靶向和荧光双功能的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体

摘要

本发明涉及药物制剂领域。具体涉及一种靶向和荧光双功能的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体。本发明的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体，由固态脂质、液态脂质、表面活性剂和难溶性抗肿瘤药物形成内部包载药物的脂质载体，脂质载体表面经过化学修饰，共价连接上具有肿瘤靶向的配体。本发明可以延长难溶性抗肿瘤药物的体内循环时间，提高难溶性抗肿瘤药物的生物利用度，还可通过荧光成像用于肿瘤的定位诊断。

权利要求

1.一种难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体，由固态脂质、液态脂质、表面活性剂和难溶性抗肿瘤药物形成内部包载难溶性抗肿瘤药物的脂质载体，其特征是：脂质载体表面经过化学修饰，共价连接上具有肿瘤靶向的配体，所述的具有肿瘤靶向的配体为葡萄糖胺、

2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖胺，其中固态脂质、液态脂质、表面活性剂、难溶性抗肿瘤药物的质量比为24～56∶50～76∶15∶4～5；所述难溶性抗肿瘤药物是紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱或羟基喜树碱，肿瘤靶向的配体与脂质载体的质量比为1∶10～1∶3。

2.权利要求1的脂质载体，其中脂质载体内部还包载荧光素或吲哚花菁近红外荧光染料。

3.权利要求1的脂质载体，其中固态脂质是硬脂酸或硬脂酸和选自单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、鲸蜡醇十六酸酯、棕榈酸、癸酸中的一种或几种的混合物；液态脂质选自天然植物油、油酸、亚油酸、角鲨烯、维生素E、维生素E酯、C8～C10中链脂肪酸甘油酯中的一种或几种；表面活性剂选自聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚中的一种或几种。

4.权利要求1的脂质载体，还含有冻干保护剂，冻干保护剂选自乳糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一种或几种。

5.权利要求2的脂质载体，其内部包载的荧光素或吲哚花菁近红外荧光染料与脂质载体的质量比为1∶10～1∶16。

6.权利要求1的脂质载体的制备方法，包括：

a.取部分硬脂酸溶解后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；按照与固态脂质质量比为10：1的比例加入靶向配体，反应过夜，离心沉淀；

b.将连有靶向配体的固态脂质与剩余的固态脂质一起熔融，加入液态脂质，混合均匀；

向混合脂质中加入难溶性抗肿瘤药物，溶解；加入含有表面活性剂的双蒸水，搅拌充分乳化后超声或高压乳匀，冰浴离心。

7.权利要求2的脂质载体的制备方法，包括：

a.取部分硬脂酸溶解后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；加入靶向配体，反应过夜，离心沉淀；

b.将连有靶向配体的固态脂质与剩余的固态脂质一起熔融，加入液态脂质，混合均匀；

向混合脂质中加入荧光染料，溶解；加入含有表面活性剂的双蒸水，搅拌充分乳化后超声或高压乳匀，冰浴离心。

说明书

靶向和荧光双功能的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体

技术领域

[0001] 本发明涉及药物制剂领域。具体涉及难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体靶向给药系统，包括纳米结构脂质载体对难溶性抗肿瘤药物的靶向传递和通过荧光成像对肿瘤的定位诊断中的应用。

背景技术

[0002] 肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病。当前治疗肿瘤的方法主要有放疗、化疗、手术疗法和基因治疗。放疗和化疗是非常重要的非手术疗法，但是放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也对机体正常细胞产生严重损伤。尤其是化疗，由于药物本身缺乏靶向性，因而出现治愈率低、多药耐药性、毒副作用巨大等重大治疗问题。

[0003] 紫杉醇是红豆杉属植物产生的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的唯一一种可以促进细胞内微管聚合和稳定已聚合微管的药物。研究表明，紫杉醇只结合到聚合的微管上，不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。紫杉醇类物质通过促进微管二聚体装配成微管，同时抑制去多聚化过程而使微管稳定。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期的G2和M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖。研究表明紫杉醇对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。

[0004] 但紫杉醇类物质水溶性很差。由于紫杉醇类物质难溶于水，必须在注射剂中加入表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油以增加紫杉醇类物质的水溶性。但该溶剂会引起多种毒副反应，如变态反应、中毒性肾损伤、神经毒性、心血管毒性等。即使在紫杉醇注射给药前预先注射皮质醇类、苯海拉明和H受体拈抗剂，仍不能彻底有效防止所有患者的毒副反应，还是会导致部分患者注射紫杉醇后发生变态反应。甚至有很多病人会出现危及生命的超过敏反应的症状，另外高血压、糖尿病、溃疡病和过敏性体质患者也因无法应用普通紫杉醇类药物，只能眼看着最佳治疗时机的丧失。因此改善紫杉醇类药物的溶解性具有很现实的意义。

[0005] 目前，国内外对改善紫杉醇类药物的溶解性，降低其毒性进行了大量的研究，除了市场上常规的使用聚氧乙基代蓖麻油与无水乙醇混合溶媒的紫杉醇注射液外，已有紫杉醇的脂质体制剂用于临床。2004年上市的新型的注射用紫杉醇制剂——力扑素就是紫杉醇脂质体的冻干粉针剂。它将难溶于水的紫杉醇包封在脂质体磷脂双分子层中，解决了紫杉醇的溶解性问题，解除了因溶媒而引起的一系列不良反应。但是脂质体成本较高，磷脂双层稳定性差，在药物贮存过程中易发生药物渗漏，因此寻找一种新的紫杉醇制剂具有十分重要的现实意义。

[0006] 喜树碱(Camptothecin，CPT)是从珙桐科植物喜树中提取的一种天然抗肿瘤药物，它的抗肿瘤作用机理是能稳定拓扑异构酶I和DNA的共价化合物，形成了三元可解离复合物，通过复制冲突模型造成DNA损伤，从而选择性地抑制增殖期肿瘤细胞的DNA复制最终导致细胞死亡。喜树碱对胃肠道肿瘤、膀胱癌、肝癌和白血病等恶性肿瘤均有一定疗效。但它也能产生包括骨髓抑制、呕吐、腹泻和严重的出血性膀胱炎等副作用。并且喜树碱具有较强的脂溶性，而水溶性很差，不利于制备成注射剂。因此改善喜树碱类药物的溶解性，降低其在体内的毒副反应对喜树碱在临床上的应用具有十分重要的意义。

[0007] 固体脂质纳米粒(solid lipid carriers，SLN)是用固态脂质或固态脂质混合物替换水包油乳化液中的液体油脂制备而成的，有时还要加入表面活性剂使该体系更加稳定。与其他脂质载药系统相比，固体脂质纳米粒具有生物相容性好、能对药物的释放进行调节、理化稳定性好等诸多优点，但仍存在一些缺陷：其制备过程中采用的固态脂质会形成分子排列紧密的晶格结构，从而限制了固体脂质纳米粒的载药能力；载有药物的固体脂质纳米粒在贮存过程中，其固态脂质也会因形成更加紧密的晶格而将药物“排挤”出来，从而造成药物的渗漏。

[0008] 为了弥补这一缺陷，研究人员对固体脂质纳米粒的制备工艺加以改进，继而开发了一种新型的载药系统——纳米结构脂质载体，即在固体脂质纳米粒制备过程中加入与固态脂质理化性质差异较大的液态油或混合油脂。液态脂质的加入可扰乱固态脂质分子间紧密有序的排列，增加纳米粒结构中不规则晶形的比例，使其承载药物的空间增大，从而提高载体的载药能力。通过调节液态脂质与固态脂质的比例，还可使纳米结构脂质载体在体温下保持较长时间的固体骨架结构，有利于实现药物的控释。由于固体脂质纳米粒和纳米结构脂质载体表面包覆了一层表面活性剂，所以能够在水中稳定存在，形成稳定的水包油结构，因此利用纳米结构脂质载体可以很好的解决难溶性抗肿瘤药物的水溶性问题。

[0009] 但是目前制备的纳米结构脂质载体有的粒径较大，容易被RES系统吞噬，有些载体对肿瘤的靶向特异性不高，对正常组织具有较高的毒性。因此需要发明一种能够主动靶向到肿瘤部位的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体，使其既能改善难溶性抗肿瘤药物的溶解性，又可使药物在肿瘤部位浓集，增加肿瘤部位药物浓度，降低正常组织中的药物浓度，减少药物对正常组织的损伤，还可延长药物在体内的循环时间。

[0010] 近红外荧光染料的发射波长为700～1200nm，在该范围内生物分子自身荧光较弱，可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度，并且近红外荧光具有较强的穿透性，通过近红外荧光成像能够观测到机体组织深部的信息。在载体中装载上近红外荧光染料，有利于观察载体的体内行为，也可用于肿瘤的诊断及定位。

发明内容

[0011] 本发明公开了具有靶向特性的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体。本发明使难溶性抗肿瘤药物具有更高的化学稳定性，并且可稳定分散在水相中，便于制备成注射液；还可通过控制载体粒径(150纳米以下)从而避免体内网状内皮系统吞噬，延长难溶性抗肿瘤药物的体内循环时间，提高难溶性抗肿瘤药物的生物利用度；载体表面修饰的靶向配体可使难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体主动聚集在肿瘤部位，降低正常组织中药物的浓度，减少药物对正常组织的毒性。本发明所使用的载体原料均为生物相容性好并且生物可降解的材料，在制备过程中不需使用有机溶剂，不会引起毒副反应，具有较高的安全性，加入的液体脂质打乱了固体脂质规则的晶格结构，可防止贮存过程中药物发生渗漏，并可增大药物的包封效率。

[0012] 本发明的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体，由固态脂质、液态脂质、表面活性剂和难溶性抗肿瘤药物形成内部包载药物的脂质载体，在此基础上，脂质载体表面经过化学修饰，共价连接上具有肿瘤靶向的配体。所述具有肿瘤靶向的配体优选葡萄糖类似物。更优选葡萄糖胺、2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖胺。

[0013] 本发明的脂质载体内部还可包载有荧光素或吲哚花菁类染料。可用于载体的体内研究以及肿瘤的定位、诊断等。

[0014] 上述固态脂质优选自单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、鲸蜡醇十六酸酯、硬脂酸、棕榈酸、癸酸中的一种或几种。

[0015] 液态脂质优选自天然植物油、油酸、亚油酸、角鲨烯、维生素E、维生素E酯、C8～C10中链脂肪酸甘油酯中的一种或几种。

[0016] 表面活性剂优选自聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚中的一种或几种。

[0017] 难溶性抗肿瘤药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱中的一种。

[0018] 其中固态脂质、液态脂质、表面活性剂、难溶性药物的质量比优选24～56∶50～76∶15∶4～5。

[0019] 具有荧光的纳米结构脂质载体中荧光染料与液态脂质和固态脂质总量的质量比优选为1∶16～1∶10。

[0020] 本发明的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体可用下列方法制备：

[0021] a.取部分硬脂酸溶解后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；按照与固态脂质质量比为10∶1的比例加入靶向配体，反应过夜，离心沉淀；

[0022] b.将连有靶向配体的固态脂质与剩余的固态脂质一起熔融，加入液态脂质，混合均匀；向混合脂质中加入难溶性抗肿瘤药物，溶解；加入含有表面活性剂的双蒸水，搅拌充分乳化后超声或高压乳匀，冰浴离心。

[0023] 含荧光染料的难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体可用下列方法制备：

[0024] a.取部分硬脂酸溶解后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；加入靶向配体，反应过夜，离心沉淀；

[0025] b.将连有靶向配体的固态脂质与剩余的固态脂质一起熔融，加入液态脂质，混合均匀；向混合脂质中加入荧光染料，溶解；加入含有表面活性剂的双蒸水，搅拌充分乳化后超声或高压乳匀，冰浴离心。

[0026] 本发明的有益之处，是通过纳米结构脂质载体来改善难溶性抗肿瘤药物的水溶性，并首次在其表面修饰上葡萄糖类主动靶向配体，使难溶性抗肿瘤药物纳米结构脂质载体能够主动靶向到肿瘤部位，使肿瘤部位的药物浓度显著提高，并降低药物对正常组织的毒性。本发明优选葡萄糖类似物作为靶向配体修饰的纳米结构脂质载体，比传统的靶向配体如叶酸、RGD等在肿瘤中聚集所需的时间更短。

[0027] 本发明制备的载体粒径在80-150nm之间，见图1，表面电位在(-22.3±2.8)mv之间，见图2。粒径小于200nm的载体不易被网状内皮系统摄取，体内循环时间延长。难溶性抗肿瘤药物和荧光染料∶载体脂质总量的比值优选1∶16-1∶10时，测得对难溶性抗肿瘤药物和脂溶性荧光染料比水溶性染料具有较高的包封率和载药效率，见表1。表1中紫杉醇和喜树碱为难溶性抗肿瘤药物，Cypate为脂溶性荧光染料，荧光素的脂溶性较Cypate差。从表1可以看出，载体对难溶的抗肿瘤药物和荧光染料的包封率和载药效率均高于水溶性较好的荧光素。

[0028] 表1纳米结构脂质载体中药物和荧光染料的包封率和载药效率

[0029]

[0030] 本发明难溶性抗肿瘤药物靶向脂质载体中还可以包裹上荧光染料，可用于荧光成像，对载体的行为和药物到达部位进行示踪，对肿瘤进行诊断和定位。本研究显示，荧光染料包裹在载体中，其光学性质未受影响，并且稳定性得到很大提高，更适合用于活体内成像，见图3、图4。将包载有荧光染料的靶向修饰的纳米结构脂质载体注射到荷瘤裸鼠体内，可以看到注射4小时后，荧光信号出现在肿瘤部位，并持续100小时以上，而其他部位的信号24小时后消失。说明靶向修饰的载体在荷瘤裸鼠体内可定向聚集于肿瘤部位，并在肿瘤内蓄积，见图5。

[0031] 体内治疗效果显示，以葡萄糖类似物为靶向配体修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体比未经修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体和叶酸修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体对肿瘤具有更好的治疗效果。下面是部分药效学对比试验和结果：

[0032] 将荷乳腺癌肿瘤的裸鼠分为三组，每组六只。三组荷瘤裸鼠分别注射紫杉醇注射液、紫杉醇纳米结构脂质载体和靶向紫杉醇纳米结构脂质载体，三组各有一只空白荷瘤裸鼠作为对照。每次给药按紫杉醇含量计为6mg/kg，每两天给药一次，共给药六次。实验结束十天之后，测量给药后裸鼠体重，肿瘤重量、体积，计算抑瘤率，并与叶酸修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体对比。实验结果在表2中列出。

[0033] 从表2中看出，葡萄糖靶向修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体的抑瘤率最高，叶酸靶向修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体和无靶向修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体次之，紫杉醇最低，而葡萄糖靶向修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体组裸鼠体重下降最少。这一结果说明葡萄糖靶向修饰的纳米结构脂质载体的抑瘤效果最好，对裸鼠的毒性也最小。

[0034] 表2靶向紫杉醇纳米结构脂质载体对荷MCF-7乳腺癌肿瘤裸鼠的治疗效果[0035]

附图说明

[0036] 图1是本发明纳米结构脂质载体粒径分布图

[0037] 图2是本发明纳米结构脂质载体电位分布图

[0038] 图3是荧光染料-纳米结构脂质载体紫外吸收光谱(a荧光染料-纳米结构脂质载体；b荧光染料PBS溶液)。

[0039] 图4是荧光染料-纳米结构脂质载体荧光发射光谱(a荧光染料-纳米结构脂质载体；b荧光染料PBS溶液)。

[0040] 图5是本发明的具有靶向和荧光双功能的纳米结构脂质载体在肿瘤鼠体内的动态过程

具体实施方式

[0041] 实施例1

[0042] 靶向紫杉醇纳米结构脂质载体的制备：

[0043] 10mg硬脂酸溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解。加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和5mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1小时。再加入100mg葡萄糖胺，搅拌4小时，透析，得到靶向修饰的硬脂酸。

[0044] 取34mg靶向修饰的硬脂酸和34mg单硬脂酸甘油酯70℃水浴熔融，加入12mg油酸，充分搅拌混合均匀，再加入5mg紫杉醇，搅拌30min，加入30mL含有1.5％吐温20的去离子水，高速搅拌，超声，冰浴离心，得到靶向紫杉醇纳米结构脂质载体。

[0045] 脂质载体粒径分布见图1，表面电位见图2。

[0046] 实施例2

[0047] 靶向喜树碱纳米结构脂质载体的制备：

[0048] 10mg硬脂酸溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解。加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和5mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1小时。再加入100mg葡萄糖胺，搅拌4小时，透析，得到靶向修饰的硬脂酸。

[0049] 取34mg靶向修饰的硬脂酸和34mg单硬脂酸甘油酯70℃水浴熔融，加入12mg油酸，充分搅拌混合均匀，再加入5mg喜树碱，搅拌30min，加入30mL含有1.5％吐温20的去离子水，高速搅拌，超声，冰浴离心，得到靶向喜树碱纳米结构脂质载体。

[0050] 实施例3

[0051] 靶向荧光双功能紫杉醇纳米结构脂质载体的制备：

[0052] 10mg硬脂酸溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解。加入10mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和5mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1小时。再加入100mg葡萄糖胺，搅拌4小时，透析，得到靶向修饰的硬脂酸。

[0053] 取34mg靶向修饰的硬脂酸和34mg单硬脂酸甘油酯70℃水浴熔融，加入12mg油酸，充分搅拌混合均匀，再加入5mg荧光染料和5mg紫杉醇，搅拌30min，加入30mL含有1.5％吐温20的去离子水，高速搅拌，超声，冰浴离心，得到靶向荧光双功能紫杉醇纳米结构脂质载体。