一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法

摘要

本发明涉及一种DNA提取技术，具体地说是一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法。对采集的鱼卵或仔鱼进行固定保存。冲洗去除固定液后，加入DNA提取缓冲液和细胞裂解缓冲液，将鱼卵或仔鱼剪碎后再加入蛋白酶K和RNA酶，温育消化。用高浓度NaCl溶液沉淀蛋白质，加入异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀去除盐离子，待乙醇挥发后加入超纯水或TE溶液溶解。本方法解决了常规总DNA提取方法在鱼卵或仔鱼等基因组DNA含量较少样品中应用的限制问题。

权利要求

1.一种提取单个鱼卵或仔鱼微量总DNA的简便快速方法，其特征在于：

1)样品固定：

采集鱼卵或仔鱼，滤去水后立即加入无水乙醇，而后于-20℃或室温保存备用，鱼卵或仔鱼与无水乙醇比例为：1mL鱼卵/2-5mL无水乙醇；1尾仔鱼/0.05-0.5mL无水乙醇；

2)样品中固定液的去除：

取步骤1)所得已固定的单个鱼卵或仔鱼样品，加入生理盐水洗涤，1000-2000g离心

20-60秒去除多余生理盐水，再用滤纸吸干样品，重复2-3次； 所述生理盐水为质量体积比为0.9％的NaCl溶液；

3)样品消化：

取上述洗涤过的单个鱼卵或仔鱼，加入100-300μL DNA提取缓冲液和10-30μL细胞裂解缓冲液，使细胞破壁，而后加入10-100μg蛋白酶K和10-100μg RNA酶，振荡混匀，于

50-70℃温育，每10-20分钟颠倒混匀一次，消化至溶液澄清，待用； 所述DNA提取缓冲液为终浓度0.01mol/L、pH＝8.0的Tris-HCl，终浓度0.1mol/L、pH＝8.0的EDTA，和终浓度0.1mol/L的NaCl；细胞裂解缓冲液为质量体积比10％的SDS溶液；

4)提取总DNA：

将步骤3)消化至澄清的溶液中加入100-300μL5-6mol/L NaCl溶液，振荡20-30秒，

15000g离心30分钟，吸取上清液使蛋白质去除，然后在上清液中加入等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置1-2小时，15000g离心15分钟，沉淀即得到单个鱼卵或仔鱼微量总DNA。

2.按权利要求1所述的提取单个鱼卵或仔鱼微量总DNA的简便快速方法，其特征在于：所述步骤1)鱼卵或仔鱼与无水乙醇混合后24小时，再更换一次无水乙醇。

3.按权利要求1所述的提取单个鱼卵或仔鱼微量总DNA的简便快速方法，其特征在于：所述步骤3)消化20-60分钟至溶液液澄清，待用。

4.按权利要求1所述的提取单个鱼卵或仔鱼微量总DNA的简便快速方法，其特征在于：所述步骤4)所得沉淀中加入70％无水乙醇洗涤沉淀1-2次；而后将洗涤后沉淀于通风处放置，待乙醇完全挥发，加入10-40μL超纯水或TE溶液，4℃静置溶解，-20℃保存备用。

说明书

一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种DNA提取技术，具体地说是一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法。

背景技术

[0002] 为研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。高质量总DNA的制备是进行分子生物学等研究和应用的基础之一。总DNA的常用提取方法主要包括高盐法、有机溶剂萃取法、Chelex-100提取法、酶裂解法和使用商品化的试剂盒等。传统高盐法适用于组织样品较多的情况，对于单个鱼卵仔鱼等总DNA含量较少的样品难以提取出足够的DNA。有机溶剂萃取法虽然可以获得较为纯净的DNA，但需要时间较长，DNA损失较大，也不适于微量DNA的提取。Chelex-100提取法虽然较为简单快速，减少了提取过程中污染的机会，但提取终体积相对较大，DNA浓度较低，可能会使后续的分析受到影响。酶裂解法是向标准缓冲液中加入蛋白酶K孵育靶组织或细胞，高温灭活蛋白酶K后，即可取上清进行PCR反应。但该法同样存在提取终体积较大，DNA浓度低的缺点。商品化的微量DNA试剂盒主要通过膜的吸附和洗脱等过程来完成DNA的收集和纯化，虽然可以提取到较高浓度的DNA，但其操作相对复杂，成本较高，且受洗脱效率的影响较大。因此，需要建立一种简单快捷、稳定性和得率高的单个鱼卵仔鱼微量总DNA提取的方法，以满足进一步其分子鉴定或遗传来源分析的需要。

发明内容

[0003] 本发明目的在于提供一种适用于不同发育阶段单个鱼卵或仔鱼微量总DNA提取的快速简便方法。

[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0005] 一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法：

[0006] 1)样品固定：

[0007] 采集鱼卵或仔鱼，滤去水后立即加入无水乙醇，而后于-20℃或室温保存备用，鱼卵或仔鱼与无水乙醇比例为：1mL鱼卵/2-5mL无水乙醇；1尾仔鱼/0.05-0.5mL无水乙醇；

[0008] 2)样品中固定液的去除：

[0009] 取步骤1)所得已固定的单个鱼卵或仔鱼样品，加入生理盐水洗涤，1000-2000g离心20-60秒去除多余生理盐水，再用滤纸吸干样品，重复2-3次；

[0010] 3)样品消化：

[0011] 取上述洗涤过的单个鱼卵或仔鱼，加入100-300μL DNA提取缓冲液和10-30μL细胞裂解缓冲液，使细胞破壁，而后将细胞破壁的单个鱼卵或仔鱼加入10-100μg蛋白酶K和10-100μg RNA酶，震荡混匀，于50-70℃温育，每10-20分钟颠倒混匀一次，消化至溶液澄清，待用；

[0012] 4)提取总DNA：

[0013] 将步骤3)消化至澄清的溶液中加入100-300μL 5-6mol/L NaCl溶液，震荡20-30秒。15000g离心30分钟，吸取上清液使蛋白质去除，然后在上清液中加入等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置1-2小时，15000g离心15分钟，沉淀即得到单个鱼卵仔鱼微量总DNA。

[0014] 所述步骤1)鱼卵或仔鱼与无水乙醇混合后24小时，再更换一次无水乙醇。所述步骤2)生理盐水为质量体积比为0.9％的NaCl溶液。所述步骤3)DNA提取缓冲液为终浓度0.01mol/L的pH＝8.0，Tris-HCl、终浓度0.1mol/L的pH＝8.0，EDTA，和终浓度0.1mol/L的NaCl；细胞裂解缓冲液为质量体积比10％的SDS溶液。所述步骤3)消化20-60分钟至溶液液澄清，待用。所述步骤4)所得沉淀中加入70％无水乙醇洗涤沉淀1-2次；而后将洗涤后沉淀于通风处放置，待乙醇完全挥发，加入10-40μL超纯水或TE溶液，4℃静置溶解，-20℃保存备用。

[0015] 本发明原理是：

[0016] DNA提取是利用化学或物理方法获得不同生物样品或组织中含有的DNA，以备进一步的分子生物学或遗传分析的一种方法。本发明利用蛋白质在高盐离子浓度下生成沉淀的特性，将已消化的组织液中的RNA、蛋白质、脂质等通过酶解、沉淀或离心等方式去除，从而得到高质量的DNA。

[0017] 本发明的优点和积极效果如下：

[0018] 1、本发明提取方法，可以提取不同发育时期鱼卵或仔鱼中的总DNA，特别是包括2细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠期、胚体期甚至未受精的鱼卵，以及孵化后不同时期仔鱼的总DNA提取。应用范围广泛。

[0019] 2、本发明将采取的样品用无水乙醇进行固定，可在室温下保存。避免了冻存需要的冷冻设备，样品采集保存更加方便。

[0020] 3、本发明针对提取的样品为单个鱼卵或仔鱼，个体较小，其DNA含量较少的情况，通过减小反应体系中各组成的用量，保证了获得总DNA的效率；同时，缩短了消化的时间和加入的蛋白酶K与RNA酶的量。提高了获得的总DNA的质量。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例提供的提取获得的不同发育时期单个牙鲆鱼卵、仔鱼和大菱鲆鱼卵总DNA用于COI片段PCR扩增产物的电泳图谱。其中1、2为提取获得的不同发育时期单个大菱鲆鱼卵，3、4为单个牙鲆鱼卵，5、6为单个牙鲆仔鱼总DNA用于COI片段序列PCR扩增产物电泳图谱，M为分子标记DL2000。

具体实施方式

[0022] 本发明提出一种单个鱼卵或仔鱼DNA的提取方法，首先对采集的鱼卵或仔鱼进行固定。在提取DNA前用生理盐水洗去固定液，加入DNA提取缓冲液和细胞裂解缓冲液后，将鱼卵或仔鱼剪碎。再加入蛋白酶K和RNA酶，温育消化。待消化完全后用高浓度NaCl溶液沉淀蛋白质，加入异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀去除盐离子，待乙醇挥发后加入超纯水或TE溶液溶解。

[0023] 下面结合实施例详述本发明。

[0024] 实施例1

[0025] 1)样品固定：

[0026] 采集大菱鲆的受精卵0.5mL，解剖镜观察受精卵已发育到2细胞期，滤去海水后加入1mL无水乙醇。24小时后更换一次无水乙醇。室温保存；

[0027] 2)样品中固定液的去除：

[0028] 取步骤1)所得已固定的鱼卵1粒，加入质量体积比为0.9％的NaCl溶液的生理盐水洗涤，以1500g转速离心30秒，吸弃多余的生理盐水，用滤纸吸干水分，重复上述操作2次；

[0029] 3)样品消化：

[0030] 将洗涤过的鱼卵放入1.5mL离心管中，加入100μL DNA提取缓冲液和10μL细胞裂解缓冲液。而后用洁净的解剖剪将鱼卵卵膜剪破，加入3μL 10mg/mL的蛋白酶K和3μL10mg/mL的RNA酶。震荡混匀后置于55℃温育，每10分钟颠倒混匀一次，消化20分钟至溶液澄清；其中DNA提取缓冲液为终浓度0.01mol/L的pH＝8.0，Tri s-HCl，终浓度0.1mol/L的pH＝8.0，EDTA和终浓度0.1mol/L的NaCl；细胞裂解缓冲液为质量体积比10％的SDS溶液。

[0031] 4)蛋白质去除：

[0032] 将上述消化后澄清液中加入100μL 6mol/L NaCl溶液，震荡20秒。15000g离心30分钟；

[0033] 5)DNA的沉淀：

[0034] 吸取上清液，加入沉淀等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置2小时，15000g离心15分钟，吸弃上清液；

[0035] 6)DNA洗涤：

[0036] 加入70％无水乙醇，将沉淀弹起后轻轻颠倒几次，15000g离心5分钟，吸弃上清。重复1次上述操作。而后在通风处放置15分钟，使乙醇完全挥发。

[0037] 7)DNA溶解：

[0038] 乙醇挥发后，在沉淀中加入20μL超纯水，4℃静置溶解，即得到单个鱼卵仔鱼微量总DNA，于-20℃保存备用。

[0039] 8)DNA提取效果检测：

[0040] 以上述提取的总DNA为模板，PCR扩增大菱鲆的线粒体DNA COI片段(参见图1)，PCR产物测序后，得到662bp的序列，在NCBI网站上进行BLAST比对，获得的序列确实为大菱鲆COI序列。表明提取的是所需的大菱鲆基因组DNA，可用于进一步的相关研究和应用。

[0041] 实施例2

[0042] 1)样品固定：

[0043] 采集牙鲆的受精卵1mL，解剖镜观察受精卵已发育到胚体期，滤去海水后加入5mL无水乙醇。24小时后更换一次无水乙醇。-20℃保存；

[0044] 2)样品中固定液的去除：

[0045] 取步骤1)所得已固定的鱼卵1粒，加入质量体积比为0.9％的NaCl溶液的生理盐水洗涤；以1000g转速离心60秒，吸弃多余的生理盐水，用滤纸吸干水分，重复2次。

[0046] 3)样品消化：

[0047] 将洗涤过的鱼卵放入1.5mL离心管中，加入200μL DNA提取缓冲液和20μL细胞裂解缓冲液。而后用洁净的解剖剪将鱼卵卵膜剪破。加入2μL 20mg/mL的蛋白酶K和2μL20mg/mL的RNA酶。震荡混匀后置于60℃温育，每15分钟颠倒混匀一次，消化30分钟至溶液澄清；其中DNA提取缓冲液为终浓度0.01mol/L的pH＝8.0，TrisHCl，终浓度0.1mol/L的pH＝8.0，EDTA，终浓度0.1mol/L NaCl；细胞裂解缓冲液为质量体积比10％的SDS溶液。

[0048] 4)蛋白质去除：

[0049] 将上述消化后澄清液中加入200μL 6mol/L NaCl溶液，震荡20秒。15000g离心30分钟；

[0050] 5)DNA的沉淀：

[0051] 吸取上清液，加入沉淀等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置1小时，15000g离心15分钟，吸弃上清液；

[0052] 6)DNA洗涤：

[0053] 加入70％无水乙醇，将沉淀弹起后轻轻颠倒几次，15000g离心5分钟，吸弃上清。重复1次。在通风处放置15分钟，使乙醇完全挥发；

[0054] 7)DNA溶解：

[0055] 乙醇挥发后，在沉淀中加入15μL超纯水，4℃静置溶解即得到单个鱼卵仔鱼微量总DNA，于-20℃保存备用。

[0056] 8)DNA提取效果检测：

[0057] 以上述提取的总DNA为模板，PCR扩增牙鲆的线粒体DNA COI片段(参见图1)，PCR产物测序后，得到660bp的序列，在NCBI网站上进行BLAST比对，获得的序列确实为牙鲆COI序列。表明提取的是所需的牙鲆基因组DNA，可用于进一步的相关研究和应用。

[0058] 实施例3

[0059] 1)样品固定：

[0060] 采集牙鲆的初孵仔鱼10尾，滤去海水后加入2mL无水乙醇。24小时后更换一次无水乙醇。室温保存；

[0061] 2)样品中固定液的去除：

[0062] 取步骤1)所得已固定的初孵仔鱼1尾，加入质量体积比为0.9％的NaCl溶液的生理盐水洗涤；以2000g转速离心20秒，用滤纸吸干水分，重复上述操作3次。

[0063] 3)样品消化：

[0064] 将洗涤过的仔鱼放入1.5mL离心管中，加入300μL DNA提取缓冲液和30μL细胞裂解缓冲液。而后用洁净的解剖剪将仔鱼剪碎。加入5μL 20mg/mL的蛋白酶K和5μL20mg/mL的RNA酶。震荡混匀后置于55℃温育，每20分钟颠倒混匀一次，消化1小时至溶液澄清；其中DNA提取缓冲液为终浓度0.01mol/L的pH＝8.0，TrisHCl，终浓度0.1mol/L的pH＝8.0，EDTA，终浓度0.1mol/L NaCl；细胞裂解缓冲液为质量体积比10％的SDS溶液。

[0065] 4)蛋白质去除：

[0066] 将上述消化后澄清液中加入300μL 5mol/L NaCl溶液，震荡20秒。15000g离心30分钟；

[0067] 5)DNA的沉淀：

[0068] 吸取上清液，加入沉淀等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置1.5小时，15000g离心15分钟，吸弃上清液；

[0069] 6)DNA洗涤：

[0070] 加入70％无水乙醇，将沉淀弹起后轻轻颠倒几次，15000g离心5分钟，吸弃上清。重复1次。在通风处放置15分钟，使乙醇完全挥发；

[0071] 7)DNA溶解：

[0072] 乙醇挥发后，在沉淀中加入30μL超纯水，4℃静置溶解即得到单个鱼卵仔鱼微量总DNA，于-20℃保存备用。

[0073] 8)DNA提取效果检测：

[0074] 以上述提取的总DNA为模板，PCR扩增牙鲆的线粒体DNA COI片段(参见图1)，PCR产物测序后，获得660bp的序列，在NCBI网站上进行BLAST比对，获得的序列确实为牙鲆COI序列。表明提取的是所需的牙鲆总DNA，可用于进一步的相关研究和应用。

[0075] 实施例4

[0076] 1)样品固定：

[0077] 采集鱼卵或仔鱼，滤去水后立即按照1mL鱼卵/5mL无水乙醇、1尾仔鱼/0.1mL无水乙醇的比例进行固定。24小时后更换一次无水乙醇。室温下保存备用；

[0078] 2)样品中固定液的去除：

[0079] 取步骤1)所得已固定的单个鱼卵或仔鱼，加入质量体积比为0.9％的NaCl溶液的生理盐水洗涤，以2000g转速离心20秒，吸弃多余的生理盐水并将样品用滤纸吸干，重复2-3次；

[0080] 3)样品消化：

[0081] 取上述洗涤过的单个鱼卵或仔鱼，加入100μL DNA提取缓冲液和10μL细胞裂解缓冲液。用洁净的解剖剪将鱼卵卵膜剪破，仔鱼剪碎。加入10μL 10mg/mL的蛋白酶K和2μL 10mg/mL的RNA酶。震荡混匀后置于60℃温育，每20分钟颠倒混匀一次，消化40分钟至消化液澄清；其中DNA提取缓冲液为终浓度0.01mol/L的pH＝8.0，TrisHCl，终浓度
0.1mol/L的pH＝8.0，EDTA，终浓度0.1mol/L NaCl；细胞裂解缓冲液为质量体积比10％的SDS溶液。

[0082] 4)蛋白质去除：

[0083] 将上述消化后澄清液中加入100μL 5mol/L NaCl 溶液，震荡20-30秒。15000g离心30分钟；

[0084] 5)DNA的沉淀：

[0085] 吸取上清液，加入沉淀等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置1-2小时，15000g离心15分钟，吸弃上清液；

[0086] 6)DNA洗涤：

[0087] 加入70％无水乙醇，将沉淀弹起后轻轻颠倒几次，15000g离心5分钟，吸弃上清。重复1次。在通风处放置10-20分钟，使乙醇完全挥发；

[0088] 7)DNA溶解

[0089] 乙醇挥发后，在沉淀中加入40μL TE溶液，4℃静置溶解即得到单个鱼卵仔鱼微量总DNA，于-20℃保存备用。

[0090] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。