聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的用途及其药物组合物

摘要

本发明公开了聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的用途及其药物组合物，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有很强的抗CD4依赖性HIV-1感染的能力，并且对一些临床分离株也表现为很好的活性，这其中包括B’、B’C和CRF01-AE重组亚型。另外，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对CD4非依赖性的HIV-1感染也具有很好的抗感染能力。对聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的体外毒性实验发现，该化合物具有很低的毒性。最后，细胞融合实验结果表明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有抑制HIV-1病毒包膜蛋白gp120介导的融合过程的作用。聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐来源丰富，生产成本低廉，具有作为一种新型抗HIV-1药物及杀微生物剂的潜在应用价值。

权利要求

1.聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐在制备抑制HIV-1感染的药物中的应用。

说明书

聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的用途及其药物组

合物

技术领域

[0001] 本发明涉及聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的用途，还涉及含有聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐作为有效成分的药物组合物。

背景技术

[0002] 艾滋病是感染人免疫缺陷病毒 (HIV)引起的。HIV-1侵入靶细胞是一个特异性的生物学过程，其需要病毒表面的包膜蛋白gp120与细胞受体CD4结合，诱导gp120构象发生改变，继而与细胞表面的辅助受体CCR5或CXCR4结合，使得原先被gp120遮蔽的融合蛋白gp41发生构象变化，曝露出其疏水的N-末端融合肽序列并插入宿主细胞膜，从而启动病毒毒膜与细胞膜的融合，最终导致病毒核心结构进入细胞，建立感染。针对这一生物学过程，已有多种抑制剂被开发出来，例如针对辅助受体的抑制剂Maraviroc与PSC-RANTES，另外针对融合过程的抑制剂T20（已被美国FDA批准上市，商品名恩夫韦定）与C52L多肽也是很有希望的杀微生物剂候选药物。

[0003] 发现新的具有抑制HIV感染作用的化合物或天然产物，对于开发有效预防HIV传播的杀微生物剂具有重要意义。寻找创新性的先导化合物，继而开发出有效阻止HIV感染的新型杀微生物剂或药物，是本发明的目的。

[0004] 聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）（Poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid)）钠盐是一种人工合成的高分子化合物，溶于水，水溶液呈无色至淡黄色，耐热性好。由于该化合物携带有苯乙烯磺酸基团以及马来酸酐基团，因此其具有很高的阴离子分布密度，并具有很强的分散性，是一种表面活性物质。工业上苯乙烯磺酸-马来酸酐共聚物的合成技术非常成熟，通常分为先磺化后聚合方法和先聚合后磺化方法：前者先将苯乙烯单体磺化，然后在惰性溶液中进行马来酸酐共聚，反应温度通常为80-120℃；后者则是先将苯乙烯和马来酸酐共聚合，然后利用氯磺酸、浓硫酸、三氧化硫等对共聚物进行磺化。聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐在工农业中具有广泛的应用，可用于去垢剂和分散剂等，但鲜有其在医药卫生领域的应用的报道，尤其是作为抗病毒药物。

发明内容

[0005] 本发明的第一个目的是提供聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的应用，用于制备抑制HIV-1感染的药物；

[0006] 本发明的第二个目的是提供含有聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐作为有效成分的抑制HIV-1的药物组合物，该药物组合物还含有常规药用载体。

[0007] 本发明与现有技术相比具有下列优点：聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有较高的负电荷性，可以与HIV-1的胞膜蛋白gp120的V3 片段（正电荷）发生相互作用，从而可以阻断V3 片段与受体CD4的相互作用，以达到阻断HIV-1病毒进入细胞的作用，或者抑制CHO-WT与MT-2细胞的融合。体外抗病毒实验证明，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有很强的抗CD4依赖性HIV-1感染的能力，并且对一些临床分离株也表现为很好的活性，这其中包括B’、B’C和CRF01-AE重组亚型，这说明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有抗HIV-1的广谱性。另外，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对CD4非依赖性的HIV-1感染也具有很好的抗感染能力。对聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的体外毒性实验发现，该化合物具有很低的毒性。最后，细胞融合实验结果表明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有抑制HIV-1病毒包膜蛋白gp120介导的融合过程的作用。聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐来源丰富，生产成本低廉，具有作为一种新型抗HIV-1药物及杀微生物剂的潜在应用价值。

[0008] 附图说明

[0009] 附图1为聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1 B亚型标准毒株+ + +JR-FL（R5嗜性）和HXB2（X4嗜性）对CD4 CCR5 CXCR4 Ghost (3) X4-Hi5细胞感染的曲线图；

[0010] 附图2为聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1临床分离毒株对CD4+ + +CCR5 CXCR4 Ghost (3) X4-Hi5细胞感染的曲线图；

[0011] 附图3为聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1 B亚型标准毒株-JR-FL（R5嗜性）和HXB2（X4嗜性）对CD4 Caco-2细胞感染的曲线图；

[0012] 附图4为聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1 B亚型标准毒株-JR-FL（R5嗜性）和HXB2（X4嗜性）对CD4 HEC-1-A细胞感染的曲线图；

[0013] 附图5为聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对CD4- Caco-2细胞产生毒性的曲线图；

[0014] 附图6聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对CD4- HEC-1-A细胞产生毒性的曲线图；

[0015] 附图7为聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐（PSM）、硫酸葡聚糖（Dextran + + +sulfate）、齐多夫定（AZT）、奈韦拉平（nevirapine）抑制HIV-1感染CD4 CCR5 CXCR4 Ghost (3) X4-Hi5细胞的时间抑制曲线图；

[0016] 附图8为聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐在不同浓度下抑制HIV-1病毒包膜蛋白gp120介导的细胞融合的柱状统计图。

具体实施方式

[0017] 下面结合显示实验结果的附图来进一步阐述本发明。

[0018] 实验材料

[0019] 1.1聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐（PSM）；

[0020] 其分子式如下：

[0021]

[0022] 1.2 阳性对照样品：硫酸葡聚糖（Dextran sulfate），齐多夫定（AZT），奈韦拉平（Nevirapine）均购自SIGMA公司；

[0023] 1.3 CCK-8，Dojindo Laboratories；

[0024] 1.4 PEI（linear，25kD），购自Polyscience公司，使用时配制成5 mg/ml[0025] 的溶液；

[0026] 1.5 HIV-1假病毒系统（HIV-1 pseudotype virus）

[0027] 1.6.1假病毒骨架质粒：pNL4-3 ，构建有萤光素酶报告基因（luciferase reporter gene ），引自美国Rockfeller university；

[0028] 1.6.2 源自不同HIV-1亚型基因序列的假病毒包膜质粒，引自清华大学艾滋病研究中心；

[0029] HIV-1 B亚型标准毒株：JR-FL，HXB2；

[0030] HIV-1 临床分离毒株：CNE6（B’亚型）、CNE30（B’C亚型）、CNE50（B’C亚型）和CNE55（CRF01-AE亚型），均分离自中国艾滋病感染者，包括了中国主要的HIV-1流行亚型；

[0031] 1.6 Luciferase assay system kit 购自Promega公司；

[0032] 1.7 细胞

[0033] 1.7.1 人骨肉瘤细胞系Ghost (3) X4-Hi5，表达CD4受体，CCR5与CXCR4 [0034] 辅助受体；

[0035] 1.7.2 人结肠癌上皮细胞Caco-2，不表达CD4受体；

[0036] 1.7.3 人宫颈癌上皮细胞HEC-1-A，不表达CD4受体；

[0037] 1.7.4 人T细胞系白血病细胞MT-2，表达T细胞表面受体CD4，用于检[0038] 测HIV-1诱导的细胞融合作用；

[0039] 1.7.5 仓鼠卵巢细胞CHO-WT，表达HIV-1包膜蛋白gp120，用于检测HIV-1 [0040] 诱导的细胞融合作用；

[0041] 1.7.6 人胚胎肾细胞293T，用于包装生成HIV-1假病毒颗粒；

[0042] 1.8 细胞培养液：DMEM high glucose +10%胎牛血清；

[0043] 1.9 96孔细胞培养板： Corning；

[0044] 1.10 24孔细胞培养板： Corning；

[0045] 1.11 96 孔荧光检测板：Costar；

[0046] 1.12 GloMax 96孔化学发光酶标仪；

[0047] 1.13 TECAN酶标仪；

[0048] 1.14 Thermo CO2培养箱。

[0049] 2．实验方法

[0050] 2.1 HIV-1假病毒颗粒在人胚胎肾细胞293T细胞内的包装

[0051] 使用PEI转染试剂，将HIV-1假病毒骨架质粒pNL4-3和不同的假病毒包膜质粒共转染至293T细胞，培养48小时后收集上清，分装冻存于-75℃，即获得假病毒液用于后续实验。

[0052] 2.2 萤光素酶法测定假病毒的感染性滴度（TCID50）

[0053] 测定假病毒感染性滴度时，先梯度稀释病毒收获液，取100 ul加入96孔板，每个5
梯度4个复孔，再加入100ul Ghost (3) X4-Hi5细胞悬液，细胞密度10 cells/ml。培养48 小时后，利用Promega GloMax Lysis Buffer和Luciferase assay system kit在GloMax-96 Microplate Luminometer上测定每孔的相对荧光值（RLU），RLU大于2.5倍的背景值，判定为阳性，采用Reed-Muench方法计算假病毒的感染性滴度（TCID50）。

[0054] 2.3 PSM抗病毒活性检测

[0055] 将PSM溶解于双蒸水中，过滤除菌。用DMEM完全培养基稀释到一定浓度，分别在96孔板中进行3倍梯度稀释，最高浓度分别为60μg/ml （3μM）。然后将50μl 4000TCID50/4
ml的病毒稀释液加入到每个待测孔中，混匀，37℃抚育30min。最后在待测孔中加入10
4
Ghost (3) X4-Hi5细胞（或2×10 Caco-2和HEC-1-A细胞），37℃、5%CO2培养48h，利用Promega GloMax Lysis Buffer和Luciferase assay system kit在GloMax-96 Microplate Luminometer上检测萤光强度（萤光强度的大小代表病毒感染的程度）。

[0056] 2.4体外细胞毒性实验

[0057] 以2×104 Caco-2和HEC-1-A细胞每孔接入96孔板中，37℃、5%CO2培养24h。将PSM进行梯度稀释，最高浓度为10mg/ml，稀释倍数为3倍。再将96孔板中的培养液弃去，换成含有梯度浓度PSM的DMEM完全培养基。37℃、5%CO2培养至检测时间点（6h，12h，24h，48h），加入10μl/well的CCK-8试剂（Dojindo Laboratories），继续培养3h。最后用TECAN酶标仪在450nm处检测光吸收值，从而计算细胞的存活率。

[0058] 2.5药物抑制作用阶段实验

[0059] 本实验采用Time-of-drug addition方法进行。首先在96孔板中接种104 Ghost (3) X4-Hi5细胞，37℃、5%CO2培养12h。在待测孔中加入50μl 4000TCID50/ml的病毒稀释液。然后在各时间点加入PSM和阳性对照药物，混匀，PSM浓度为60μg/ml，AZT为0.5μg/ml，Nevirapine为2μg/ml，dextran sulfate为300μg/ml。待培养48h后，利用Promega GloMax Lysis Buffer和Luciferase assay system kit在GloMax-96 Microplate Luminometer上检测萤光强度（萤光强度的大小代表病毒感染的程度）。本实验以各时间点加入完全培养基孔为对照。

[0060] 2.6细胞-细胞融合抑制实验

[0061] 用含有400μM methionine sulfoximine的GMEM-S培养基对CHO-WT进行培养，等覆盖率到达70%左右时，加入丁酸钠至终浓度为6mM，刺激gp160三聚体（包膜蛋白gp120+融合蛋白gp41）的表达。在刺激16h后，用0.5mM的（EDTA+EGTA）消化细胞，计数后，在245
孔板中以每孔5×10 的CHO-WT进行接种。同时将同样数目的MT-2接种于24孔板的各孔中。加入不同浓度的PSM（60, 20, 6.67, 2.22, 0.74, 0 ug/ml），37℃、5%CO2培养24h后，用倒置显微镜观察并计数合胞体数目。

[0062] 3.实验结果

[0063] 3.1 在图1，利用携带萤光素酶基因的假病毒系统检测聚（4-苯乙烯磺酸-共+聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1 B亚型标准毒株JR-FL（R5嗜性）和HXB2（X4嗜性）对CD4 + +
CCR5 CXCR4 细胞（Ghost (3) X4-Hi5）的感染，发现其具有明显的抑制效果，抑制EC50分别为4.988μg/ml和5.260μg/ml。聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对具有包膜蛋白VSV的HIV-1毒株VSV-G基本无抑制作用。

[0064] 3.2 在图2中，利用携带萤光素酶基因的假病毒系统检测聚（4-苯乙烯磺酸-共+ + +聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1临床分离毒株对CD4 CCR5 CXCR4 细胞的感染，HIV-1临床分离毒株包括CNE6（B’亚型，R5嗜性）、CNE30（B’C亚型，R5嗜性）、CNE50（B’C亚型，R5嗜性）和CNE55（CRF01-AE亚型，R5嗜性）；发现该化合物PSM对这些临床毒株具有明显的抑制效果，抑制EC50分别为1.8757μg/ml、3.1361μg/ml、1.7050μg/ml和1.7064μg/ml。

[0065] 3.3 用携带萤光素酶基因的假病毒系统检测聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）-钠盐抑制HIV-1 B亚型标准毒株JR-FL和HXB2对CD4 细胞（人结肠癌上皮细胞Caco-2和人宫颈癌腺上皮细胞HEC-1-A）的感染，发现其具有很强的抑制效果，如图3和图4所示：在Caco-2细胞上抑制JR-FL和HXB2的EC50分别为7.307μg/ml和9.542μg/ml；在HEC-1-A上抑制JR-FL和HXB2的EC50分别为2.050μg/ml和3.951μg/ml。

[0066] 3.4 在图5和图6中，利用CCK-8法检测聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对相关人细胞株的毒性，发现高浓度的该化合物PSM对人结肠癌上皮细胞（Caco-2）和人宫颈癌腺上皮细胞（HEC-1-A）毒性很小。

[0067] 3.5 在图7中，利用携带萤光素酶基因的假病毒系统确定聚（4-苯乙烯磺酸-共+ + +聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1感染CD4 CCR5 CXCR4 细胞（Ghost (3) X4-Hi5）的作用方式和原理，结果显示聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐（PSM）与硫酸葡聚糖（Dextran sulfate）的曲线走向相似，可以推测聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的作用方式与硫酸葡聚糖相似，是通过抑制病毒入胞来实现抗病毒作用的。

[0068] 3.6 利用CHO-WT—MT-2共培养融合检测聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐抑制gp120和CD4介导的细胞融合效果，在图7中，发现聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐能有效抑制CHO-WT与MT-2细胞的融合。从聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐抑制HIV-1病毒包膜蛋白介导的融合过程，进一步说明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐是阻止HIV-1病毒进入细胞来实现抑制病毒的。

[0069] 我们的研究表明，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有较高的负电荷性，可以与HIV-1的胞膜蛋白gp120的V3 片段（正电荷）发生相互作用，从而可以阻断V3 片段与受体CD4的相互作用，以达到阻断HIV-1病毒进入细胞的作用，或者抑制CHO-WT与MT-2细胞的融合。体外抗病毒实验证明，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有很强的抗CD4依赖性HIV-1感染的能力，并且对一些临床分离株也表现为很好的活性，这其中包括B’、B’C和CRF01-AE重组亚型。这说明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有抗HIV-1的广谱性。另外，聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐对CD4非依赖性的HIV-1感染也具有很好的抗感染能力。对聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的体外毒性实验发现，该化合物具有很低的毒性。最后，细胞融合实验结果表明聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐具有抑制HIV-1病毒包膜蛋白gp120介导的融合过程的作用。聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐来源丰富，生产成本低廉，具有作为一种新型抗HIV-1药物及杀微生物剂的潜在应用价值。

[0070] 在制备抑制HIV-1感染的药物组合物时，将聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐作为有效成分，并加上常规的药用载体。该药物组合物可制成注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。