一种诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒及制备与使用方法

摘要

本发明公开一种检测马属动物是否感染驽巴贝斯虫病的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒中至少有四条驽巴贝斯虫特异性引物组成。本发明的检测试剂盒使用方法是以待测马属动物血液提取血液基因组DNA为模板，将其与DNA聚合酶、缓冲液、灭菌超纯水以及试剂盒中的驽巴贝斯虫特异性引物混合物按比例混合均匀后，进行环介导的恒温扩增，扩增产物置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳，在紫外灯下观察，根据特定泳道是否出现特异性电泳带型确定被检动物是否患有驽巴贝斯虫病。

权利要求

1.一种诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒，检测试剂盒中包括有四条驽巴贝斯虫特异性引物，这四条引物的序列分别是：上游外侧引物为序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列Bc F3；下游外侧引物为序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列Bc B3；及上、下游内引物，其特征在于经过优化的两条内引物的序列特征是：上游内引物Bc FIP为序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列Bc FIP-I；下游内引物Bc BIP为序列表中SEQ ID NO：8的核苷酸序列BcBIP-I。

说明书

一种诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒及制备与使用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种动物寄生虫的检测鉴别技术，确切讲本发明提供一种快速鉴别诊断被检马属动物是否感染驽巴贝斯虫病的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。

背景技术

[0002] 驽巴贝斯虫(Babesia caballi Nutall et Strickland，1910)(旧名马焦虫，proplasma caballi)是原生动物门(Protozoa)、顶复动物亚门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoea)、梨形虫亚纲(Piroplasmia)、梨形虫目(Piroplasmida)中的巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)的一个成员。驽巴贝斯虫是马梨形虫病的病原之一，所引起马属动物的疾病称为驽巴贝斯虫病，是经节肢动物——蜱作为媒介传播的、寄生于马属动物(包括马、驴、骡和斑马)的红细胞内，引起动物高热、贫血、黄疸、出血、呼吸困难、消瘦和体表淋巴结肿胀为特征的一类血液原虫性寄生虫病。国际兽疫局(Office International Des Epizooties，OIE)将其列为B类疫病(OIE.Equine piroplasmosis.2008)，我国将其列为二类疫病。马梨形虫病的病原包括驽巴贝斯虫和马泰勒虫(Theileria equi Mehlhorn，Schein1998，旧名纳氏焦虫)。在我国，驽巴贝斯虫病主要流行于东北、内蒙古东部、青海及新疆等地，已证实的主要传播媒介是革蜱属的草原革蜱、森林革蜱、银盾革蜱、中华革蜱(汪明主编.兽医寄生虫学[M].北京：中国农业出版社，2008：366-369)。本病的季节流行性很强，多呈急性经过为主，发病率和死亡率均很高，尤其对外来引进的马属动物、纯种马以及杂交马的危害更大，是制约发展中国家马属动物养殖产业发展的主要疾病之一。目前，驽巴贝斯虫病的诊断主要有下列几种手段：(1)血涂片染色显微镜检测、淋巴结穿刺试验、体外培养、临床诊断和动物接种试验等。(2)血清学方法，如：补体结合试验(CFT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)等，但这些方法常会出现假阳性或漏检，参见Donnelly，J.，Phipps，L.P.，Watkins，K.L.，1982.Evidence of maternal antibodies to Babesia equi and B.caballi in foals of seropositive mares.Equine Vet.J.14，126-128.；Weiland，G.，Aicher，B.M.，Boch，J.，1984.Serodiagnosis and therapy control of equine piroplasmosis by CFT and IFAT.Berl.Munch.Tierarztl.Wochenschr.97，34134-34139.；Knowles Jr.，D.P.，Perryman，L.E.，Goff，W.L.，Miller，C.D.，Harrington，R.D.，Gorham，J.R.，1991.A monoclonal antibody defines a geographically conserved surface protein epitope of Babesia equi merozoites.Infect.Immun.59，2412-2417.； R.，Jorgensen，W.K.，Dalgliesh，R.J.，Friedhoff，K.T.，de Vos，A.J.，1995.Current state and future trends in the diagnosis of babesiosis.Vet.Parasitol.57，61-74.；Brüning，A.，Phipps，P.，Posnett，E.，Canning，E.U.，1997.Monoclonal antibodies against B abesia caballi and B abesia equi and their application in serodiagnosis.Vet.Parasitol.68，11-26.；Kappmeyer，L.S.，Perryman，L.E.，Hines，S.A.，Baszler，T.V.，Katz，J.B.，Hennager，S.G.，Knowles，D.P.，1999.Detection of equine antibodies to Babesia caballi by recombinant B.caballi rhoptry-associated protein 1in a competitive-inhibition enzyme-linked immunosorbent assay.J.Clin.Microbiol.37，2285-2290.。(3)分子检测技术，如PCR、巢氏PCR技术、多重PCR和反向线状印迹杂交技术(RLB)等，与常规的方法相比具有敏感性高、特异性强、检出率高等优点，具体参见BASHIRUDDIN J.B.，CAMMA C.& REBELOE.(1999).Molecular detection of Babesia equi and Babesia caballi in horse blood bv PCR amplification of part of the 16S rRNA gene.Vet.Parasitol.，84，
75-83；SAHAGUN-RUIZ A.，WAGNELA S.D.，HOLMAN P.J.，CHIEVES L.P.&WAGNER G.G.(1997).Biotin-labeled DNA probe in a PCR-based assay increases detection sensitivity for the equine hemoparasite Babesia caballi.Vet.Parasitol.，73，53-63。但是以上两类方法都有一个不可避免的缺点——需要先进、昂贵的仪器和专业培训的技术人员，而且检测过程耗时较多，故需要研究出一种简单、方便、实用的方法来鉴别诊断驽巴贝斯虫病，这在临床诊断、治疗和研究中有着重要的特殊意义。

发明内容

[0003] 本发明提供一种可快速鉴别诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒，同时提供这种试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒及使用方法可克服现有技术的不足，无需昂贵的仪器，且检测敏感性较高，同时操作技术相对简单、快速，可以在普通实验室条件下实施全部检测过程。

[0004] 本发明的诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒中至少有四条驽巴贝斯虫特异性引物组成，这四条引物是：上游外侧引物为序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列Bc F3；下游外侧引物为序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列Bc B3；上游内引物Bc FIP是由序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列Bc F1c与序列表中SEQID NO：4的核苷酸序列的上游中间引物Bc F2经连接子L1连接而成的；下游内引物Bc BIP是由序列表中SEQ ID NO：5的核苷酸序列Bc B1c与序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列的下游中间引物Bc B2经连接子L2连接而成的，连接子L1和L2是由4～6个核酸碱基组成。连接子L1和L2可以相同，也可以不同，只要满足一定的条件即可，即：加入连接子后，不影响引物特异性，也不会产生影响扩增效率的各种二级结构。在目的基因中，各引物对应的具体序列见表1，各引物相互位置关系示意图和引物结构组成示意图请见附图1。

[0005] 本发明中已验证的一个优化组合是：上游外侧引物Bc F3；下游外侧引物Bc B3；上游内引物Bc FIP为序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列Bc FIP-I；下游内引物Bc BIP为序列表中SEQ ID NO：8的核苷酸序列BcBIP-I

[0006] 本发明中各个驽巴贝斯虫特异性的引物的具体序列见表1。

[0007] 表1本发明中各个驽巴贝斯虫特异性引物的具体序列

[0008]Bc F3： 5’-GTCGGGGATTGATTTTTGCA-3’
Bc B3： 5’-TTCACAAAACTTCCCAAGGC-3’
Bc F2 5’-CGAGGAATGCCTAGTATGCG-3’
Bc F1c 5’-GTGTACAAAGGGCAGGGACGTA-3’
Bc B2 5’-GACGAATCGGAAAAGCCAC-3’
Bc B1c 5’-CGTCGCTCCTACCGATCGAG-3’
BcFIP-I： 5’-GTGTACAAAGGGCAGGGACGTAGAATTCGAGGAATGCCTAGTATGCG-3’
Bc BIP-I： 5’-CGTCGCTCCTACCGATCGAGAATTCGACGAATCGGAAAAGCCAC-3’
备注：引物序列中划横线部分的序列为连接子。

[0009] 为方便使用，本发明的诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒中还可以再分别放置有LAMP反应缓冲液、DNA聚合酶和灭菌纯超水。这些分别放置的试剂可在具体的使用时按使用要求配比。

[0010] 在具体的实施例中是放置了如下内容：

[0011] a)标准驽巴贝斯虫的基因组DNA；

[0012] b)标准马泰勒虫基因组DNA；

[0013] c)标准马梨形虫阴性(即，驽巴贝斯虫和马泰勒虫均呈阴性)的马基因组DNA；

[0014] d)标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA；

[0015] e)标准马梨形虫阴性的骡基因组DNA；

[0016] f)灭菌超纯水；

[0017] g)LAMP反应缓冲液；

[0018] h)DNA聚合酶；

[0019] 以及由40p mol的Bc FIP、Bc BIP与5p mol的Bc F3、Bc B3组成的驽巴贝斯虫特异引物混合物。

[0020] 本发明所述的诊断驽巴贝斯虫的检测试剂盒的使用方法是：以待测马属动物血液提取血液基因组DNA为模板，将其与DNA聚合酶、缓冲液、灭菌超纯水以及试剂盒中的驽巴贝斯虫特异引物混合物按比例混合均匀后进行环介导的恒温扩增，扩增后立刻灭活DNA聚合酶，取扩增产物以TAE为缓冲液，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳，在紫外灯下观察，根据特定泳道是否出现特异性电泳带型确定被检动物是否患有驽巴贝斯虫病。

[0021] 本发明实际上是采用环介导的恒温扩增技术(Loop-mediated isotheral amplification method，LAMP)的一种检测方法，这种方法是Notomi T.等日本科学家于2000年发明的敏感性很高的DNA扩增技术(Notomi T.，Okayama H.，Masubuchi H.，Yonekawa T.，Watanabe K.，Amino N.，Hase T.，2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research 28，E63.)。本发明鉴别驽巴贝斯虫的检测试剂盒及检测方法中是以18S rRNA基因为靶基因，设计出驽巴贝斯虫特异性的LAMP引物，以待检动物经采血后提取的血液基因组DNA为模板进行环介导的恒温扩增。采用本发明的方法鉴别诊断驽巴贝斯虫时不需要昂贵的仪器设备，只需要常规的离心机、水浴锅和简单的电泳设备就可以完成检测，可在普通的实验室实施，并且可得到具有敏感性高、特异性好的检测结果。

附图说明

[0022] 图1为本发明中各引物在目的基因中的相互位置关系及各扩增引物的组成示意图。

[0023] 图2为采用本发明中用驽巴贝斯虫特异性优化组合引物经环介导的恒温扩增后电泳检测的结果，其中：M为DNA标准分子量(Wide Range DNA Marker(100～6000))，1-6泳道分别对应的被检DNA样品为：1，标准驽巴贝斯虫阳性的马基因组DNA(标准阳性对照)；2，空白对照(灭菌超纯水)；3，标准马梨形虫阴性的马基因组DNA；4，标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA；5，标准马梨形虫阴性骡的基因组DNA；6，标准马泰勒虫基因组DNA。

具体实施方式

[0024] 以下提供本发明的最佳实施方式。

[0025] 本实施例的检测方法可在200μL或者50μL的离心管中进行，所使用的具体引物及试剂如下：

[0026] 1)驽巴贝斯虫特异引物：

[0027] Bc F3：5’-GTCGGGGATTGATTTTTGCA-3’；

[0028] Bc B3：5’-TTCACAAAACTTCCCAAGGC-3’；

[0029] Bc FIP-I：5’-GTGTACAAAGGGCAGGGACGTAGAATTCGAGGAATGCCTAGTATGCG-3’；

[0030] Bc BIP-I：5’-CGTCGCTCCTACCGATCGAGAATTCGACGAATCGGAAAAGCCAC-3’；

[0031] 2)驽巴贝斯虫特异性引物混合物(即，Bc LAMP引物预混液，含5p mol的Bc F3、Bc B3与40p mol的Bc FIP-I、Bc BIP-I)。

[0032] 3)2×LAMP 反 应 缓 冲 液 (40mM Tris-HCl(pH 8.8)，20mM KCl，16mMMgSO4，20mM(NH4)2SO4，0.2％Tween 20，1.6M betaine(甜菜碱)和2.5mM dNTP)。

[0033] 4)Bst DNA聚合酶(M0275L，BioLabs)。

[0034] 5)标准驽巴贝斯虫基因组DNA；

[0035] 6)标准马泰勒虫基因组DNA；

[0036] 7)标准马梨形虫阴性的马基因组DNA；

[0037] 8)标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA；

[0038] 9)标准马梨形虫阴性的骡基因组DNA；

[0039] 10)灭菌超纯水

[0040] 11)6×上样缓冲液(30mM EDTA，36％(V/V)甘油(Glycerol)，0.05％(W/V)溴酚蓝(Bromophenol Blue)，0.05％(W/V)二甲苯腈蓝(Xylene CyanolFF)的水溶液)。

[0041] 12)1×TAE缓冲液(0.04M Tris-乙酸，0.002M EDTA)。

[0042] 13)2％琼脂糖(用1×TAE缓冲液配制)

[0043] 14)10mg/mL溴化乙锭

[0044] 其具体的操作方法如下：

[0045] (一)标准驽巴贝斯虫基因组DNA的获得

[0046] 用液氮中保存的含驽巴贝斯虫活虫种的血液分别接种实验马属动物，当染虫率达到1％以上时，以20％枸橼酸钠为抗凝剂，静脉采血，将所采血液4℃条件下1000×g离心10分钟，弃去上清，尽量将白细胞吸弃。用2％枸橼酸钠洗涤三次(同前处理，1000×g离心
10分钟)，最后将上清去掉，红细胞分装入1.5mL离心管中，-20℃保存备用。由此血液提取基因组DNA后即获得标准驽巴贝斯虫基因组DNA。

[0047] (二)标准马泰勒虫基因组DNA的获得

[0048] 用液氮中保存的含马泰勒虫活虫种的血液分别接种实验马属动物，当染虫率达到1％以上时，同上处理。由此血液提取基因组DNA后即获得标准马泰勒虫基因组DNA。

[0049] (三)标准马梨形虫阴性的动物血液基因组DNA的获得

[0050] 经血涂片检查和PCR检测驽巴贝斯虫和马泰勒虫，长期(连续40天以上)均呈双阴性的马属动物，经静脉采集抗凝血，提取动物基因组DNA后获得标准马梨形虫阴性的动物血液基因组DNA，-20℃保存备用。由此血液提取基因组DNA后即获得标准马梨形虫阴性的动物血液基因组DNA。

[0051] (四)从血液中提取基因组DNA的方法

[0052] a)将300μL血液加入盛有900μL BRC Lysis Solution的1.5mL离心管中，颠倒10次，在室温孵育1至3分钟(即，红细胞要完全裂解，液体澄清透明)。

[0053] b)2000×g离心2分钟，小心弃去上清，保留下面的可见的白色沉淀和大约10～20μL液体，涡旋20秒混匀或用吸头吹打混匀。

[0054] c)每管中加入300μL Cell Lysis Solution，吹打混匀。

[0055] d)加入100μL Protein Preciptation Solution，蜗旋20秒混匀或用吸头吹打混匀，直至出现棕褐色沉淀颗粒。

[0056] e)13000×g离心3分钟后，将上清液移至标记过新的离心管中，加入300μL异丙醇，颠倒50次。

[0057] f)13000×g离心5分钟。弃上清，在洁净的滤纸上小心倒置，将残留的液体吸干。

[0058] g)加入300μL 70％乙醇。13000×g离心3分钟，小心除去上清液，用吸水纸吸干残留的液体。

[0059] h)室温或37℃空气干燥3-5分钟。

[0060] i)加入100μL DNA Hydration Solution，蜗旋5秒混匀或用吸头吹打多次。

[0061] j)65℃温育5分钟以溶解DNA。

[0062] k)然后室温摇动过夜或数小时，-20℃保存备用。

[0063] (五)2×LAMP反应缓冲液的准备

[0064] 首先应用灭菌的超纯水按照表2中比例配制无dNTP的2×LAMP反应缓冲储存液后，用0.45μm的滤器过滤。所配制的储存液可在4℃保存3个月，-20℃长期保存。

[0065] 表2无dNTP的2×LAMP反应缓冲储存液的配制及所需各试剂比例

[0066]试剂 总体积900mL 总体积90mL
1M Tris-Cl(pH 8.8) 40mL 4mL
KCl 1.49g 0.15g
MgSO4(MgSO4·7H2O) 1.93g(3.94g) 0.19g(0.39g)
(NH4)2SO4 2.64g 0.26g
Tween 20 2mL 0.2mL
Betaine (甜菜碱) 187.4g 18.7g

[0067] 使用前每900μL的2×LAMP反应缓冲液储存液中加入100μL 25mM dNTP，混匀，即制备成2×LAMP反应缓冲液，-20℃保存备用，可保存三个月以上。

[0068] (六)检测过程

[0069] 在50μL或200μL的离心管中按表3所述比例加入各试剂和待检样品DNA，同时设立标准阳性对照、标准阴性对照、空白对照和标准马泰勒虫基因组DNA对照。

[0070] 表3Bc LAMP反应所需各种试剂的添加比例及其标准检测结果

[0071]

[0072] 轻轻混匀，瞬间离心。在水浴锅中特定温度下(实验性筛选获得，本发明驽巴贝斯虫为65℃)扩增适当时间(实验性筛选获得，本发明中驽巴贝斯虫特异性引物的最佳扩增时间为40分钟，可延长至60分钟)，然后立刻在80℃水浴锅中灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)中，在75伏电压下进行核酸电泳检测。在紫外灯下观测并判定结果。

[0073] (七)检测实例及结果判定

[0074] 1.驽巴贝斯虫的检测：

[0075] 在6个200μL的离心管中按表3中比例分别加入各种试剂，同时设立标准阳性对照、标准阴性对照、空白对照和标准马泰勒虫基因组DNA对照，其中：Bc LAMP引物预混液为驽巴贝斯虫特异引物的混合物；在不同的反应管中的基因组DNA样品分别为驽巴贝斯虫基因组DNA、标准马梨形虫阴性的马基因组DNA、标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA、标准马梨形虫阴性骡的基因组DNA、马泰勒虫基因组DNA。全部加样完毕后轻轻混匀，瞬间离心；在恒温水浴锅中或PCR仪中65℃条件下扩增40分钟；然后立刻在80℃的条件下灭活酶2分钟；取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75伏电压条件下进行电泳检测，检测结果见附图1。结果表明只有驽巴贝斯虫基因组DNA对应的反应管(标准阳性)中能被特异性的扩增，出现特异性DNA条带，而马泰勒虫基因组DNA、马梨形虫虫阴性马属动物的基因组DNA及灭菌超纯水相对应的反应管中均没有出现特异性条带。

[0076] 在判定被检马属动物是否感染了驽巴贝斯虫时，用被检马属动物的血液基因组DNA经以上检测后，若电泳结果中出现与附图1中驽巴贝斯虫基因组DNA对应的反应管的结果(附图中标为1的电泳道)一致，同时所设的各种对照也一致，并且能排除被检动物DNA样品被驽巴贝斯虫基因组DNA及其反应产物污染时，可确定被检马属动物感染了驽巴贝斯虫。

[0077] 由以上的实例可见，本发明的检测试剂盒具有特异性好，且检测过程相对简单，最快可在2个小时内完成所有的检测过程，无需昂贵的仪器与设备。