纤维素水解力强化酵母的制作和使用

摘要

本发明在于提供一种制作纤维素水解力强化酵母的方法。该方法包括使能够水解结晶性纤维素的酶和能够水解非结晶性纤维素的酶各自的基因共同增多的插入拷贝数导入纤维素非水解性酵母中而得到转化酵母的工序。纤维水解力强化酵母可以在由纤维素类物质生产乙醇中良好地利用。

权利要求

1.一种方法，用于制作纤维素水解力强化酵母，其特征在于：

包括向纤维素非水解性酵母中导入能够水解纤维素的酶的基因组群而得到转化酵母的工序，该基因组群包括能够水解结晶性纤维素的酶的基因和能够水解非结晶性纤维素的酶的基因，该能够水解结晶性纤维素的酶的基因和该能够水解非结晶性纤维素的酶的基因通过以一同含有所述基因的表达框的至少2个载体对单一酵母进行转化，或者以至少2组分别单独含有所述基因的表达框的载体的组合对单一酵母进行转化，以共同增多的插入拷贝数导入，该能够水解纤维素的酶的基因组群还包含能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶的基因，相对于该能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶的基因插入拷贝数的1个拷贝，该能够水解结晶性纤维素的酶和该能够水解非结晶性纤维素的酶的基因插入拷贝数分别至少为2个拷贝，该能够水解结晶性纤维素的酶是纤维二糖水解酶，该能够水解非结晶性纤维素的酶是内切葡聚糖酶，该能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶是β-葡萄糖苷酶，向该纤维素非水解性酵母中导入该纤维二糖水解酶、该内切葡聚糖酶和该β-葡萄糖苷酶，使其在表层表达。

2.一种纤维素水解力强化酵母，其特征在于：

其是由权利要求1所述的方法所得到的。

3.一种纤维素水解力强化酵母，其特征在于：

具有纤维二糖水解酶基因、内切葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因，相对于该β-葡萄糖苷酶基因的1个拷贝，分别至少以2个拷贝插入该纤维二糖水解酶基因和该内切葡聚糖酶基因，该纤维二糖水解酶、该内切葡聚糖酶和该β-葡萄糖苷酶在表层表达。

4.一种制造乙醇的方法，其特征在于：

包括使纤维素类物质和权利要求2或3所述的纤维素水解力强化酵母反应而生产乙醇的工序。

说明书

纤维素水解力强化酵母的制作和使用

技术领域

[0001] 本发明涉及纤维素水解力强化酵母的制作和使用。

背景技术

[0002] 近年，产自粮食谷物(例如玉米、薯类和甘蔗)的生物燃料增产招致食物价格上涨，产自非食用碳源软生物质(例如稻秸、麦秸、甘蔗渣、稻壳、棉、竹、纸和玉米秸秆那样的废弃物)的乙醇生产成为当务之急。

[0003] 提出了对包括纤维素和半纤维素的生物质施加酸处理或超临界处理，将原料处理为发酵微生物能够利用的葡萄糖的方案。

[0004] 以往，作为以纤维素材料为原料制造葡萄糖的方法，有加酸糖化法和酶法糖化法。作为加酸糖化法，已知以高温(200℃以上)使用稀酸将纤维素类物质糖化的稀酸糖化方法和以浓硫酸等将纤维素材料糖化的方法。但是，由于哪一种方法都在过于剧烈的条件下对纤维素材料进行水解，因此，引起作为纤维素材料的分解物葡萄糖的二次分解反应，糖化率低至约50％，另外，必须从糖化液除去葡萄糖的分解物。在不除去上述葡萄糖的分解物地将糖化液作为发酵用碳源利用时存在各种问题。

[0005] 另一方面，酶法糖化法能够在温和的条件下进行纤维素材料的糖化，但糖化的反应速度慢，存在为了充分糖化需要长时间的问题。另外，由于在糖化中使用的市售的酶的效价低从而为了充分糖化必须使用大量酶，因此，存在使用的酶成本变高的问题。

[0006] 通过使用生物工程学方法改变作为软生物质主要成分的纤维素、半纤维素等本来无法利用的发酵微生物，尝试使来自非食用碳源的直接乙醇发酵。作为这样的生物工程学方法，合适地利用细胞表层表达技术。例如，通过细胞表层表达技术制作在表层表达水解纤维素的酶群的酵母(专利文献1和2)。另外，酵母酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)不能代谢木糖，但是也尝试制作在表层表达作为木聚糖分解酶的来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶2(XYN II)和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-木糖苷酶(XylA)且表达木糖还原酶(XR)基因和木糖醇脱氢酶(XDH)基因(均来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis))及木糖酮激酶(XK)基因(来自酿酒酵母菌)的酿酒酵母菌，使用该酵母从桦木材的木聚糖生产乙醇(非专利文献1)。

[0007] 但是，如果考察工业上的实用性，则必须进一步加以研讨。在纤维素类生物质中存在结晶性部分和非结晶性部分。由酶进行的加水反应，非结晶性部分比结晶性部分容易进行，可以认为结晶性部分由于存在牢固的分子内、分子间氢键，因此水解速度慢。重要的是更高效地进行具有这样的复杂结构的纤维素的水解。

[0008] 现有技术文献

[0009] 专利文献

[0010] 专利文献1：国际专利申请公开第01/79483号公报

[0011] 专利文献2：特开2008-86310号公报

[0012] 专利文献3：特开2006-255676号公报

[0013] 非专利文献

[0014] 非专利文献1：S.Katahira等，Applied and Enviromental Microbiology，2004年，70卷，5407-5414页

[0015] 非专利文献2：Appl.Microbiol.Biotech.，2002年，60卷，469-474页[0016] 非 专 利 文 献3：Applied and Enviromental Microbiology，2002年，68 卷，4517-4522页

[0017] 非专利文献4：R.Akada等，Yeast，2006年，23卷，399-405页

[0018] 非专利文献5：H.Okada等，J.Biosci.Bioeng.，1999年，88卷，563页[0019] 非专利文献6：Y.Fujita等，Journal of molecular Catalysis B；Enzymatic，2002年，817卷，189-195页

[0020] 非专利文献7：S.Katahira等，Appl Microbiol Biotechnol.，2006年，72卷，1136-43页

[0021] 非专利文献8：Rose等，Methods in Yeast genetics，A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor，NY 1990年[0022] 非专利文献9：P.N.Lipke等，Mol.Cell.Biol.，1989年8月，9(8)，3155-65页[0023] 非专利文献10：Y.Fujita等，Applied and Enviromental Microbiology，2002年，68卷，5136-41页

[0024] 非专利文献11：Y.Fujita等，Applied and Enviromental Microbiology，2004年，70卷，1207-12页

[0025] 非专利文献12：Takahashi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001年，55卷，454-462页

[0026] 非专利文献13：C.S.Walseth，Tech，Assoc.Pulp Paper Ind.，1952年，35卷，228-233页

发明内容

[0027] 发明要解决的课题

[0028] 本发明目的在于提供一种具有高纤维素水解力的酵母。本发明的目的还在于提供一种从纤维素类物质高效地生产乙醇的方法。用于解决课题的方法

[0029] 本发明提供一种制作纤维素水解力强化酵母的方法。该方法包括向纤维素非水解性酵母中导入能够水解纤维素的酶的基因组群而得到转化酵母的工序，上述基因组群包括能够水解结晶性纤维素的酶的基因和能够水解非结晶性纤维素的酶的基因，上述能够水解结晶性纤维素的酶的基因和上述能够水解非结晶性纤维素的酶的基因以共同增多的插入拷贝数导入。

[0030] 在1个实施方式中，上述能够水解结晶性纤维素的酶是纤维二糖水解酶，上述能够水解非结晶性纤维素的酶是内切葡聚糖酶。

[0031] 在另1个实施方式中，向上述纤维素非水解性酵母中导入上述能够水解结晶性纤维素的酶和上述能够水解非结晶性纤维素的酶的至少一种，使其在表层表达。

[0032] 另外，在其它的实施方式中，上述能够水解纤维素的酶的基因组群还包括能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶基因。

[0033] 在另外的实施方式中，相对于上述能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶的基因插入拷贝数的1个拷贝，上述能够水解结晶性纤维素的酶和上述能够水解非结晶性纤维素的酶组入的拷贝数分别至少为2个拷贝。

[0034] 在另外的实施方式中，上述能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶是β-葡萄糖苷酶。

[0035] 在另外的实施方式中，向上述纤维素非水解性酵母导入上述能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶，使其在表层表达。

[0036] 本发明还提供可以由上述方法得到的纤维素水解力强化酵母。

[0037] 另外，本发明提供一种纤维素水解力强化酵母，其具有纤维二糖水解酶基因、内切葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因，相对于上述β-葡萄糖苷酶基因的1个拷贝，分别至少以2个拷贝插入上述纤维二糖水解酶基因和上述内切葡聚糖酶基因。

[0038] 在1个实施方式中，上述纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶在表层表达。

[0039] 本发明还提供一种制造乙醇的方法。该方法包括使纤维素类物质和上述纤维素水解力强化酵母反应而生产乙醇的工序。

[0040] 发明的效果

[0041] 根据本发明，可以提供纤维素水解力强化酵母。利用该纤维素水解力强化酵母，可以提高来自纤维素的直接乙醇产量。另外，通过利用该纤维素水解力强化酵母，可以提供一种从纤维素类物质的高效且经济的乙醇生产方法。

附图说明

[0042] 图1是质粒pRS406EG CBH2的模式图。

[0043] 图2是质粒pRS403EG CBH2的模式图。

[0044] 图3是质粒pRS405EG CBH2的模式图。

[0045] 图4是质粒pILGP3-CBH2的模式图。

[0046] 图5是质粒pRS405CBH2CBH2的模式图。

[0047] 图6是质粒pIWBGL的模式图。

[0048] 图7是表示各种表达内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的酵母的纤维素水解力的图。

[0049] 图8是表示以由使内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的拷贝数依次增多的3种纤维素酶表层表达酵母产生的磷酸膨润纤维素(PSC)作为材料，通过发酵生成的乙醇量经时变化的图。

[0050] 图9是表示从纤维素酶表层表达酵母和纤维素酶分泌酵母的磷酸膨润纤维素(PSC)的乙醇产量经时变化的图。

具体实施方式

[0051] (纤维素水解力强化酵母及其制作)

[0052] 在本发明中，对本来没有或几乎没有水解纤维素能力的酵母(野生型酵母等)(在本说明书中也称为“纤维素非水解性酵母”)，通过进行基因重组使其表达能够水解纤维素的酶群，制作纤维素水解力被强化的转化酵母。

[0053] 能够水解纤维素的酶能够来自任意的纤维素水解酶生产菌。作为纤维素水解酶生产菌，代表性的可以列举属于曲霉属(例如，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae))、木霉属(例如里氏木霉(Trichoderma reesei))、梭菌属(例如热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、纤维单胞菌属(例如，粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)和潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda))、假单胞菌属(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence))等的微生物。

[0054] 能够水解纤维素的酶是指能够切断β-1，4-葡萄糖苷键的酶。作为能够切断β-1，4-葡萄糖苷键的酶，代表性的可以列举内切β-1，4-葡聚糖酶(以下简称为“内切葡聚糖酶”)、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，但不限定于此。

[0055] 内切葡聚糖酶是通常称为纤维素酶的酶，能够从分子内部切断纤维素，产生葡萄糖、纤维二糖和纤维低聚糖(聚合度为3以上，通常能够为10以下，但不限定于此)(“纤维素分子内切断”)。内切葡聚糖 酶对如非结晶化的纤维素、可溶性纤维低聚糖和羧甲基纤维素(CMC)那样的纤维素衍生物等结晶度低或非结晶性纤维素的反应性高，但对具有结晶结构的纤维素微丝的反应性低。内切葡聚糖酶是能够水解非结晶性纤维素的酶(以下也称为“非结晶性水解酶”)的代表性例子。内切葡聚糖酶中有5类，分别称为内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶III、内切葡聚糖酶IV和内切葡聚糖酶V。它们的区别在于氨基酸序列的差异，而在具有纤维素分子内切断作用的方面是共通的。例如，可以使用来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(特别是EG II)，但不限定于此。

[0056] 纤维二糖水解酶能够从纤维素的还原末端或非还原末端的任一端分解而使纤维二糖游离(“纤维素分子末端切断”)。纤维二糖水解酶能够分解具有结晶结构的纤维素微丝那样的结晶性纤维素，但对羧甲基纤维素(CMC)那样的纤维素衍生物等结晶度低或非结晶性纤维素的反应性低。纤维二糖水解酶是能够水解结晶性纤维素的酶(以下也称为“结晶性水解酶”)的代表性例子。由于结晶性纤维素的分子间和分子内的紧密氢键产生的坚固结构，由纤维二糖水解酶产生的结晶性纤维素的水解比由内切葡聚糖酶产生的非结晶性纤维素的水解慢。纤维二糖水解酶中有2类，分别称为纤维二糖水解酶1和纤维二糖水解酶2。它们的区别在于氨基酸序列的差异，而在具有纤维素分子内切断作用方面是共通的。例如，可以使用来自里氏木霉的纤维二糖水解酶(特别是CBH2)，但不限定于此。

[0057] 在纤维素中，β-葡萄糖苷酶是从非还原末端切离葡萄糖单位的外切型水解酶。β-葡萄糖苷酶能够切断糖苷配基或糖链与β-D-葡萄糖的β-1，4-葡萄糖苷键，能够水解纤维二糖或纤维低聚糖而生成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶是能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶的代表性例子。β-葡萄糖苷酶现在已知有1个种类，称为β-葡萄糖苷酶1。例如，可以使用来自棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶(特别是BGL1)，但不限定于此。

[0058] 在本发明中，如下所详细叙述地，通过导入能够水解纤维素的酶的基因组群，能够制作转化酵母。能够水解纤维素的酶的基因组群包括能够水解结晶性纤维素的酶的基因和能够水解非结晶性纤维素的酶 的基因。能够水解结晶性纤维素的酶(“结晶性水解酶”)是指能够水解具有微丝那样结晶结构的纤维素的任意的酶，例如，可以列举纤维二糖水解酶，但不限定于此。能够水解非结晶性纤维素的酶(“非结晶性水解酶”)是指不能分解具有结晶结构的纤维素、但能够水解非结晶化的纤维素那样的结晶化度低或非结晶性的纤维素的任意的酶，例如，可以列举内切葡聚糖酶，但不限定于此。优选地，在能够水解纤维素的酶的基因组群中，进一步包括能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶的基因。关于纤维低聚糖如上所述。作为能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶，例如，可以列举β-葡萄糖苷酶，但不限定于此。

[0059] 在本发明中，通过对纤维素非水解性酵母(野生型酵母等)进行基因重组使结晶性水解酶和非结晶性水解酶的表达共同增多，制作转化酵母。即，向纤维素非水解性酵母中导入使各自的酶基因的拷贝数共同增多的插入拷贝数，得到转化酵母。关于结晶性水解酶和非结晶性水解酶的表达方式，只要是表达的酶对纤维素基质发挥作用则没有限制。例如，表达方式能够是表层表达或分泌表达。结晶性水解酶和非结晶性水解酶可以至少一种或两种均被表层表达或分泌。可以对酵母进行转化，使其同时产生结晶性水解酶和非结晶性水解酶的表层表达和分泌。

[0060] 在转化酵母中，优选插入有能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶的基因。由此，能够提高从纤维素生产葡萄糖的能力。另外，该酶能够为表层表达和分泌，但优选为表层表达。为了使从纤维素的乙醇发酵更高效地进行，也优选在酵母中进一步表达能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶。

[0061] 相对于能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶基因的插入拷贝数的1个拷贝，结晶性水解酶和非结晶性水解酶的各自基因的组入拷贝数分别至少为2个拷贝。

[0062] 作为1个例子，作为结晶性水解酶能够使用纤维二糖水解酶，作为非结晶性水解酶能够使用内切葡聚糖酶。为了使这些酶的表达共同增多，能够以一同含有这些酶基因的表达框(以下进行详细叙述)的至少2个载体对单一酵母进行转化。也可以以至少2组分别单独含有这些各种酶的基因的表达框的载体的组合对单一酵母进行转化。对工 业酵母进行转化时，如下所详细叙述地，工业酵母本来不具有营养缺陷型标记，由于希望赋予营养缺陷型标记，因此，在操作效率上，优选制备一同含有这些酶的基因的表达框载体(作为载体的1个例子，可以列举在以下的实施例中说明的载体)。

[0063] 转化酵母能够是作为能够水解纤维二糖或纤维低聚糖的酶进一步插入有β-葡萄糖苷酶的酵母。

[0064] 通过使纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的插入拷贝数相对于β-葡萄糖苷酶基因的组入拷贝数增多，能够使乙醇产量增大。因此，相对于β-葡萄糖苷酶基因的插入拷贝数1个拷贝，能够插入纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的各自该基因至少2个拷贝。纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的各自该基因也能够以相对于β-葡萄糖苷酶基因的组入拷贝数1个拷贝为3个拷贝或其以上插入。通过对纤维素非水解性酵母(野生型酵母等)进行这样的基因重组，能够得到增大乙醇产量的酵母。

[0065] 作为1个实施方式，纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的至少1种或两种均被表层表达或分泌，然后，插入β-葡萄糖苷酶使其在表层表达。优选纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶能够在表层表达。

[0066] 如上述操作而得到的转化酵母被赋予水解纤维素的能力，从而形成强化酵母。在本说明书中，将这样被赋予水解纤维素能力从而被强化的转化酵母也称为“纤维素水解力强化酵母”。

[0067] 以下，说明纤维素水解力强化酵母的制作(即转化酵母的制作)，但不限定于此。

[0068] 以表达为目的的酶基因能够从产生酶的微生物基于已知的序列信息设计引物或探针，通过PCR或杂交法等取得。

[0069] 使用酶基因能够构筑表达框。表达框能够包括调控该基因表达的操纵子、启动子、终止子、增强子等所谓的调控因子。启动子或终止子既可以是以表达为目的的基因本身的基因，也可以利用来自其它基因的启动子或终止子。作为启动子或终止子，能够利用GAPDH(甘油醛3′-磷酸脱氢酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、GAP(甘油醛3′-磷酸)等的启动子和终止子，但启动子和终止子的选择依赖于目的的酶 基因的表达，能够由本领域技术人员适当选择。根据需要，还能够包括其它调控表达的因子(例如操纵子或增强子)等。关于操纵子、增强子等的表达调控因子，能够由本领域技术人员适当选择。根据该基因的表达的目的，表达框还能够包括必要的功能序列。根据需要，表达框也能够包括接头序列。

[0070] 为了使酶在酵母的表层表达，能够利用细胞表层工程学的技术。例如，有(a)通过细胞表层局部存在蛋白质的GPI锚区而在细胞表层表达的方法、(b)通过细胞表层局部存在蛋白质的糖链结合蛋白质结构域在细胞表层表达的方法和(c)通过周质游离型蛋白质(其它受体分子或标的受体分子)在细胞表层表达的方法，但不限定于此。细胞表层工程学的技术例如在专利文献1和2中也有记载。

[0071] 作为能够使用的细胞表层局部存在蛋白质，能够列举作为酵母的絮凝蛋白质的α-或a-凝集素(作为GPI锚区使用)、Flo1蛋白质(Flo1蛋白质能够改变各种N末端侧的氨基酸长而作为GPI锚区使用：例如F1o42、Flo102、Flo146、Flo318、Flo428等；非专利文献2；另外，Flo1326表示全长Flo1蛋白质)、Flo蛋白质(不具有GPI锚区功能而利用凝集性的Floshort或Flolong；非专利文献3)、作为周质局部存在蛋白质的转化酶(不利用GPI锚区)等。

[0072] 首先，说明(a)利用GPI锚区的方法。编码利用GPI锚区在细胞表层中局部存在的蛋白质的基因从N末端侧依次具有分别编码分泌信号序列、细胞表层局部存在蛋白质(糖链结合蛋白质结构域)和GPI锚区附着识别信号序列的基因。在细胞内从该基因表达的细胞表层局部蛋白质(糖链结合蛋白质)通过分泌信号向细胞膜外导出，此时，GPI锚区附着识别信号序列通过选择性地切断的C末端部分与细胞膜的GPI锚区结合从而固定于细胞膜上。此后，利用PI-PLC切断GPI锚区的根部附近，插入细胞壁而固定于细胞表层，在细胞表层表达。

[0073] 这里，分泌信号序列是指一般分泌到细胞外(也包括周质)的结合于蛋白质(分泌性蛋白质)的N末端、大量含有高疏水性氨基酸的氨基酸序列，通常，分泌性蛋白质在从细胞内通过细胞膜向细胞外分泌时被除去。只要是能够将发现产物导向细胞膜的分泌信号序列即可，不论其起源，能够使用任一种分泌信号序列。例如，作为分泌信号序 列，可以合适地使用葡糖淀粉酶的分泌信号序列、酵母的α-或a-凝集素的信号序列、表达产物本身的分泌信号序列等。只要是不影响在细胞表层结合性蛋白质中融合的其它蛋白质的活性，则分泌信号序列和前导序列的一部分或全部可以在N末端残留。

[0074] 这里，GPI锚区是指以称为糖基化磷脂酰肌醇(GPI)的乙醇胺磷酸-6甘露糖α1-2甘露糖α1-6甘露糖α1-4氨基葡萄糖α1-6肌醇磷脂质为基本结构的糖脂质，PI-PLC是指磷脂酰肌醇依赖性磷脂酶C。

[0075] GPI锚区附着识别信号序列是指GPI锚区与细胞表层局部存在蛋白质结合时被识别的序列，通常位于细胞表层局部存在蛋白质的C末端或其近处。作为GPI锚区附着信号序列，例如，可以合适地使用酵母的α-凝集素的C末端部分的序列。由于在从上述α-凝集素的C末端的320氨基酸序列的C末端一侧含有GPI锚区附着识别信号序列，因此作为在上述方法中使用的基因，编码从该C末端的320氨基酸序列的DNA序列特别有用。

[0076] 因此，例如，在具有编码分泌信号序列的DNA-编码细胞表层局部存在的蛋白质的结构基因-编码GPI锚区附着识别信号的DNA的序列中，通过将编码该细胞表层局部存在的蛋白质的结构基因的全部或一部分序列置换为作为编码目的的酶的DNA序列，可以得到用于通过GPI锚区在细胞表层表达的目的的酶的重组DNA。在细胞表层局部存在的蛋白质是α-凝集素时，优选导入编码目的的酶的DNA，使其残留从上述α-凝集素的C末端320氨基酸的序列编码的序列。因此，能够利用“α-凝集素基因的3′侧一半的区域”。通过向酵母导入这样的DNA并使之表达，在细胞表层表达的酶的C末端侧固定于表层。

[0077] 接着，说明(b)利用糖链结合蛋白质结构域的方法。在细胞表层局部存在的蛋白质是糖链结合蛋白质时，该糖链结合蛋白质结构域具有多个糖链，通过该糖链和细胞壁中的糖链相互作用或络合，能够停留于细胞表层。例如，可以列举植物凝集素、植物凝集素样蛋白质等的糖链结合部位等。代表性地可以列举GPI锚区蛋白质的凝集功能结构域、FLO蛋白质的凝集功能结构域。GPI锚区蛋白质的凝集功能结构域是指在比GPI锚区环范围更靠近N末端一侧，具有多个糖链，可 以认为是与凝集相关的结构域。

[0078] 通过结合该细胞表层局部存在蛋白质的糖链结合蛋白质结构域(或凝集功能结构域)与目的酶，在细胞表层中酶被表达。根据目的的酶的种类，能够在细胞表层局部存在蛋白质的糖链结合蛋白质结构域(或凝集功能结构域)的(1)N末端一侧使酶结合、(2)C末端一侧使酶结合和(3)N末端一侧和C末端一侧的两侧使相同或不同的酶结合。在本发明中，通过制成(1)编码分泌信号序列的DNA-编码作为目的的酶的基因-编码细胞表层局部存在蛋白质的糖链结合蛋白质结构域(或凝集功能结构域)的结构基因；或(2)编码分泌信号序列的DNA-编码细胞表层局部存在蛋白质的糖链结合蛋白质结构域(或凝集功能结构域)的结构基因-编码作为目的的酶的基因；或(3)编码分泌信号序列的DNA-编码作为目的的酶的第一基因-编码细胞表层局部存在蛋白质的糖链结合蛋白质结构域(或凝集功能结构域)的结构基因-编码作为目的酶的第二基因(其中，第一基因和第二基因可以相同也可以不同)，可以得到用于在细胞表层中表达目的酶的重组DNA。利用凝集功能结构域时，由于GPI锚区不参与细胞表层表达，因此，在重组DNA中，编码GPI锚区附着识别信号序列的DNA序列可以只存在一部分，也可以不存在。另外，在使用凝集功能结构域时，由于容易调控结构域的长度(例如，能够选择Floshort或Flolong的任一种)，因此，在能够以更适当的长度在细胞表层表达酶的方面及在酶的N末端或C末端的任一侧均能够使之结合方面，非常有用。

[0079] 接着，说明(c)利用周质游离型蛋白质(其它的受体分子或标的受体分子)的方法。此时，基于使目的的酶作为周质游离型蛋白质的融合蛋白质在细胞表层表达。作为周质游离型蛋白质，例如，可以列举转化酶(Suc2蛋白质)。根据这些周质游离型蛋白质，目的酶能够在N末端或C末端一侧适当地融合。

[0080] 在酵母中使酶表达而向细胞外分泌的方法是本领域从业人员所周知的。可以制成目的酶的结构基因与编码上述分泌信号序列的DNA连接重组DNA，向酵母中导入。

[0081] 在酵母的细胞内使基因表达的方法当然是本领域从业人员所周知的。此时，可以不使用上述细胞表层表达技术和上述分泌信号，制成 连接目的结构基因的重组基因，向酵母中导入。

[0082] 包括各种序列的DNA的合成和结合能够以本领域技术人员通常能够使用的技术进行。例如，分泌信号序列和目的酶的结构基因的结合能够使用部位特异性的定点诱变法进行。通过使用该方法，能够表达正确的分泌信号序列的切断和活性酶。

[0083] 酶基因或表达框能够插入质粒形态的载体中。从取得DNA的简易化方面出发，优选是酵母和大肠菌的穿梭载体。根据需要，载体能够含有如上所述的调控序列。作为制作载体的起始材料，例如，优选具有酵母的2μm质粒的复制起始点(Ori)和ColE1的复制起始点，优选还酵母选择标记(例如，耐药性基因、营养缺陷型标记基因(例如，编码咪唑甘油磷酸酯脱水酶(HIS3)的基因、编码β异丙基苹果酸脱氢酶(LEU2)的基因、编码色氨酸合成酶(TRP5)的基因、编码精氨基琥珀酸裂解酶(ARG4)的基因、编码N-(5′-磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶(TRP1)的基因、编码组氨酸脱氢酶(HIS4)的基因、编码乳清苷-5-磷酸脱羧酶(URA3)的基因、编码二氢乳清酸脱氢酶(URA1)的基因、编码半乳糖激酶(GAL1)的基因和编码α氨基己二酸还原酶(LYS2)的基因等和具有大肠菌的选择标记(药剂耐性基因等)。

[0084] 在本说明书中，基因或DNA的“导入”不仅意指在细胞中导入基因或DNA，而且也指使之表达。在基因或DNA的导入中，有转化、转导、转染、共转染、电穿孔等的方法。向酵母细胞导入时，具体而言，例如有使用乙酸锂的方法、原生质体法等。被导入的DNA，可以以质粒的形态存在，或者也可以在宿主的基因中插入或引起和宿主的基因同源重组而插入染色体。

[0085] 宿主的酵母是纤维素非水解性酵母，它能够是野生型酵母。酵母的种类没有特别限定，特别优选属于酿酒酵母菌属的酵母，优选酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。优选是工业酵母的野生型酵母。野生型酵母也可以进行基因重组，使其提高从作为基质的单糖(例如葡萄糖)的醇的发酵能力。

[0086] “工业酵母”是指在以往乙醇发酵中可以使用的任意酵母(例如，清酒酵母、烧酒酵母、酒酵母、啤酒酵母、面包酵母等)。在工业酵母中也具有高的乙醇发酵能力和高的乙醇耐性，也优选在遗传学上稳定的清酒酵母。“工业酵母”是具有高乙醇耐性的酵母，优选是在乙醇浓度10％以上也能够生存的酵母。还优选具有耐酸性、耐热性等。更优选能够具有凝集性。例如，作为具有这样性质的工业酵母，可以列举能够由独立行政法人制品评价基盘机构购入的酿酒酵母菌NBRC1440株(MATα，1倍体酵母，具有耐热性、耐酸性，具有凝集性)和NBRC1445株(MATa，1倍体酵母，具有耐热性、耐酸性，无凝集性)。

[0087] 由于工业酵母对乙醇具有极高的耐性，因此在生产单糖后能够直接供给乙醇发酵。其中，由于工业酵母在各种培养压力强从而难以严密控制而形成过于严酷的培养条件时的工业生产中也显示稳定的细胞增殖，故而优选。另外，由于工业酵母是多倍体，因此能够在同源染色体中插入多个基因构筑体(表达载体)，其结果，与在作为一倍体的大量实验室酵母中插入时相比，目的蛋白质的表达量变高。

[0088] 工业酵母在多数场合下是原氧型微生物，不具有用于选拔转化体的适当的营养缺陷型标记。因此，通过对工业酵母(特别是不具有营养缺陷型的酵母，乙醇耐性高(优选在乙醇浓度10％以上也能够生存)的酵母)赋予导入目的的基因适合的特定的营养缺陷型标记，目的的基因导入变得容易。作为营养缺陷型标记，从其基因操作上的利用出发，可以列举尿嘧啶缺陷型、色氨酸缺陷型、亮氨酸缺陷型、组氨酸缺陷型等，但不限定于此。关于尿嘧啶缺陷型，可以通过使从尿嘧啶缺陷型变异株(例如，酿酒酵母菌MT-8株)获得的-ura3 片断与工业酵母的正常ura3基因替换而赋予。关于尿嘧啶缺陷型以外的营养缺陷型(例如，色氨酸缺陷型、亮氨酸缺陷型、组氨酸缺陷型等)，例如，根据在非专利文献4中记载的方法，能够通过设计片段破坏这些基因而赋予。

[0089] 如上说明地，导入以插入上述表达框而表达为目的的基因的工业酵母能够以酵母选择标记(例如，上述营养缺陷型标记)选择。还能够通过测定表达的蛋白质的活性而确认。蛋白质固定于细胞表层，例如，能够通过使用抗蛋白质抗体和FITC标识抗IgG抗体的免疫抗体法确认。

[0090] (乙醇的制造)

[0091] 如上所述的纤维素水解力强化酵母能够在乙醇的生产中合适地使用。为了生产乙醇，能够使纤维素水解力强化酵母在纤维素基质(例如，在以下说明那样的纤维素类物质)中反应。

[0092] 所谓“纤维素类物质”在本说明书中是指含有纤维素的任意物质、产物和组合物。所谓“纤维素”是指通过β1，4-葡萄糖苷键连接吡喃型葡萄糖的纤维素高分子，但也包括其衍生物或盐、或由于分解而聚合度下降的物质。

[0093] 在“纤维素类物质”中，例如，也包括如在纸的制造或再生中产生的纸粕、旧衣服和废毛巾等的棉制品及农业上不被收获或在食品制造过程中被废弃的木材的木质部或草本性植物的茎叶部和表皮部(特别是非可食用部分)那样的含有纤维素的任意材料。在“纤维素类物质”中，也能够包括纤维素被羧甲基化的羧甲基纤维素(CMC)、磷酸膨润纤维素和结晶性纤维素(例如微晶粉末纤维素)等的纤维素化合物。在纤维素化合物中，为了测定能够水解纤维素的酶的纤维素水解力，磷酸膨润纤维素是作为实际的生物质的纤维素的代替基质而经常使用的纤维素。

[0094] 在上述例示的含有纤维素的材料(特别是木材的木质部及草本性植物的茎叶部和表皮部)能够含有以纤维素为主要成分之一的植物细胞壁成分。除了纤维素以外，植物细胞壁在成分中通常包括半纤维素和木质素。依赖于植物种类(特别是木材或草本性)或植物的生长程度等，这些成分的含量能够变动，但只要含有纤维素，则能够无关于生长程度地使用任意一种。

[0095] 因此，作为纤维素类物质，另外也可以列举含有上述植物细胞壁成分的任意物质和废弃物及产物。另外，不溶性食物纤维也包括在“植物细胞壁成分含有物”中。除了上述木材的木质部和草本性植物的茎叶部、表皮部以外，也包括从这些部分加工的加工物(例如，不溶性食物纤维)，但本发明从再利用方面出发优选使用废弃的废物。

[0096] 作为纤维素类物质，除了纤维素化合物本身和包括纤维素化合物的组合物以外，可以列举稻秸、竹、甘蔗渣、麦秸、玉米穗轴等的农产废弃物、木材质(木材屑、废材)、旧报纸、杂志、硬纸板、办公废纸、棉短绒、棉、纸浆和从造纸厂排出的废纸浆等。

[0097] 在上述反应中，也可以包括纤维素酶。“纤维素酶”包括可以作为酶而单独分离的任意形态。例如，作为“纤维素酶”，可以列举从生产如上面说明那样的纤维素酶(即内切葡聚糖酶)的微生物单独分离精制的酶和使用纤维素酶通过基因重组生产的酶。也能够使用市售的纤维素酶。作为市售的纤维素酶，例如，可以列举Genencor公司的Cellulase SS：来自里氏木霉的纤维素酶：效价7.6FPU/mL(“FPU”是“Filter Paper Unit”的略称，以从滤纸1分钟内生成相当于1μmol的葡萄糖的还原糖的酶量作为“1FPU”)。特别在工业性制造乙醇时，为了促进生产效率，在与纤维素类物质反应时，还可以添加纤维素酶。

[0098] 在上述反应中，还可以添加半纤维素分解性的木糖利用性酵母。该酵母能够如以下操作地制作。木糖能够从以纤维素为主要成分之一的植物细胞壁成分中含有的半纤维素通过酶分解而得到。为了木糖利用性，通过另外制作表达木糖利用性基因和/或编码木聚糖分解酶的基因的酵母(优选工业酵母)，能够在乙醇发酵中也利用来自半纤维素的木糖。分解半纤维素的酶(例如，木聚糖分解酶)优选在工业酵母的细胞表层表达。作为木聚糖分解酶，例如，可以列举木聚糖酶(特别来自里氏木霉的XYL II)和β-木糖苷酶(来自米曲霉的XylA)。作为木糖利用性基因，可以列举木糖代谢类酶的基因，例如，木糖还原酶(XR)基因和木糖醇脱氢酶(XDH)基因(都来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis))及木糖酮激酶(XK)基因(来自酿酒酵母菌)。

[0099] 例如，为了制作兼具木聚糖分解(半纤维素分解)和木糖利用性的工业酵母，能够进行重组制备，使其在细胞表层中表达木聚糖酶(特别是来自里氏木霉的XYL II(INSD接收序号X69574；S51975))和β-木糖苷酶(来自米曲霉基因XylA(INSD接收序号ABO13851)、并且表达木糖利用性基因(特别来自树干毕赤酵母(XR)基因XYL1(INSD接收序号X59465)、来自树干毕赤酵母(XDH)基因XYL2(INSD接收序号X55392)和来自酿酒酵母菌的木糖酮激霉(XK)基因XKS 1(INSD接收序号X82408)。关于表达载体的构筑和转化，非专利文献1和非专利文献5～7中有记载。也将通过该重组制备得到的酵母称为半纤维素分解性木糖利用性酵母。关于转化酵母的重组制备，也能够如上记载地实施。

[0100] 上述反应工序通常能够在进行乙醇发酵的条件下进行。在本说明书中，也将该反应工序称为发酵工序。例如，发酵工序能够以含有纤维素类物质的培养基培养酵母而进行。发酵工序通常能够在进行乙醇发酵的条件下进行。在发酵培养基中，还能够包含在酵母的生长中必须或希望的成分。作为该发酵工序的形式，可以列举间歇(分批)工序、流加间歇工序、反复间歇工序、连续工序等，但也可以是这些的任一种。另外，发酵时的温度通常能够为约30～35℃。发酵pH优选为约4～约6、更优选为约5。发酵培养能够厌氧地进行(例如，溶氧浓度能够为约1ppm以下、更优选为约0.1ppm以下、更加优选为约0.05ppm以下)。酵母的负荷量、纤维素类物质的负荷量和发酵时间等主要因素能够依赖于发酵反应的容量、乙醇的目的产量等要件适当决定。

[0101] 由于随着发酵的进行，乙醇的发酵条件变化，因此，优选在一定的范围内调节这些条件。例如，发酵的经时变化可以以气体色谱、HPLC等本领域技术人员通常使用的方法监控。

[0102] 纤维素类物质可以在供给发酵工序前进行加压热水处理。作为加压热水处理，例如，可以列举在专利文献1中记载的无催化剂水热法。使用该无催化剂水热法，例如，形成适当长度的纤维素单元或寡糖，或切断纤维之间(例如，纤维素之间)的交联，使纤维素分解酶变得容易作用地进行处理。在专利文献1中记载的方法中，间歇(分批)式时也依赖于处理浓度，但能够以120～300℃、优选以150～280℃、更优选以180～250℃处理约10质量％浓度原料的纤维素纤维，这样处理时间一般优选1小时～15秒的范围。连续法时，由于热历史时间的关系，能够提高若干温度，能够以120～373℃、优选以150～320℃、优选以1小时～1秒处理约10质量％浓度原料的纤维素纤维。另外，加压是能够由装置以自动或手动设定为上述范围内的温度能够实现程度的压力。

[0103] 木材的木质部和草本性植物的茎叶部与表皮部(生物质)能够预先除去木质素那样的非糖化部分。在木质素的除去中，能够使用加压热水处理。加压热水处理由于能够不使用酸或碱等的药剂除去木质素，故而优选。作为这样的加压热水处理，能够使用在专利文献1中记载 的方法。另外，也能够使用在专利文献3中记载的方法。在专利文献3的方法中，通过以常压以上5MPa以下且180℃以上374℃以下的热水处理生物质，接着冷却到100℃以上180℃以下，分离木质素。

[0104] 在供给发酵工序前，例如，按照在专利文献1中记载的方法，能够加压热水处理纤维素类物质。由此，木质素(存在时)被除去，这样，能够以能够水解纤维素的酶容易地发挥作用的方式处理纤维素。

[0105] 发酵工序结束后，从发酵槽取出含有乙醇的培养基，例如，通过离心分离机进行分离操作和蒸馏操作等本领域技术人员通常使用的分离工序，单独分离乙醇。

[0106] 纤维素水解力强化酵母(根据需要，和半纤维素分解性木糖利用性酵母及纤维素酶)优选固定于载体上。由此，能够再利用。

[0107] 固定的载体和方法可以使用本领域技术人员通常使用的载体和方法，例如，可以列举载体结合法、包埋法、交联法等。

[0108] 作为载体，可以优选使用多孔质体。例如，优选聚乙烯醇、聚氨酯泡沫、聚苯乙烯泡沫、聚丙烯酰胺、聚乙烯缩甲醛树脂多孔质体、硅泡沫等的发泡体或树脂。多孔质体的开口部分大小能够考虑使用的微生物及其大小而决定，但在工业酵母时，优选为50～1000μm。

[0109] 另外，不限定载体的形状。如果考虑载体的强度、培养效率等，则优选球状或立方体。大小可以由使用的微生物决定，一般在球状时，优选直径为2～50mm，在立方体状时，优选2～50mm见方。

[0110] 酵母通过在供给发酵前在好氧条件下培养，可以使其数量增加。培养基可以是选择性培养基、也可以是非选择性培养基。培养时培养基的pH优选为约4～约6、更优选为约5。好氧培养时，培养基中的溶氧浓度优选为约0.5～约6ppm、更优选为约1～约4ppm、更加优选为约2ppm。另外，培养时的温度为约20～约45℃、优选为约25～约35℃、更优选能够为约30℃。培养时间优选培养直至总酵母的菌体浓度为20g(湿润量)/L以上、更优选培养直至50g(湿润量)/L以上、更加优选培养直至75g(湿润量)/L以上，能够为约20～约
50小时左右。

[0111] 目前，由于在糖化中使用的市售酶效价低从而为了充分糖化必须有大量酶，因此存在使用酶的成本变高的问题。通过使用纤维素水解 力强化酵母，特别在工业性制造中，可以削减实现适合的乙醇生产量或速度中需要的纤维素酶量。另外，并用半纤维素分解性木糖利用性酵母，能够提高乙醇生产量。

[0112] 以下，列举实施例说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。

[0113] 实施例

[0114] 在本实施例中使用的菌株酿酒酵母菌NBRC1440(MATα)和酿酒酵母菌MT8-1(MATa ade his3 leu2 trp1 ura3)从独立行政法人制品评价技术基盘机构购入。

[0115] 在本实施例所示的全部PCR扩增均使用KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺社)实施。

[0116] 在本实施例所示的全部酵母转化均使用YEAST MAKER酵母转化系统(Clontech Laboratories，Palo Alto，California，USA)由乙酸锂实施。

[0117] (制备例1：赋予URA3、HIS3、TRP1、LEU2的营养缺陷型标记的酵母的制备)[0118] (制备例1-1：URA3标记的赋予)

[0119] 从酿酒酵母菌MT8-1(MATa ade his3 leu2 trp1 ura3)，使用以序列序号1和序列序号2表示的引物对，通过PCR取得变异URA3片断。对酿酒酵母菌NBRC1440(MATα)株转化该片断，以5-氟乳清酸(FOA)培养基选择URA3变异株，得到赋予URA3标记的NBRC1440株。

[0120] 另外，5-氟乳清酸(FOA)培养基如下地制备。以高压蒸汽灭菌器处理添加有50mg/L尿嘧啶酸和2％(w/v)琼脂的无尿嘧啶合成右旋糖(SD)培养基(非专利文献8)，维持65℃。在二甲亚砜(DMSO)中以100mg/mL的浓度溶解FOA，在约65℃的上述高压蒸汽灭菌过的培养基中添加，使FOA的最终浓度为1mg/mL。

[0121] (制备例1-2：HIS3标记的赋予)

[0122] 如下操作，实施融合PCR：

[0123] 使用PCR1、HIS3-Green U(序列序号3：Forward)和HIS3-GreenR(序列序号4：Reverse)引物，使用酿酒酵母菌NBRC1440株的染色体DNA作为模板，扩增HIS3上游部分序列；

[0124] 使用PCR2、URA3fragment(序列序号5：Forward)和HIS3-40Uc(序列序号6：Reverse)引物，使用pRS406质粒(Stratagene社)作为模板，扩增URA3；

[0125] 使用PCR3、HIS3-Green U(序列序号3：Forward)和HIS3-40Uc(序列序号6：Reverse)引物，作为模板通过混合PCR1和PCR2的产物，扩增融合片段。

[0126] 使用该得到的融合片段，通过同源重组转化如上述制备的赋予了URA3标记的NBRC1440株。在无尿嘧啶(不含尿嘧啶的培养基)板上选择不具有尿嘧啶缺陷的株。该构筑体在插入上述工业酵母NBRC1440的染色体的同时产生HIS3基因破坏，URA3标记及其两侧的重复序列插入染色体内。

[0127] 接着，将该转化体在30℃、YPD培养基中使之增殖24小时。接着，在5-FOA培养基7
板上使之增殖至1.0×10 细胞/200μL。在5-FOA培养基板上增殖的全部菌落是尿嘧啶缺-
陷型(Ura)的表现型，选择该菌落。在5-FOA培养基板上增殖的转化体中，由于在URA3标记两侧的重复序列产生同源重组，应当通过转化导入的URA3标记从染色体除去，显示尿嘧-
啶缺陷型(Ura)的表现型。

[0128] 最终，可以得到HIS3基因和URA3基因缺失而具有这些营养缺陷型的株，即，可以得到赋予URA3和HIS3标记的NBRC1440株。

[0129] (制备例1-3：TRP1标记的赋予)

[0130] 如下操作，实施融合PCR：

[0131] 使用PCR1、TRP1-988(序列序号7：Forward)和RP1-28r(序列序号8：Reverse)引物，使用酿酒酵母菌NBRC1440株的染色体DNA作为模板，扩增TRP1上游部分序列；

[0132] 使用PCR2、TRP1-URA3(序列序号9：Forward)和TRP1-40r(序列序号10：Reverse)引物，使用pRS406质粒(Stratagene社)作为模板，扩增URA3；

[0133] 使用PCR3、TRP1-988(序列序号7：Forward)和TRP1-40r(序列序号10：Reverse)引物，作为模板通过混合PCR1和PCR2的产物，扩增融合片段。

[0134] 使用该融合片段，与制备例1-2同样操作，转化如上制备的赋予 HIS3和URA3标记的NBRC1440株，最终得到赋予URA3、HIS3和TRP1标记的NBRC1440株。

[0135] (制备例1-4：LEU2标记的赋予)

[0136] 如下操作，实施融合PCR：

[0137] 使用PCR1、LEU2-UP 3rd(序列序号11：Forward)和LEU2-down3rd(序列序号12：Reverse)引物，使用酿酒酵母菌NBRC1440株的染色体DNA作为模板，扩增LEU2上游部分序列；

[0138] 使用PCR2、LEU2-URA33rd(序列序号13：Forward)和LEU2-40r(序列序号14：Reverse)引物，使用pRS406质粒(Stratagene社)作为模板，扩增URA3；

[0139] 使用PCR3、LEU2-UP 3rd(序列序号11：Forward)和LEU2-40r(序列序号14：Reverse)引物，作为模板通过混合PCR1和PCR2的产物，扩增融合片段。

[0140] 使用该融合片段，与制备例1-2同样操作，转化如上制备的赋予URA3、HIS3和TRP1标记的NBRC1440株，最终，得到赋予URA3、HIS3和TRP1与LEU2标记的NBRC1440株。为了方便，将该株表示为“NBRC1440/UHWL”。

[0141] (制备例2：pRS406EG CBH2的制备)

[0142] 首先，构筑具有尿嘧啶基因(URA3)标记且用于插入来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的内切葡聚糖酶II(EG II)基因使其在表层表达的质粒pGK406EG。

[0143] 作为模板使用pEG23u31H6(非专利文献10)，使用序列序号15(Forward)和序列序号16(Reverse)的引物对，通过PCR制备编码来自米根霉(Rhizopus oryzae)的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、EGII基因和α-凝集素基因的3′侧一半区域(非专利文献9)的2719bpDNA片段。

[0144] 以酿酒酵母菌BY4741基因组群为模板，使用分别设计的PGK启动子用引物对(序列序号17：Forward和序列序号18：Reverse)和PGK终止子用引物对(序列序号19：Forward和序列序号20：Reverse)，进行PCR扩增2个DNA片断：PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子和PGK终止子。通过设计的多克隆位点用引物对(序列序号21：Forward和序列序号22：Reverse)进行退火制备多克隆位点。分别以XhoI和NheI消化PGK启动子，以NheI和BglII消化多克隆位点，以BglII和NotI消化PGK终止子，将其克隆入pTA2载体(TOYOBO，Osaka，Japan)的XhoI-NotI位点。以XhoI和NotI消化得到的载体，将其片断向pRS406(Stratagene)克隆，将得到的载体作为pGK406。

[0145] 以NheI和XmaI消化上述2719bp DNA片段，在含有URA3基因及其启动子和终止子、PGK启动子、PGK终止子的质粒pGK406的NheI部位和XmaI部位之间插入，得到含有URA3基因及其启动子和终止子、PGK启动子、来自木根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、内切葡聚糖酶(EGII)基因、α-凝集素基因的3′侧一半区域和PGK终止子的质粒。将得到的质粒命名为pGK406EG。

[0146] 以质粒pFCBH2w3(非专利文献11)为模板，由引物对(序列序号23：Forward和序列序号24：Reverse)以PCR扩增含有GAPDH(甘油醛三磷酸脱氢酶)启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、来自里氏木霉的CBH2基因、α-凝集素基因的3′侧一半区域和GAPDH终止子的片断。以NotI消化得到的片断，然后，在以NotI消化的Pgk405EG中克隆。将得到的质粒作为pRS406EG CBH2，在图1中表示其模式图。图1中，“URA3”表示尿嘧啶基因标记，“GAPDH”表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、“PGK”表示磷酸甘油酸激酶、“s.s.”表示来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、“AG”表示α-凝集素基因的3′侧一半区域、“EG”表示来自里氏木霉的EG II基因、“CBH2”表示来自里氏木霉的纤维二糖水解酶2基因、“tGAP”表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子，然后，“tPGK”表示磷酸甘油酸激酶终止子。

[0147] (制备例3：pRS403EG CBH2的制备)

[0148] 首先，构筑用于具有组氨酸基因(HIS3)标记且用于插入来自里氏木霉的内切葡聚糖酶II(EG II)基因使其在表层表达的质粒pGK403EG。

[0149] 从pGK406以ApaI和NotI切出含有PGK启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、EG II基因和PGK终止子的片断，同样地在以ApaI和NotI消化pRS403(Stratagene)，克隆上述片断。将 得到的质粒作为pGK403EG。

[0150] 以质粒pFCBH2w3为模板，由引物(序列序号23：Forward和序列序号24：Reverse)以PCR扩增含有GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、来自里氏木霉的CBH2基因、α-凝集素基因的3′侧一半区域和GAPDH终止子的片断。以NotI消化得到的片断，然后，在以NotI消化的pGK403EG中克隆。将得到的质粒作为pRS403EG CBH2，在图2中表示其模式图。图2中，“HIS3”表示组氨酸基因标记，除此以外的标记与图1相同。

[0151] (制备例4：pRS405EG CBH2的制备)

[0152] 首先，构筑用于具有亮氨酸基因(LEU2)标记且用于插入来自里氏木霉的内切葡聚糖酶II(EG II)基因使其在表层表达的质粒pGK405EG。

[0153] 从pGK406以ApaI和NotI切出含有PGK启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、EG II基因和PGK终止子片断，同样地在以ApaI和NotI消化的pRS405(Stratagene)中克隆。将得到的质粒作为pGK405EG。

[0154] 以质粒pFCBH2w3为模板，由引物(序列序号23：Forward和序列序号24：Reverse)以PCR扩增含有GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、来自里氏木霉的CBH2基因、α-凝集素基因的3′侧一半区域和GAPDH终止子的片断。以NotI消化得到的片断，然后，在以NotI消化的pGK405EG中克隆。将得到的质粒作为pRS405EG CBH2，在图3中表示其模式图。图3中，“LEU2”表示亮氨酸基因标记，除此以外的标记与图1相同。

[0155] (制备例5：pILGP3-CBH2的制备)

[0156] 以pUGP3(非专利文献12)为模板，使用XYL2c-XhoI(F)(序列序号25：Forward)和XYL2c-NotI(R)(序列序号26：Reverse)的引物对，以PCR扩增编码GAPDH启动子、多克隆位点(SalI、XbaI、BamHI、SmaI、XmaI)和GAPDH终止子的基因序列。在pRS405(Stratagene)的XhoI/NotI点导入该片断，得到质粒pILGP3。

[0157] 以XmaI和XbaI消化来自如上述制备例2至4中记载地制备的质粒pFCBH2w3的2816bp DNA片段，在含有GAPDH启动子和GAPDH终止子的质粒pILGP3的XmaI部位和XbaI部位之间插入，得到含有LEU2基因及其启动子和终止子、GAPDH启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、来自里氏木霉的葡糖淀粉酶(CBH2)基因、α-凝集素基因的
3′侧一半区域和GAPDH终止子的质粒。将得到的质粒命名为pILGP3CBH2，在图4中表示其模式图。图4中，“LEU2”表示亮氨酸基因标记，除此以外的标记与图1相同。

[0158] (制备例6：pRS405CBH2CBH2的制备)

[0159] 以质粒pFCBH2w3作为模板，由引物(序列序号23：Forward和序列序号24：Reverse)以PCR扩增含有GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列和来自里氏木霉的CBH2基因与α-凝集素基因的3′侧一半区域、GAPDH终止子的片断。以NotI消化得到的片断，然后，在以NotI消化的pILGP3-CBH2中克隆。将得到的质粒作为pRS405CBH2CBH2，在图5中表示其模式图。图5中，“LEU2”表示亮氨酸基因标记，除此以外的标记与图1相同。

[0160] (制备例7：pIWBGL的制备)

[0161] 使用质粒pBG211(由京都大学赠与)作为模板，使用bgl1引物-1(序列序号27：Forward)和bgl1引物-2(序列序号28：Reverse)的引物对，通过PCR制备编码来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶1(BGL1)基因的2.5kbp NcoI-XhoI DNA片段。以NcoI和XhoI消化该DNA片段，在含有来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列和α-凝集素基因的3′侧一半区域(非专利文献9)的细胞表层表达质粒pIHCS(非专利文献10)的NcoI-XhoI部位插入。将得到的质粒命名为pIBG13。

[0162] 以该pIBG13作为模板，使用引物对(序列序号23：Forward和序列序号24：Reverse)进行PCR，得到含有GAPDH启动子、来自米根霉的葡糖淀粉酶分泌信号序列、BGL1基因、α-凝集素基因的3′侧一半的区域和GAPDH终止子的片断。以NotI消化该片断，然后在以NotI消化的pRS404中克隆。以得到的质粒为pIWBGL，在图6中表示其模 式图。图
6中，“TRP1”表示色氨酸基因标记、“GAPDH”表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、“s.s.”表示来自米根霉的葡糖淀粉酶基因的分泌信号序列、“AG”表示α-凝集素基因的3′侧一半的区域，然后，“BGL”表示来自棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶1(BGL1)基因。

[0163] (制备例8：插入拷贝数1的内切葡聚糖酶II的酵母株的制备)

[0164] 以用限制性酶NdeI切断为直线状的pGK406EG对NBRC1440/UHWL进行转化，在无尿嘧啶(不含尿嘧啶的培养基)板上选择不具有尿嘧啶缺陷型的株。通过以pGK406EG的转化，NBRC1440/UHWL的被破坏的URA3基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pGK406EG”。在本制备例8中，制作拷贝数1的内切葡聚糖酶II的表层表达株。

[0165] (制备例9：以拷贝数1共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0166] 以用限制性酶NdeI切断为直线状的pRS406EG CBH2对NBRC1440/UHWL进行转化，在无尿嘧啶(不含尿嘧啶的培养基)板上选择不具有尿嘧啶缺陷型的株。通过以pRS406EG CBH2的转化，NBRC1440/UHWL的被破坏的URA3基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406EG CBH2”，也简化为“NBRC1440/EG-CBH2-1c”。在本制备例9中，制作拷贝数1的内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的表层表达株。

[0167] (制备例10：以拷贝数2共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0168] 以用限制性酶NdeI切断为直线状的pRS403EG CBH2对NBRC1440/pRS406EG CBH2进行转化，在无组氨酸(不含组氨酸的培养基)板上选择不具有组氨酸缺陷型的株。通过以pRS403EG CBH2的转化，NBRC1440/pRS406EG CBH2的被破坏的HIS3基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406EG CBH2/pRS403EG CBH2”，也简化为“NBRC1440/EG-CBH2-2c”。在本制备例10中，制作拷贝数2的内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的表层表达株。

[0169] (制备例11：以拷贝数3共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0170] 以限制性酶HpaI切断为直线状的pRS405 EG CBH2对NBRC1440/pRS406EG CBH2/pRS403EG CBH2进行转化，在无亮氨酸(不含亮氨酸的培养基)板上选择不具有亮氨酸缺陷型的株。通过以pRS405EGCBH2的转化，NBRC1440/pRS406EG CBH2/pRS403EG CBH2的被破坏的LEU2基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2/pRS405 EGCBH2”，也简化为“NBRC1440/EG-CBH2-3c”。在本制备例11中，制作拷贝数3的内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的表层表达株。

[0171] (制备例12：以拷贝数1共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2，再插入拷贝数1的纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0172] 以限制性酶HpaI切断为直线状的pILGP3-CBH2对NBRC1440/pRS406EG CBH2进行转化，在无亮氨酸(不含亮氨酸的培养基)板上选择不具有亮氨酸缺陷型的株。通过以pILGP3-CBH2的转化，NBRC1440/pRS406EG CBH2的被破坏的LEU2基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406EGCBH2/pILGP3-CBH2”，也简化为“NBRC 1440/EG-CBH2-1c-CBH2”。在本制备例12中，制作拷贝数1的内切葡聚糖酶II和拷贝数2的纤维二糖水解酶2的表层表达株。

[0173] (制备例13：以拷贝数1共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2，再插入拷贝数2的纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0174] 以限制性酶HpaI切断为直线状的pRS405CBH2CBH2对NBRC1440/pRS406EG CBH2进行转化，在无亮氨酸(不含亮氨酸的培养基)板上选择不具有亮氨酸缺陷型的株。由以pRS405CBH2CBH2的转化，NBRC1440/pRS406EG CBH2的被破坏的LEU2基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406EGCBH2/pRS405CBH2CBH2”，也简化为“NBRC1440/EG-CBH2-1c-CBH2×2”。在本制备例13中，制作拷贝数1的内切葡聚糖酶II和拷贝数3的纤维二糖水解酶2的表层表达株。

[0175] (制备例14：表层表达β-葡萄糖苷酶1基因的插入)

[0176] 以Bst1107I切断为直线状的pIWBGL分别对NBRC1440/EG- CBH2-1c(制备例9)、NBRC1440/EG-CBH2-2c(制备例10)、NBRC1440/EG-CBH2-3c(制备例11)进行转化。在无色氨酸(不含色氨酸的培养基)板上选择不具有色氨酸缺陷型的株。通过以pIWBGL的转化，各个被破坏的TRP1基因恢复，由此确认β-葡萄糖苷酶1基因的导入。因此，得到在拷贝数1、2或3的内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的表层表达株中，进一步在表层表达β-葡萄糖苷酶1的株。将得到的各个转化株简化为“NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL”、“NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL”和“NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL”(为了方便，也将这些转化株称为“纤维素酶表层表达酵母”)。

[0177] (实施例1：纤维素水解力评价)

[0178] 通过使从上述制备例8至13得到的各种酵母与磷酸膨润纤维素(PSC：由非专利文献13制备)反应，测定它们的纤维素水解力。反应条件如下：50mM柠檬酸缓冲液、10mg/mL PSC、酵母OD600＝3.0、反应时间24小时。活性测定中，通过Somogyi-Nelson法对使PSC分解而生成的还原糖进行定量。以每1g酵母在1分钟内生成相当于1μ摩尔的葡萄糖的还原力的活性作为1U。

[0179] 图7是表示各种表达内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的酵母的纤维素水解力的图表。图中，纵轴表示每1g酵母细胞的酶活性(mU/gcell)。图中，从横轴左边表示以下酵母株的结果：

[0180] NBRC1440(图中“1440”)、

[0181] NBRC1440/pGK406EG(图中“EG”：制备例8：插入拷贝数1的内切葡聚糖酶II的酵母株)、

[0182] NBRC1440/EG-CBH2-1c(图中“EG CBH2”：制备例9：以拷贝数1共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株)、

[0183] NBRC1440/EG-CBH2-1c-CBH2(图中“EG CBH2”的“CBH2”：制备例12：以拷贝数1共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2，再插入拷贝数1的纤维二糖水解酶2的酵母株)、

[0184] NBRC1440/EG-CBH2-1c-CBH2×2(图中“EG CBH2”的“CBH2×2”：制备例13：以拷贝数1共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2，再插入拷贝数2的纤维二糖水解酶2的酵母株)、

[0185] NBRC1440/EG-CBH2-2c(图中“EG CBH2”的“×2”：制备例 10：以拷贝数2共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株)和

[0186] NBRC1440/EG-CBH2-3c(图中“EG CBH2”的“×3”：制备例11：以拷贝数3共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株)。

[0187] 为了纤维素水解力的强化，使CBH(作用于结晶性纤维素)的拷贝数增加，提高认为是水解最困难的结晶性部分的水解。但是，由此可知，在使CBH的拷贝数增加的同时使EG的拷贝数同时增加，PSC的分解力大大地提高。

[0188] (实施例2：乙醇发酵试验)

[0189] 在实施例1中，通过“EG CBH2”的插入使拷贝数增加，从而PSC分解活性上升。因此，在本实施例中，分别使用插入“EG CBH2”的2个表达框(EG和CBH2的2个基因表达框)的载体为1个拷贝、2个拷贝和3个拷贝的株，进行从PSC的乙醇发酵。

[0190] 在本实施例中，如制备例14中记载，使用在这些3种株(NBRC1440/EG-CBH2-1c、NBRC1440/EG-CBH2-2c、NBRC1440/EG-CBH2-3c)中分别插入pIWBGL(β-葡萄糖苷酶表层表达表达载体)的株。即，使用了“NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL”、“NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL”和“NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL”的3种纤维素酶表层表达酵母。

[0191] 在添加了必须氨基酸的SD培养基(合成右旋糖培养基：含有6.7g/L氨基酸以外的酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids)[Difco社生产]和适当的补充物：20g/L的葡萄糖作为单一碳源添加)中，以pH约5.0、约30℃、好氧(溶氧浓度：约2ppm)预培养24小时，接着，在YPD培养基(含有酵母提取物、多聚蛋白胨、右旋糖培养基：10g/L的酵母提取物、20g/L的多聚蛋白胨、20g/L的葡萄糖)中，以同样条件下培养48小时。在4℃，通过6000×g的离心分离10分钟将培养上清和细胞颗粒分离，得到细胞颗粒。

[0192] 在含有11.2g/L的PSC、10g/L的酵母提取物、20g/L的多聚蛋白胨、50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)和0.5g/L的二亚硫酸钾的发酵培养基中接种该细胞颗粒。继续发酵以约30℃厌氧实施(溶氧浓度：约0.05ppm)。在发酵开始时，将细胞浓度调整为75g/L(湿润细胞)。根据加入的PSC为11.2g/L，乙醇的理论收率为5.7g/L。

[0193] 以HPLC测定发酵中的乙醇浓度。HPLC分析通过使用折射率(RI)检测器(L-2490RI detector，日立制作所生产)实施。在分离中使用的柱是Snim-pack SPR-Pb Column(岛津制作所生产)。作为移动相，使用0.6mL/分钟流速的水，在80℃操作HPLC。

[0194] 在图8中表示该结果。图8是表示由使以内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的拷贝数依次增多的3种纤维素酶表层表达酵母NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL、NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL产生的PSC为材料发酵而生成的乙醇量经时变化的图表。在图8中，左边的纵轴表示乙醇浓度(g/L)，横轴表示经过时间(小时)。黑圆点表示插入NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL(内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2合计3个拷贝)的酵母产生乙醇的量、黑三角表示插入NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL(内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2合计2个拷贝)的酵母产生乙醇的量，黑四边形表示插入NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL(内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2合计1个拷贝)的酵母产生乙醇量的结果。

[0195] 显示：相对于1个拷贝的β-葡萄糖苷酶，在增加内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的拷贝数的同时，从PSC的乙醇发酵收率变高。NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL(这是对1个拷贝的β-葡萄糖苷酶插入3个拷贝内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的酵母)，在48h中，相对理论收率为52.6％的收率。

[0196] (制备例15：纤维素酶分泌酵母)

[0197] 以下，说明插入β-葡萄糖苷酶使其表层表达且插入葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶使其分泌的酵母(为了方便也将其称为“纤维素酶分泌酵母”)的制备顺序。

[0198] (制备例15-1：pRS403/ssEG2-CBH2质粒)

[0199] 构筑具有组氨酸基因(HIS3)标记且用于插入内切葡聚糖酶II(EGII)及纤维二糖水解酶2(CBH2)使其分泌的质粒pRS403/ssEG2-CBH2。

[0200] 以pUGP3(非专利文献12)为模板，使用XYL2c-XhoI(F)(序列序号25：Forward)和XYL2c-NotI(R)(序列序号26：Reverse)的引物对，以PCR扩增GAPDH启动子、多克隆位点(SalI、XbaI、BamHI、 SmaI、XmaI)、GAPDH终止子编码的基因序列。在pRS403(Stratagene)的XhoI/NotI点导入该片段，得到质粒pIHGP3。

[0201] 作为模板使用pEG23u31H6(非专利文献10)，使用序列序号29(Forward)和序列序号30(Reverse)的引物对，通过PCR制备含有来自米根霉的葡萄糖苷酶基因的分泌信号序列和来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(EGII)基因的1308bp DNA片段。

[0202] 以SmaI消化上述1308bp DNA片段，在含有HIS3基因及其启动子和终止子、GAPDH启动子、GAPDH终止子的质粒pIHGP3的SmaI部分插入，得到含有HIS3基因及其启动子和终止子、GAPDH启动子、葡萄糖苷酶基因的分泌信号序列、EG II基因和GAPDH终止子的质粒。将得到的质粒命名为pRS403/ssEG2。

[0203] 以质粒pFCBH2w3(非专利文献11)为模板，使用序列序号31(Forward)和序列序号32(Reverse)的引物对，通过PCR制备含有来自米根霉的葡萄糖苷酶基因的分泌信号序列表和来自里氏木霉的CBH2基因的1416bpDNA片段。

[0204] 以SmaI消化上述1416bp DNA片段，在含有HIS3基因及其启动子和终止子、GAPDH启动子、GAPDH终止子的质粒pIHGP3的SmaI部分插入，得到含有HIS3基因及其启动子和终止子、GAPDH启动子、葡萄糖苷酶基因的分泌信号序列、CBH2基因和GAPDH终止子的质粒。将得到的质粒命名为pRS403/ssCBH2。

[0205] 以质粒pFCBH2w3为模板，利用引物(序列序号23：Forward和序列序号24：Reverse)，通过PCR扩增含有GAPDH(甘油醛三磷酸脱氢酶)启动子、来自米根霉的葡萄糖苷酶基因的分泌信号序列、来自里氏木霉的CBH2基因和GAPDH终止子的片断。以NotI消化得到的片断，在以NotI消化的pRS403/ssEG2中克隆。将得到的质粒命名为pRS403/ssEG2-CBH2。

[0206] (制备例15-2：pRS405/ssEG2-CBH2质粒)

[0207] 通过以ApaI和NotI消化pRS403/ssCBH2得到含有GAPDH启动子、来自米根霉的葡萄糖苷酶基因的分泌信号序列、纤维二糖水解酶2(CBH2)基因和GAPDH终止子的片断。

[0208] 以ApaI和NotI消化具有LEU2基因标记的pRS405(Stratagene)，插入上述得到的片断。将得到的质粒命名为pRS405/ssCBH2。

[0209] 以质粒pRS403/ssEG2为模板，利用引物(序列序号23：Forward和序列序号24：Reverse)以PCR进行扩增。以NotI消化得到的片断，在以NotI消化的pRS405/ssCBH2中克隆。将得到的质粒命名为pRS405/ssEG2-CBH2。

[0210] (制备例15-3：pRS406/ssEG2-CBH2质粒)

[0211] 通过以ApaI和NotI消化pRS403/ssCBH2，得到含有GAPDH启动子、来自米根霉的葡萄糖苷酶基因的分泌信号序列、纤维二糖水解酶2(CBH2)基因和GAPDH终止子的片断。

[0212] 以ApaI、NotI消化具有URA3基因标记的pRS406(Stratagene)，插入上述得到的片断。将得到的质粒命名为pRS406/ssCBH2。

[0213] 以质粒pRS403/ssEG2为模板，利用引物(序列序号23；Forward和序列序号24；Reverse)以PCR进行扩增。以NotI消化得到的片断，在以NotI消化的pRS406/ssCBH2中克隆。将得到的质粒命名为pRS406/ssEG2-CBH2。

[0214] (制备例15-4：以拷贝数1共同插入分泌型内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0215] 以限制性酶NdeI切断为直线状的pRS406/ssEG2-CBH2对NBRC1440/UHWL进行转化，在无尿嘧啶(不含尿嘧啶的培养基)板上选择不具有尿嘧啶缺陷型的株。通过以pRS406/ssEG2-CBH2的转化，NBRC1440/UHWL的被破坏的URA3基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406/ssEG2-CBH2”，也简化为“NBRC1440/ss-EG-CBH2-1c”。在本制备例中，制作拷贝数1的内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的分泌株。

[0216] (制备例15-5：以拷贝数2共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0217] 以限制性酶NdeI切断为直线状的pRS403/ssEG2-CBH2对NBRC1440/pRS406/ssEG2-CBH2进行转化，在无组氨酸(不含组氨酸的培养基)板上选择不具有组氨酸缺陷型的株。通过以pRS403/ssEG2-CBH2的转化，NBRC1440/pRS406/ssEG2-CBH2的被破坏的HIS3基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406/ssEG2-CBH2/pRS403/ssEG2-CBH2”，也简化为“NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c”。在本制备例中，制作拷贝数2的内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的分泌株。

[0218] (制备例15-6：以拷贝数3共同插入内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的酵母株的制备)

[0219] 以限制性酶HpaI切断为直线状的pRS405ssEG2-CBH2对NBRC1440/pRS406/ssEG2-CBH2/pRS403/ssEG2-CBH2进行转化，在无亮氨酸(不含亮氨酸的培养基)板上选择不具有亮氨酸缺陷型的株。通过以pRS405/ssEG2-CBH2的转化，NBRC1440/pRS406/ssEG2-CBH2/pRS403/ssEG2-CBH2的被破坏的LEU2基因恢复，由此确认基因的导入。将该株命名为“NBRC1440/pRS406/ssEG2-CBH2/pRS403/ssEG2-CBH2/pRS405ssEG2-CBH2”，也简化为“NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c”。在本制备例中，制作拷贝数3的内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶2的分泌株。

[0220] (制备例15-7：β-葡萄糖苷酶1基因的插入)

[0221] 以Bst1107I切断为直线状的pIWBGL对NBRC1440/ss-EG-CBH2-1c、NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c和NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c进行转化。在无色氨酸(不含色氨酸的培养基)板上选择不具有色氨酸缺陷型的株。通过以pIWBGL的转化，各个被破坏的TRP1基因恢复，由此确认β-葡萄糖苷酶1基因的导入。将这些株简化，分别标记为“NBRC1440/ss-EG-CBH2-1c/BGL”、“NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c/BGL” 和“NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL”。在本制备例中，在从制备例-4至15-6的分泌株中，再制作表层表达1拷贝的β-葡萄糖苷酶的株。

[0222] (实施例3：关于从磷酸膨润纤维素的乙醇生产的纤维素酶表层表达酵母和纤维素酶分泌酵母的比较)

[0223] 在含有7.8g/L的PSC、10g/L的酵母提取物、10g/L的多聚蛋白胨、50mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)和0.5g/L的二亚硫酸钾的发酵培养基中接种纤维素酶表层表达酵母(制备例14)的NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL、NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL和NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL及纤维素酶分泌酵母(制备例15)的NBRC1440/ss-EG-CBH2- 1c/BGL、NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c/BGLh和NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL的任一种的细胞颗粒。继续发酵，在约30℃厌氧实施(溶氧浓度：约0.05ppm)。在发酵开始时，将细胞浓度调整为75g/L(湿润细胞)。根据加入的PSC为7.8g/L，乙醇的理论收率为4.0g/L。与实施例2同样操作，进行发酵中的乙醇浓度测定。

[0224] 在图9中表示该结果。图9是表示从纤维素酶表层表达酵母和纤维素酶分泌酵母的磷酸膨润纤维素(PSC)的乙醇生产量经时变化的图表。该图的横轴表示发酵时间(小时)、在纵轴表示乙醇生产量(g/L)。图中，黑圆点表示NBRC1440/ss-EG-CBH2-1c/BGL的结果、黑三角表示NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c/BGL的结果、黑四边形表示NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL的结果、白圆点表示NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL的结果、白三角表示NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL的结果，白四边形表示NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL的结果。

[0225] 其结果显示，纤维素酶表层表达酵母和纤维素酶分泌酵母的任1个相对于1个拷贝的β-葡萄糖苷酶，在内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的拷贝数增加的同时，从PSC的乙醇发酵收率也变高。

[0226] 工业上的可利用性

[0227] 根据本发明，可以得到纤维素的水解力提高、能够增强乙醇生产的发酵用酵母。因此，能够从纤维素类物质高效地生产乙醇，还能够降低成本。可以期待这样的酵母在从软生物质那样的废弃物向乙醇生产中的利用。