编码区核苷酸序列。
[0087] 序列表中SEQ ID NO：3所示的是克隆源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因pmHas 的上游引物的碱基序列。
[0088] 序列表中SEQ ID NO：4所示的是克隆源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因PmHas 的下游引物的碱基序列。
[0089] 序列表中SEQ ID NO：5所示的是克隆源于大肠杆菌k5菌株中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的上游引物的碱基序列。
[0090] 序列表中SEQ ID NO：6所示的是克隆源于大肠杆菌k5菌株中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的下游引物的碱基序列。
[0091] 序列表中SEQ ID NO：7所示的是克隆T5:kfiD片段的上游引物的碱基序列。
[0092] 序列表中SEQ ID NO：8所示的是克隆T5:kfiD片段的下游引物的碱基序列。
[0093] 序列表中SEQ ID NO：9 所示的是T5:kfiD片段的核苷酸序列。
[0094] 序列表中SEQ ID NO：10所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及复制必需片段的上游引物的碱基序列。
[0095] 序列表中SEQ ID NO：11所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及复制必需片段的下游引物的碱基序列。
[0096] 序列表中SEQ ID NO：12所示的是质粒pRP的核苷酸序列。
[0097] 本发明涉及的遗传资源：
[0098] 1：多杀巴斯徳菌株ATCC15742（ Pasteurella multocida subsp. multocida (Lehmann and Neumann) Rosenbusch and Merchant）；遗传资源取自：美国典型培养物保存中心（ATCC）；获取方式：购买，价格225美金；获取时间：2008年1月；原始来源：美国科学家KL Heddleston从火鸡心脏中分离，获取时间： 1962年 4月
[0099] 2：大肠杆菌K5 菌株ATCC23500（Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers ，serotype O2a,2b:K5(L):H4；遗传资源取自：美国典型培养物保存中心（ATCC）获取方式：购买，价格225美金，获取时间：2008年9月 原始来源：美国疾病控制中心（CDC）科学家Kauffmann从人尿中分离，及获取时间： 1943年 7 月。