多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒及制备方法

摘要

本发明公开一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，利用多重荧光定量PCR特异性检测方法，根据蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫种特异基因序列设计引物与探针，通过优化荧光定量PCR反应体系和条件来提高其敏感性，扩增同时可直接实时观察扩增结果。本发明可同时对三种重要水源性人兽共患原虫进行快速准确的检测，具有设计严谨，简单易操作，灵敏度高，特异性强，判定准确客观等特点。

权利要求

1. 一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，包括以下部分：（1）样本裂解液与DNA提取试剂：

样本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5) 20mM、EDTA 25 mM、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）（2）荧光定量PCR反应液：含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各

2+

10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的Mg 浓度；

DNA聚合酶，灭菌蒸馏水；

（3）多重引物及探针：

蓝氏贾第虫：

Ga：5'- GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3'Gs：5'-ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'G-probe：5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3'微小隐孢子虫：

Ca：5'-ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'Cs：5'-CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'C-probe：5'-JOE-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3'刚地弓形虫：

Ta：5'-ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3'Ts：5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3'T-probe：5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'；

（4）阳性对照：蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫检测片段标准质粒；

（5）阴性对照：灭菌蒸馏水为阴性对照样本；

（6）多重荧光定量PCR标准曲线：通过阳性标准质粒进行荧光定量PCR扩增绘制。

2、根据权利要求1所述的多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，其特征在于：还含有smart cycler system PCR反应管。

3、权利要求1所述多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：（1）样本裂解液与DNA提取试剂：

样本裂解液：将NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5) 20mM、EDTA 25 mM、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）；

（2）多重荧光定量PCR引物与探针：

蓝氏贾第虫特异引物Ga与Gs及探针G-probe，微小隐孢子虫特异引物Ca与Cs及探针C-probe，刚地弓形虫特异引物Ta与Ts及探针T-probe；

（3）荧光定量PCR反应液为2×预混液，含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的

2+

Mg 浓度，DNA聚合酶，灭菌双蒸水；

（4）阳性对照样本为含有蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫检测片段的标准质粒；

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本；

（6）多重荧光定量PCR标准曲线：通过阳性标准质粒进行荧光定量PCR扩增绘制；

（7）组装试剂盒。

说明书

多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒及制备方法

技术领域

[0001] 本发明公开一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，用于蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫的快速荧光定量PCR检测，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，属于寄生虫检测技术领域。

背景技术

[0002] 贾第虫病(giardiasis)是由贾第虫引起的一种以腹泻为主要症状的肠道疾病，为一种严重的人兽共患病，该病已被列为危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。

[0003] 隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是由隐孢子虫所引起的一种危害严重的人兽共患原虫病，可造成哺乳动物尤其是反刍动物以及人的严重腹泻。目前已经命名隐孢子虫有27种，能感染人的隐孢子虫有多种，其中以微小隐孢子虫的感染最为常见和严重，微小隐孢子虫宿主范围广泛且危害严重，多感染人、家畜等哺乳动物，因此是隐孢子虫属中危害最大的隐孢子虫种。病原学诊断多通过粪便显微镜检及改良的抗酸染色法检查，此法费时费力且检出率低下。免疫学诊断特异性和敏感性也较低。

[0004] 弓形虫病（toxoplasmosis）又称弓形体病，是由刚地弓形虫（Toxophasma gondii）所引起的人畜共患病，可感染人及家畜，猫科等多种哺乳动物。病原可通过胎盘感染胎儿，直接影响胎儿发育，致畸严重，其危险性较未感染者大10倍，是畜牧业的重大威胁，也是人类先天性感染中最严重的疾病之一，已引起广泛重视，本病与艾滋病（AIDS）的关系亦很密切。

[0005] 上述三种病的病原体分别为蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫，均为细胞内寄生原虫，其卵囊或包囊均较小，镜检不易发现，且其病原体在污染的水中存活时间持久，难以被普通消毒剂杀灭，因此给疾病诊断、病原检测和环境监测带来较大的困难，亟需开发一种多重快速检测试剂盒。

发明内容

[0006] 本发明提供一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，可用于蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫三种原虫的同时快速检测和诊断。

[0007] 本发明进一步提供了上述试剂盒的制备方法。

[0008] 本发明的多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，包括以下部分：

[0009] （1）样本裂解液与DNA提取试剂

[0010] 样本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

[0011] DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）；

[0012] （2）荧光定量PCR反应液：含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水；

[0013] （3）多重引物及探针：

[0014] 蓝氏贾第虫：

[0015] Ga：5'- GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3'

[0016] Gs：5'-ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'

[0017] G-probe：5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3'

[0018] 微小隐孢子虫：

[0019] Ca：5'-ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'

[0020] Cs：5'-CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'

[0021] C-probe：5'-JOE-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3'

[0022] 刚地弓形虫：

[0023] Ta：5'-ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3'

[0024] Ts：5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3'

[0025] T-probe：5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'；

[0026] （4）阳性对照：蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫检测片段标准质粒，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。

[0027] （5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。

[0028] （6）多重荧光定量PCR标准曲线：通过阳性标准质粒进行荧光定量PCR扩增绘制。

[0029] 在本发明的试剂盒中还可以含有smart cycler system PCR反应管。

[0030] 本发明所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

[0031] （1）样本裂解液与DNA提取试剂

[0032] 样本裂解液：将NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K0.1μg/μl；

[0033] DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（25:24: 1）。

[0034] （2）多重荧光定量PCR引物与探针：

[0035] 蓝氏贾第虫特异引物Ga与Gs及探针G-probe，微小隐孢子虫特异引物Ca与Cs及探针C-probe，刚地弓形虫特异引物Ta与Ts及探针T-probe

[0036] （3）荧光定量PCR反应液，含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；

[0037] （4）阳性对照样本标准质粒为含有蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫种特异基因的pMD-18T重组质粒；

[0038] （5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。

[0039] （6）多重荧光定量PCR标准曲线：通过阳性标准质粒进行荧光定量PCR扩增绘制。

[0040] （7）本发明的试剂盒还可以含有smart cycler system PCR反应管。

[0041] 本发明所述的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

[0042] 1）样本的预处理：取样本用PBS混匀过筛，先过60目，再过100目筛，滤液反复离心沉淀三次，沉淀即为备用样本；

[0043] 2）样本DNA的提取：

[0044] （1）将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入1ml裂解液，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次；

[0045] （2）将冻融后的样品加入5-6μl（20mg/ml）蛋白酶K，使其终浓度为100μg/ml。混匀后在65℃水浴中浸泡2h；

[0046] （3）用酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）进行抽提两次，7000r/min离心十分钟；

[0047] 3）、荧光定量PCR扩增检测：

[0048] （1）准备待检样品数+2的PCR反应管，管内包括PCR反应液等，盖紧盖子，在涡旋器上混匀备用；

[0049] （2）将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于Smart Cycler System PCR仪中。PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性10s、60℃退火延伸30s，40-50个循环，读取结果。

[0050] 本发明的积极效果在于：利用多重荧光定量PCR特异性检测方法，根据蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫种特异基因序列设计引物与探针，通过优化荧光定量PCR反应体系和条件来提高其敏感性，扩增同时可直接实时观察扩增结果。本发明可同时对三种重要水源性人兽共患原虫进行快速准确的检测，具有设计严谨，简单易操作，灵敏度高，特异性强，判定准确客观等特点。

附图说明

[0051] 图1为本发明多重荧光定量PCR标准曲线图；

[0052] 图2为本发明多重荧光定量PCR特异性验证图；

[0053] 图3为本发明多重荧光定量PCR核酸检测灵敏度图；

[0054] 图4为本发明多重荧光定量PCR对样本检测灵敏度图。

具体实施方式

[0055] 为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

[0056] 实施例1

[0057] 1、多重快速荧光定量PCR检测试剂盒的引物与探针设计

[0058] 在GeneBank上比对选取蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫三种人兽共患原虫特异诊断基因分别为beta-giardin基因、TRAP-C2基因和B1基因。

[0059] 根据选取的特异基因生物软件Beacon Designer-v7.5设计多重荧光定量PCR引物和探针如下：

[0060] 蓝氏贾第虫：

[0061] Ga：5'- GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3'

[0062] Gs：5'-ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'

[0063] G-probe：5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3'

[0064] 微小隐孢子虫：

[0065] Ca：5'-ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'

[0066] Cs：5'-CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'

[0067] C-probe：5'-JOE-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3'

[0068] 刚地弓形虫：

[0069] Ta：5'-ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3'

[0070] Ts：5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3'

[0071] T-probe：5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'

[0072] 以上三对引物在同一体系中（多重荧光定量PCR）能同时扩增检测出三种原虫的特异基因片断，能够实现同时检测微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫和刚地弓形虫等三种重要水源性人兽共患原虫的目的。

[0073] 2、样本裂解液与DNA提取试剂的配制

[0074] 按照下列浓度配比NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl进行混合，制备样本裂解液；DNA提取试剂：体积比为25:24: 1的酚:氯仿:异戊醇。

[0075] 3、荧光定量PCR反应液的配制

[0076] 含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水。

[0077] 4、阳性对照标准质粒的制备

[0078] 在上述荧光定量多重引物的两端分别设计构建标准质粒引物，通过PCR扩增目的基因，与pMD-18T载体连接，构建重组质粒，选取单克隆进行测序、Blast比对鉴定，将100%同源质粒确定为标准质粒。

[0079] 5、阴性对照

[0080] 阴性对照为灭菌双蒸水。

[0081] 6、反应体系优化

[0082] 本发明试剂盒PCR反应条件的优化,将合成的引物与探针以灭菌蒸馏水稀释为10μM浓度，每个反应体系按照表1所示浓度比，对同一浓度已知阳性样本进行检测，根据CT值及扩增曲线选择最优浓度比。

[0083] 表1 荧光定量PCR检测方法中引物与探针浓度配比

[0084]Primers Probe 0.3μL 0.4μL 0.5μL 0.6μL 0.7μL
0.2μL ⑴ ⑷ ⑺ ⑽ ⒀
0.3μL ⑵ ⑸ ⑻ ⑾ ⒁
0.4μL ⑶ ⑹ ⑼ ⑿ ⒂

[0085] 经实验确定每个反应体系最终浓度比为Ga/Gs分别0.4μL，Ca/Cs与Ta/Ts分别0.5μL， G-probe、C-probe与T-probe均为0.4μL。

[0086] 7、多重荧光定量PCR检测体系标准曲线绘制

[0087] 将三种阳性对照标准质粒分别进行核酸定量，计算得出拷贝数，按照10倍比稀释分别为107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL，进行多重荧光定量PCR，分别根据CT值绘制标准曲线，见图1。

[0088] 实验例1、多重荧光定量PCR检测体系特异性实验

[0089] 取艾美耳球虫、安氏隐孢子虫、旋毛虫、毛滴虫、大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、霍乱杆菌、沙门氏菌等10个阴性对照样本DNA为模板，用建立的扩增体系分别对其进行检测。参见图2。

[0090] 结果显示对照样本均无扩增符合属特异检测标准。

[0091] 实验例2

[0092] 多重荧光定量PCR检测体系敏感性实验

[0093] 将提取出的蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫总核酸在核酸分析仪上定量，分别以Easy Dilution将浓度稀释到每个反应体系中的含量为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。进行多重荧光定量PCR检测，同时设阴性对照。结果表明蓝氏贾第虫的检测阈值为100fg，微小隐孢子虫的检测阈值为10fg，刚地弓形虫的检测阈值为10fg，均属高灵敏度检测方法，符合敏感性检测标准，见图3。

[0094] 实验例3

[0095] 试剂盒的稳定性和重复性实验

[0096] 阳性模板，PCR反应液可在-20℃条件下长期贮存，溶解后4℃条件4℃保存即可，应避免反复冻融。当贮存时间为30天、60天、100天、150天、200天时取出各组分，按照检测体系检测试剂盒稳定性。取15份阳性样本用此试剂盒重复试验3次，15份PCR阴性样本同样重复3次。结果表明在以上各时段取出的组分在稳定性和重复性试验中无假阳性与假阴性结果出现，故此试剂盒稳定性和重复性良好。

[0097] 实验例4

[0098] 试剂盒的保质期试验

[0099] 将分别在4℃和-20℃贮存1个月、3个月、5个月、7个月和10个月的试剂盒取出，按照检测体系对已知样本进行检测。结果表明在4℃和-20℃条件下保存达10月之久的试剂盒仍能对样本作出准确的检测。

[0100] 检测例1

[0101] 分别将保存的蓝氏贾第虫包囊、微小隐孢子虫卵囊和刚地弓形虫卵囊计数按照1000卵囊（包囊）/ml，100卵囊（包囊）/ml，10 卵囊（包囊）/ml，1卵囊（包囊）/ml分散于自来水中，制作水污染样本。

[0102] 用经典的显微镜观察法作对比结合多重荧光定量PCR进行检测：

[0103] （一）饱和食盐水漂浮法

[0104] 将每个样本以饱和食盐水漂浮，取上层液相加入5倍清水后，离心沉淀，将沉淀涂片，10×100倍油镜镜检。

[0105] （二）多重荧光定量PCR检测

[0106] 1、样本的预处理

[0107] 取混匀样本1ml，水平离心机3000g离心沉淀，沉淀即为备用样本。

[0108] 2、样本DNA的提取

[0109] （1）将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入1ml裂解液，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次。

[0110] （2）将冻融后的样品加入5-6μl（20mg/ml）蛋白酶K，使其终浓度为100μg/ml。混匀后在65℃水浴中浸泡1h。

[0111] （3）用酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）进行抽提两次，12000g离心十分钟。

[0112] （4）将上面的水相小心的吸取到灭菌的EP管中，注意不要吸取中层变性的蛋白层。

[0113] （5）在水相中加入3M醋酸钠（PH5.2）60-70μl，再加入2倍体积的冷乙醇在-20℃冰箱中沉淀1h。

[0114] （6）将沉淀完全的样品在4℃冷冻离心机中离心30min，弃上清后再用75%酒精洗涤一遍。

[0115] （7）弃酒精后在晾干，用TE缓冲液或是灭菌4蒸水溶解保存，为待检样品。

[0116] 3、多重荧光定量PCR：

[0117] （1）按待检样品数+2的PCR反应管取PCR反应液，加入阴性和阳性对照各1μl，加入待检样品并作标记，建立20μl体系，混匀。

[0118] （2）按照该检测体系进行多重荧光定量PCR扩增检测。

[0119] 4、结果：

[0120] 结果表明饱和食盐水漂浮显微镜观察方法能够对100-1000个卵囊（包囊）进行检测，并不能够对100病原体以下的样本进行检测；该多重荧光定量PCR检测体系能够同时对1-10个可感染人或其它哺乳动物的蓝氏贾第虫包囊、微小隐孢子虫卵囊和刚地弓形虫卵囊或包囊进行准备快速的检测，附图4。