猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物转让专利
申请号 : CN201110068834.2
文献号 : CN102154516B
文献日 : 2013-05-01
发明人 : 杨志彪 , 顾江萍 , 袁聪俐 , 崔立 , 华修国
申请人 : 上海交通大学
摘要 :
一种生物技术领域的猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。提取阳性重组质粒，用紫外分光光度计定量，标准品系列以10倍梯度稀释为终浓度在1.0×103-1.0×1011拷贝/mL，以其作为模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。提取临床粪便样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR，根据其结果和标准曲线计算样品中病毒的含量。所述的引物序列为序列1和序列2。本发明的优点无需另外设计荧光探针，降低成本，操作简便，检测只需在2小时内即可完成，并且适用任何一款荧光定量PCR仪，可应用于规模大、通量高的样本检测中。
权利要求 :
1.一种TGEV病毒的荧光定量PCR检测方法的引物，其特征在于，所述引物是指一对特异性引物，该对特异性引物序列分别如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示，该方法包括步骤如下：(1)设计、合成引物：根据TGEVs基因的序列，设计一对特异性引物，即上下游引物，其序列如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示；
(2)PCR扩增s基因，获得目的片段，PCR产物割胶回收；
(3)构建重组质粒，将目的片段与pMD18-T载体连接，转化到DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行PCR和测序鉴定；
(4)荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立，经过反复实验，确定最优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；
(5)建立标准曲线，提取阳性质粒，用分光光度计测定OD260nm值，并将质粒浓度换算成拷贝数／μL，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，以5个稀释度的质粒标准品建立标准曲线，同时对猪粪便样本进行处理，处理后提取基因组RNA作荧光定量PCR，根据结果计算原始样品中TGEV的含量；
所述的荧光定量PCR反应体系如下：
总体积25μL：2XOne Step SYBR RT-PCR Buffer配制的母液12.5μL，DNA模板2μL，浓度为10μM的上下游引物各0.5μL，DEPC处理过的水9.5μL；
所述的荧光定量PCR反应条件如下：
95℃预变性3min，然后95℃ 30s、59℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min。
2.根据如权利要求1所述的引物，其特征是，该引物扩增目的片段大小为111bp。
说明书 :
猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引
物
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种生物技术领域的检测方法和基因引物，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。
背景技术
[0002] 猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis Virus，TGEV)引起的以病猪出现呕吐、水样下痢、脱水为特征的一种高度接触性传染病，对1周龄以下仔猪具有高度致死率。康复后仔猪发育不良，生长迟缓。该病能使康复成年猪的抗病能力与免疫功能受损，掉膘、降低饲料利用率，浪费药物和人力等，造成严重经济损失。因此建立快速、灵敏、成本低又操作方便的检测方法十分必要。
[0003] TGEV编码四种结构蛋白，分别为纤突(S)蛋白、小膜(sM)蛋白、膜内蛋白(M)和核衣壳(N)蛋白，其中只有纤突S蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护的结构蛋白。此外，S蛋白含有宿主细胞氨肽酶受体(PAPN)的识别位点，在宿主细胞亲嗜性、病毒致病性中起着关键作用。TGEV只有一种血清型，S基因高度保守，可作为靶基因进行TGEV病毒的诊断与检测研究，而目前尚未建立基于S基因的荧光定量染料法。
[0004] 经对现有技术文献的检索发现：
[0005] ①目前TGEV荧光定量方法主要针对N基因，白兴华等根据TGEV的ORF6基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法(白兴华，原志伟，李军民，王亚文，贺同欣，冯力，TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究.检验检疫学刊，2009，(5)：17-20)。但在该方法中未涉及S基因和染料法。
[0006] ②Ramesh等针对TGEV S基因设计的Taqman探针可以快速检测猪粪中的TGEV含量(Vemulapallia R，Gulanib J，Santricha C，A real-time TaqMan RT-PCR assay with an internal amplification control for rapid detection of transmissible gastroenteritis virus in swine fecal samples.Journal of Virological Methods，2009，162：231-235)。但该方法未涉及染料法。
[0007] 与探针法相比染料法优点在于无需另外设计荧光探针，降低成本，操作简便，并且适用任何一款定量PCR仪，可应用于规模大、通量高的样本检测中。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，公开一种猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。本发明根据实验室保存的猪传染性胃肠炎病毒毒株的S基因序列设计引物，通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化，具有较好的特异性和重复性，其敏感性比常规PCR高100倍，可以用于TGEV的快速检测。
[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0010] 本发明涉及的猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法，包括步骤如下：
[0011] (1)设计、合成引物：根据TGEV S基因的序列，设计一对特异性引物。
[0012] (2)PCR扩增S基因，获得目的片段，PCR产物割胶回收。
[0013] (3)构建重组质粒，将目的片段与pMD18-T载体连接，转化到DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行PCR和测序鉴定。
[0014] (4)荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立，经过反复实验，确定最优化荧光定量PCR反应体系和反应条件。
[0015] (5)建立标准曲线，提取阳性质粒，用分光光度计测定OD260nm值，并将质粒浓度换算成拷贝数/μL，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，以5个稀释度的质粒标准品建立标准曲线。同时对猪粪便样本进行处理，处理后提取基因组RNA作荧光定量PCR，根据结果计算原始样品中TGEV的含量。
[0016] 所述的染料，是指：
[0017] SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)(大连宝生物工程有限公司生产)。
[0018] 所述的荧光定量PCR反应体系如下：
[0019] 总体积25μL：2×One Step SYBR RT-PCR Buffer配制的母液12.5μL，DNA模板2μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，DEPC处理过的水9.5μL。
[0020] 所述的荧光定量PCR反应条件如下：
[0021] 95℃预变性3min，然后95℃30s、59℃30s、72℃30s，35个循环，72℃延伸10min所述的样品，加2倍体积的PBS，冻融3次。取上清液，按照 Reagent试剂盒使用说明操作提取RNA进行检测。
[0022] 本发明还涉及如上述猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法中的引物，所述的引物，是指一对特异性引物，该对特异性引物序列如：序列1和序列2。
[0023] 根据本实验室保存的TGEV毒株的S基因序列，设计特异性引物，扩增目的片段大小为111bp。PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。提取阳性重组质粒，用紫外3 11
分光光度计定量，标准品系列以10倍梯度稀释为终浓度在1.0×10-1.0×10 拷贝/mL，以其作为模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。
分光光度计定量，标准品系列以10倍梯度稀释为终浓度在1.0×10-1.0×10 拷贝/mL，以其作为模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。
[0024] 本发明检测样本DNA浓度在1.0×106-1.0×1010拷贝/mL之间，Ct值与质粒拷贝2
数的对数之间呈现很好的线性关系，相关系数R ＝0.999。以不同病毒(猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗株均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；Torque teno virus采用文献Zhu CX，ShanTL，Cui L，Luo XN，Liu ZJ，Tang SD，Liu ZW，Yuan CL，Lan DL，Zhao W，Hua XG.Molecular detection and sequence analysis of feline Torque teno virus(TTV)in China.Virus Res.2010Dec 24.[Epub ahead of print])的DNA作为模板，同时设阴性和阳性对照，进行荧光定量PCR检测。结果显示只有阳性对照出现扩增曲线，其他均未出现扩增曲线，表明该方法特异性强。在同一反应体系进行批间重复，每个样品3个重复，Ct值变异系数分别为：0.973％、0.489％、0.829％、0.828％，均小于5％。表明误差都非常小，扩增效率稳定。
数的对数之间呈现很好的线性关系，相关系数R ＝0.999。以不同病毒(猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗株均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；Torque teno virus采用文献Zhu CX，ShanTL，Cui L，Luo XN，Liu ZJ，Tang SD，Liu ZW，Yuan CL，Lan DL，Zhao W，Hua XG.Molecular detection and sequence analysis of feline Torque teno virus(TTV)in China.Virus Res.2010Dec 24.[Epub ahead of print])的DNA作为模板，同时设阴性和阳性对照，进行荧光定量PCR检测。结果显示只有阳性对照出现扩增曲线，其他均未出现扩增曲线，表明该方法特异性强。在同一反应体系进行批间重复，每个样品3个重复，Ct值变异系数分别为：0.973％、0.489％、0.829％、0.828％，均小于5％。表明误差都非常小，扩增效率稳定。
[0025] 在本发明中的术语“SYBR Green I”、荧光阈值、CT值和荧光定量PCR，在“检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒(CN101935696A)”公开文献上均有记载。
[0026] 本发明使用染料法荧光定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，稀释，然后作出标准曲线图，未知的样本按标准曲线换算出对应的拷贝数。本发明优点在于无需另外设计荧光探针，降低成本，操作简便，并且适用任何一款定量PCR仪，可应用于规模大、通量高的样本检测中。本发明采用SYBR Green I荧光染料荧光定量PCR，相比普通PCR检测方法特异性高，假阳性低，扩增与检测一步完成，不易污染，不需要对产物进行电泳等后期处理，操作更简便，检测只需在2小时内即可完成，大大缩短了检测时间。
附图说明
[0027] 图1荧光定量PCR扩增动力学曲线。
[0028] 图2荧光定量PCR标准曲线。
[0029] 图3普通PCR检测方法电泳图；
[0030] 其中M：分子量标准DL2000；1、2、3、4从左到右依次加入模板拷贝数为109、108、7 6
10、10/mL。
10、10/mL。
[0031] 图4TGEV标准品荧光定量PCR熔解曲线。
[0032] 图5TGEV S基因荧光定量PCR方法特异性实验。
具体实施方式
[0033] 以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0034] 实施例一
[0035] (1)设计、合成引物和探针
[0036] 根据本实验室保存的TGEV毒株的S基因序列，用primer5.0等软件设计引物，目的片段大小为111bp，由上海生工生物工程有限公司合成。
[0037] 上游引物为序列表1；下游引物为序列表2。
[0038] (2)S基因的克隆
[0039] 将TGEV毒株按10％比例接种到已长到80％细胞的细胞瓶中，37℃吸附1h，换2％的维持液，CO2培养箱中37℃培养3-6d，在出现80％病变后收毒，将病毒细胞液反复冻融3次，收毒，-80℃保存备用。病毒RNA提取按照 Reagent试剂盒使用说明操作。
[0040] 按照一步法反转录试剂盒操作说明合成TGEV DNA。采用25μL的PCR反应体系，反应条件为95℃预变性3min，然后95℃30s、59℃30s、72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。取10μL产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用DNA胶回收纯化试剂盒进行纯化回收，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α平板，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。
[0041] (2)标准曲线的建立
[0042] 重组质粒由质粒提取试剂盒提取，用紫外分光光度计定量，标准品系列稀释为终3 11
浓度在1.0×10-1.0×10 拷贝/ml。定量RT-PCR反应体系为25μL：2×One Step SYBR RT-PCR Buffer配制的母液12.5μL，DNA模板2μL，上下游引物(10μM)各0.5μl，DEPC处理过的水9.5μl。在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号进行实时检测。最后进行熔解曲线分析PCR扩增产物的特异性。每个模板浓度微3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。
浓度在1.0×10-1.0×10 拷贝/ml。定量RT-PCR反应体系为25μL：2×One Step SYBR RT-PCR Buffer配制的母液12.5μL，DNA模板2μL，上下游引物(10μM)各0.5μl，DEPC处理过的水9.5μl。在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号进行实时检测。最后进行熔解曲线分析PCR扩增产物的特异性。每个模板浓度微3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。
[0043] 将计算好拷贝数的标准DNA模板以10倍系列稀释，同一稀释梯度做重复孔对照，5
进行实时定量PCR扩增，该方法可以检测到的最低浓度为10 拷贝/mL(图1、图2)。在稀释的线性浓度范围内，模板量与对应的Ct值相应之间线性相关，相关系数为0.999。Ct值分别为14.7049，17.6391，21.2015，24.3917，27.2653，标准曲线的斜率为-3.2173，截距为
47.0267，直线方程为y＝-3.2173lgx+47.0267。
进行实时定量PCR扩增，该方法可以检测到的最低浓度为10 拷贝/mL(图1、图2)。在稀释的线性浓度范围内，模板量与对应的Ct值相应之间线性相关，相关系数为0.999。Ct值分别为14.7049，17.6391，21.2015，24.3917，27.2653，标准曲线的斜率为-3.2173，截距为
47.0267，直线方程为y＝-3.2173lgx+47.0267。
[0044] (3)敏感性试验
[0045] 普通PCR最低能检测到107拷贝/mL(图3)，而荧光定量方法能检测的最低模板量5
为10 拷贝/mL，比普通PCR检测方法敏感100倍。
为10 拷贝/mL，比普通PCR检测方法敏感100倍。
[0046] (4)特异性试验
[0047] 实时定量PCR扩增结束后，利用熔解曲线对扩增产物进行特异性分析(图4)。从图可知，在熔解曲线上有单一的峰，Tm值显示熔解温度在85℃±1℃，说明本方法特异性高，没有非特异产物出现。
[0048] 利用本文建立的实时定量PCR检测方法，分别检测了TGEV，PRRSV疫苗株、CFSV疫苗株，猪TTV阳性质粒。结果显示只有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)毒株呈阳性反应，其它病毒均呈阴性(图5)。
[0049] (5)稳定性试验
[0050] 取拷贝数为109，108，107，106的模板做A、B、C组重复试验(表1)，Ct值变异系数分别为：0.973％、0.489％、0.829％、0.828％，均小于5％，说明该方法具有较好的重复性。
[0051] 表1荧光定量重复性实验结果
[0052]A B C AvgCt SD CV
1 18.6229 18.9992 18.6029 18.7417 0.1823 0.973％
2 21.7821 21.8451 22.0340 21.8871 0.1070 0.489％
3 24.7458 25.2254 24.8450 24.9387 0.2067 0.829％
4 27.7302 28.2886 28.1013 28.0400 0.2321 0.828％
1 18.6229 18.9992 18.6029 18.7417 0.1823 0.973％
2 21.7821 21.8451 22.0340 21.8871 0.1070 0.489％
3 24.7458 25.2254 24.8450 24.9387 0.2067 0.829％
4 27.7302 28.2886 28.1013 28.0400 0.2321 0.828％
[0053] 实施例二
[0054] (1)临床粪便样品的采集，临床粪便样品加2倍体积的PBS，冻融3次，取上清作为提取备用液-80℃保存备用。病毒RNA提取按照 Reagent试剂盒使用说明操作。
[0055] (2)PCR体系优化
[0056]成分 用量(μL)
2×One Step SYBR RT-PCR Buffer配制的母液 12.5
序列1(10μM) 0.5
序列2(10μM) 0.5
DNA模板 2
DEPC去离子水 9.5
Total 25
2×One Step SYBR RT-PCR Buffer配制的母液 12.5
序列1(10μM) 0.5
序列2(10μM) 0.5
DNA模板 2
DEPC去离子水 9.5
Total 25
[0057] (3)最佳反应条件
[0058]
[0059] (4)根据荧光定量PCR结果和标准曲线计算样品中病毒的含量。
[0060] (5)荧光定量PCR结果，荧光定量PCR仪会自动显示样品的浓度，单位是Copies/2μL。