一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及其制备方法转让专利
申请号 : CN201010565578.3
文献号 : CN102168058B
文献日 : 2013-01-16
发明人 : 夏立秋 , 丁学知 , 张允雷 , 胡胜标
申请人 : 湖南师范大学
摘要 :
一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及其制备方法，该抗肿瘤靶向工程菌含有抗肿瘤分泌表达载体pLAC-HA，其分类命名为大肠杆菌LMA1。构建所用的整合表达载体为pLAC，采用截断后的Plac组成性表达启动子，增强表达小肽Ehp。本发明还包括抗肿瘤靶向工程菌菌剂制备方法。动物试验结果表明，本发明之抗肿瘤靶向工程菌对肿瘤具有高度的靶向性，对正常实验室小鼠无明显不良影响，用其制得的菌剂是一种有效的治疗肿瘤的药物。
权利要求 :
1.一种抗肿瘤靶向工程菌，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）LMA1, 保藏编号：CCTCC NO：M 2010313。
2.抗肿瘤靶向工程菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)菌种活化
将保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2010313的抗肿瘤靶向工程菌大肠杆菌（Escherichia coli）LMA1划线接种于固体种子培养基斜面上，37℃条件倒置培养10～14h；挑取单菌落划线，37℃条件倒置培养10～14h作进一步的纯化；
(2)发酵种子液的制备
-1
挑取大肠杆菌LMA1接种到10mL含12.5µg.mL 氯霉素的LB培养基中，37℃下200r.-1 -1min 振荡培养8h至对数生长中期，将10mL培养液接种于1000mL含12.5µg.mL 氯霉素的-1LB培养基，37℃下200r.min 振荡培养12～14h，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按4％～
5％体积接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；
(3)生产发酵罐培养
先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按4％～5％体积的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通入无菌空气；
(4)制备制剂
发酵罐中发酵结束后，将菌液通过洗涤、纯化，补加各种添加剂制成菌剂；
2
所述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5 kg/cm 条件下灭菌30min，发酵罐接种后，在37℃条件下培养8小时，通气量4L/min，灌压为0.02～0.04MPa；
LB培养液配方：蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，余为水，pH值消毒前
7.0～7.4；
发酵罐培养基配方为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉12g/L，NaCl 10 g/L，葡萄糖13.7 g/L，.
K2HPO4 2.3 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 7H2O 0.25 g/L，余为水，pH值7.0～7.4；
发酵液要求：菌体的发酵液密度达到20 g/L以上，菌体量不足1020 g/L时放罐，pH值
7.0-7.4，无杂菌污染；
收集菌液，1100rpm 2min 离心收集菌体；生理盐水洗涤6-8遍：先使微生物低于-70℃条件下快速冷冻，然后真空冷冻干燥，冻干粉剂菌剂真空包装贮藏在器皿中，在4℃或-20℃保藏。
说明书 :
一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及菌剂制备方法，尤其是涉及一种含有分泌表达抗肿瘤AZURIN蛋白的大肠杆菌 Nissle 1917和菌剂及菌剂制备方法。
背景技术
[0002] 随着世界人口和寿命的增长，癌症发病率和死亡率持续上升。世界卫生组织(WHO)提供的《世界癌症报告》表明，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。目前全世界发病率最高的癌症是肺癌，每年新增患者为120万人；其次是乳腺癌，每年新增大约100万名患者； 随后依次是肠癌(94万人)、胃癌(87万人)、肝癌(56万人)、宫颈癌(47万人)、食道癌(41万人)等。其中杀伤力最强的是肺癌、胃癌和肝癌，分别占癌症死亡人数的17.8%、10.4%和8.8%。有关癌症的防治及治疗的研究已成为生物医学领域十分引人注目的课题之一。传统的化疗、放射疗法副作用大，肿瘤易复发和转移；手术治疗只对早期发现的肿瘤有效果，而一般肿瘤很难在早期被发现；脂质体包埋和靶向抗体治疗肿瘤等新方法，虽然在肿瘤靶向性上有了很大提高，但脂质体包埋的安全性还有待进一步验证，抗体靶向治疗的残留毒性也有待解决，现在还无法大规模推广应用。
[0003] 细菌靶向治疗肿瘤是利用细菌对肿瘤的高靶向性，通过细菌自身的抗肿瘤效应，或与传统的化疗、放疗、脂质体包埋、RNA干扰、基因修饰等相接合而达到诊断和治疗肿瘤的目的。研究最广泛和最深入的两种肿瘤靶向性细菌—减毒诺维氏菌（Clostridium novyi-NT）和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009（Salmonella typhimurium VNP20009）已在美国进入临床试验阶段。
[0004] 肿瘤靶向性细菌之所以被人们广泛关注，一方面是由于它们自身的抗肿瘤作用，另一方面是它们的靶向性。肿瘤靶向性细菌能够在肿瘤低氧坏死区生长繁殖，这正是化疗、放疗的盲区，因此肿瘤靶向性细菌被用于辅助化疗、放疗并取得了良好的效果。市场上的抗癌药物除了可以抑制杀死肿瘤细胞外，对人体的正常组织也有很大的毒害作用。因此肿瘤靶向性细菌被作为载体表达前体药物转换酶、血管形成抑制物、RNAi干扰因子或与脂质体结合来治疗肿瘤，并取得了明显的效果，最大限度减少了药物对正常组织的损害。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种对肿瘤具有靶向性，抗肿瘤效率高，抗癌谱广，经济、安全的治疗肿瘤的抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及菌剂制备方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
[0007] 研究表明，大肠杆菌 Nissle 1917是非致病性益生菌，已被临床上用于治疗新生儿痢疾，亦被用作日常生活的肠道保健菌。更重要的是，大肠杆菌 Nissle 1917对肿瘤具有高效靶向性。在对免疫耐受和免疫弱化小鼠的实验中，大肠杆菌 Nissle 1917在经小鼠静6
脉注射25天后在肿瘤中的量达到了10CFU/g，而在其它正常组织完全消失。
脉注射25天后在肿瘤中的量达到了10CFU/g，而在其它正常组织完全消失。
[0008] 另外，从绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中提取到的AZURIN蛋白是一种高效的抗肿瘤蛋白。它对正常组织细胞没有任何毒副作用，却有高效的抗肿瘤作用。其一旦进入肿瘤细胞，就可通过复杂的机制引起细胞凋亡，干扰肿瘤信号的传导及抑制血管生成；它还可分泌15kb DNA到细胞外，通过TLR9介导的NF-KB发挥抗肿瘤作用。
[0009] 本发明之抗肿瘤靶向工程菌，含有抗肿瘤分泌表达载体pLAC-HA（此载体在pSUMO载体上通过同源重组构建），其分类命名为大肠杆菌LMA1（Escherichia coli LMA1）；保藏日期：2010年11月24日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）；保藏单位地址：武汉，珞珈山，武汉大学内；保藏编号：CCTCC NO：M 2010313。
[0010] 本发明之抗肿瘤靶向工程菌，构建所用的整合表达载体为pLAC（此载体在pSUMO载体上通过同源重组构建），采用截断后的Plac组成性表达启动子，增强表达小肽Ehp（此增强表达小肽的序列为ATGACCATGATTTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAA）。
[0011] 本发明之抗肿瘤靶向工程菌的构建方法：将截断的Plac启动子、增强表达小肽Ehp与pEHA，通过重叠PCR技术获得包含三段基因序列的PCR产物，再通过RED/ET重组技术将PCR产物重组整合到表达载体pLAC，电击转化大肠杆菌 Nissle 1917，即得到大肠杆菌LMA1。
[0012] 具体地说，本发明之抗肿瘤靶向工程菌可以通过以下方法得到：在引物合成时，引入增强表达小肽Ehp、PCR扩增的方式把pELB分泌信号肽置于AZRUIN蛋白基因之前，通过重叠延伸PCR技术把pEHA和增强表达小肽Ehp置于组成型启动子截断的Plac的调控下，再通过RED/ET重组的方式整合到载体pLAC中，得到胞外分泌表达载体pLAC-HA；将pLAC-HA电转到大肠杆菌 Nissle 1917中，得到高效抗肿瘤靶向工程菌 -大肠杆菌 LMA1 (E.coli Nissle 1917 LMA1)
[0013] 更具体地说，本发明之抗肿瘤靶向工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0014] (1) PCR扩增截断的Plac启动子
[0015] PCR扩增Plac启动子LacI末端与LacZ前端序列GCGCCCAATACGCAAA CCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATT；设 计 引 物，Plac-F: CACCCTCATCAGTGCCAACATAGTAA GCCAGTATACACTCCGCTAGCGCGCGCCCAATACGCAAACCGCCT，下划线部分为特异性引物，其前端序列为同源臂；Plac-R: ATTTCTAGAGGATCC CCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC，下划线部分为特异性引物，其前端序列为同源臂，以pBlueScript KS(+)质粒为模板，Plac-F/ Plac-R为引物，扩增311bp的截断的Plac启动子及同源臂部分，反应条件为：94℃预变性 4 min；94℃变性 30sec，58℃退火 30 sec，72℃延伸 30 sec;30个循环;72℃延伸 10min；
[0016] （2）PCR扩增Pseudomonas aeruginosa PAO1菌azurin 基因
[0017] 根据GenBank中登录的登记号为NC_002516.2 的Pseudomonas aeruginosa PAO1的AZURIN蛋白的基因序列，以Pseudomonas aeruginosa PAO1的基因组为模板，设计引物a-F ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGAT TGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCTGCCGAGTGCTCGGTCACTGTC，下划线部分为同源臂，其前端为pELB信号肽序列和a-RACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTAAGCTTACTTGACGATGACCTTGCCTTTC，扩增出azurin 基因；再以OP-a-F GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTATTGCCTACG和a-R为引物，以azurin 基因的PCR产物为模板，扩增出带有重叠同源臂的、分泌信号肽和重组同源臂的azurin基因PCR产物，将所述azurin基因PCR产物命名为pEHA，反应条件为：94℃预变性 4 min，94℃变性45 sec，58℃退火 30 sec，72℃延伸 30 sec，30个循环；72℃延伸 10min；
[0018] （3）重叠延伸拼接截断的Plac启动子和pEHA
[0019] 用PCR回收试剂盒回收两次PCR的产物Plac和pEHA，并以回收产物Plac和pEHA为模板，以Plac-F/a-R为引物，采用重叠延伸拼接的方法扩增836 bp的融合基因，反应条件为：94℃预变性 4 min，94℃变性 45 sec，58℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30个循环；72℃延伸 10min；
[0020] （4）利用Red/ET重组技术构建基因重组载体pLAC-HA质粒
[0021] 用HindIII酶切载体pLAC，通过切胶回收pLAC载体片段和Plac-pEHA重叠PCR产物；电击转化E.coli YZ2005，复苏后涂氨苄抗性的LB平板，37℃培养过夜，次日挑选抗性斑划线，用菌落PCR初步筛选阳性转化子；然后将阳性转化子转接摇瓶，37℃摇床培养过夜，提取质粒，用Hind III /NdeI双酶切鉴定转化子质粒，进一步确定转化子，将酶切鉴定正确的质粒pLAC-HA测序；
[0022] （5）胞外分泌表达工程菌LMA1的构建
[0023] 提取重组整合质粒pLAC-HA，酶切鉴定后，电击转化大肠杆菌 Nissle 1917，经电转和复苏后涂氨苄抗性的LB平板，37℃培养过夜，次日挑选抗性斑划线，用菌落PCR初步筛选阳性转化子；然后将阳性转化子转接摇瓶，37℃摇床培养过夜，提取质粒，提取质粒用Hind III /NdeI双酶切鉴定转化子质粒,，进一步确定转化子，将酶切鉴定正确的质粒pLAC-HA测序；测序正确，即为胞外分泌表达抗肿瘤靶向工程菌 LMA1，也就是基因重组大肠杆菌LMA1。
[0024] 本发明之抗肿瘤靶向工程菌LMA1的生长条件简单，发酵周期短。
[0025] 本发明之抗肿瘤靶向工程菌（即基因重组大肠杆菌LMA1）菌剂的制备方法，主要工艺流程包括菌种活化、一级发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养, 具体包括以下步骤：
[0026] (1)菌种活化
[0027] 将保藏的基因重组大肠杆菌LMA1划线接种于固体种子培养基斜面上，37℃条件倒置培养10～14h；挑取单菌落划线，37℃条件倒置培养10～14h作进一步的纯化；
[0028] (2)、发酵种子液的制备
[0029] 挑取大肠杆菌LMA1接种到10ml含有12.5µg.mL-1氯霉素的LB培养基中，37℃下-1 -1200r.min 振荡培养8h至对数生长中期，将10mL培养液接种于1000mL含12.5µg.mL 氯-1
霉素的LB培养基，37℃下200r.min 振荡培养12～14h，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按
4％～5％（体积）接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；
霉素的LB培养基，37℃下200r.min 振荡培养12～14h，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按
4％～5％（体积）接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；
[0030] (3)、生产发酵罐培养
[0031] 先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按4％～5％（体积）的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通入无菌空气；
[0032] (4)、制备制剂
[0033] 发酵罐中发酵结束后，将菌液通过洗涤、纯化，补加各种添加剂制成菌剂；
[0034] 所述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3－0.5kg/cm2条件下灭菌-130min，发酵罐接种后，在37℃条件下培养8小时，通气量4L.min ，灌压为0.02～0.04MPa；
[0035] LB培养液配方：蛋白胨10 g.L-1，NaCl 10 g.L-1，酵母提取物5 g.L-1，余为水，pH值消毒前7.0～7.4；
[0036] 发酵罐培养基配方为：蛋白胨20g.L-1，酵母浸粉12g.L-1，NaCl 10 g.L-1，葡萄糖. -1 . -1 . -1 . . -113.7 gL ，K2HPO4 2.3 gL ，KH2PO4 1.5 gL ，MgSO42 7H2O 0.25 gL ，余为水，pH值7.0～
7.4；
7.4；
[0037] 发酵液要求：菌体的发酵液密度达到20 g.L-1以上，菌体量不足1020 g.L-1时放罐，pH值7.0－7.4，无杂菌污染；
[0038] 收集菌液，1100rpm 2min 离心收集菌体；生理盐水洗涤6-8遍；先使微生物在-70℃至-72℃条件下快速冷冻，然后真空冷冻干燥，冻干粉剂菌剂真空包装贮藏在器皿中，在4℃或-20℃保藏。
[0039] 用法：根据个体差异，用生理盐水溶解通过瘤内、静脉或口服给药。
[0040] 动物试验结果表明，本发明之基因重组大肠杆菌LMA1对肿瘤具有高度的靶向性，对正常实验室小鼠无明显不良影响，用其制得的菌剂是一种有效的治疗肿瘤的药物。
附图说明
[0041] 图1为Plac启动子和pEHA的重叠延伸拼接及分泌表达载体pSUMPELBAzurin的构建流程图；
[0042] 图2为Plac+NHP启动子PCR图谱；
[0043] 图3为pEHA图谱；
[0044] 图4为Plac启动子和pEHA的重叠延伸拼接PCR图谱；
[0045] 图5为重组载体pLAC-HA在E.coli YZ2005中的酶切鉴定图；
[0046] 图6为重组载体pLAC-HA在大肠杆菌E.coli Nissle 1917中的酶切鉴定图；
[0047] 图7为本发明抗肿瘤靶向工程菌分泌表达AZURIN蛋白的Western-Blot图谱；
[0048] 图8为本发明抗肿瘤靶向工程菌发酵生产工艺流程图；
[0049] 图9-1、图9-2、图9-3、图9-4为本发明抗肿瘤靶向工程菌菌剂在动物实验中，在肿瘤中AZURIN蛋白分泌表达的免疫组化图谱；
[0050] 图10-1、图10-2为本发明抗肿瘤靶向工程菌菌剂对4T1小鼠乳腺癌抗肿瘤效果图谱；
[0051] 图11为本发明抗肿瘤靶向工程菌对B16F10小鼠黑色素瘤抗肿瘤效果图谱；
[0052] 图12-1、图12-2 为本发明抗肿瘤靶向工程菌安全性试验图谱。
具体实施方式
[0053] 以下结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
[0054] 实施例1：本发明之抗肿瘤靶向工程菌的构建方法实施例
[0055] PCR扩增Plac启动子LacI末端与LacZ前端序列GCGCCCAATACGCAAA CCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATT；设计引物，Plac-F: CACCCTCATCAGTGCCAACATAGTAA GCCAGTATACACTCCGCTAGCGCGCGCCCAATACGCAAACCGCCT，下划线部分为特异性引物，其前端序列为同源臂；Plac-R: ATTTCTAGAGGATCC CCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC，下划线部分为特异性引物，其前端序列为同源臂，以pBlueScript KS(+)质粒为模板，Plac-F/ Plac-R为引物，扩增311bp的截断的Plac启动子及同源臂部分，反应条件为：94℃预变性 4 min；94℃变性 30sec，58℃退火 30 sec，72℃延伸 30 sec;30个循环;72℃延伸 10min（参见图2）；
[0056] （2）PCR扩增Pseudomonas aeruginosa PAO1菌azurin 基因
[0057] 根据GenBank中登录的登记号为NC_002516.2 的Pseudomonas aeruginosa PAO1的AZURIN蛋白的基因序列，以Pseudomonas aeruginosa PAO1的基因组为模板，设计引物a-F ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGAT TGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCTGCCGAGTGCTCGGTCACTGTC，下划线部分为同源臂，其前端为pELB信号肽序列和a-RACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTAAGCTTACTTGACGATGACCTTGCCTTTC,扩增出azurin 基因；再以OP-a-F GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTATTGCCTACG和a-R为引物，以azurin 基因的PCR产物为模板，扩增出带有重叠同源臂的、分泌信号肽和重组同源臂的azurin基因PCR产物，将所述azurin基因PCR产物命名为pEHA（参见图3），反应条件为：94℃预变性 4 min，94℃变性45 sec，58℃退火 30 sec，72℃延伸 30 sec，30个循环；72℃延伸 10min；
[0058] （3）重叠延伸拼接截断的Plac启动子和pEHA
[0059] 用PCR回收试剂盒回收两次PCR的产物Plac和pEHA，并以回收产物Plac和pEHA为模板，以Plac-F/a-R为引物，采用重叠延伸拼接的方法扩增836 bp的融合基因，反应条件为：94℃预变性 4 min，94℃变性 45 sec，58℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30个循环；72℃延伸 10min；具体流程参照图1；
[0060] （4）利用Red/ET重组技术构建基因重组载体pLAC-HA质粒
[0061] HindIII酶切载体pSUM，37℃酶切3h，通过切胶回收pLAC载体片段和Plac-pEHA重叠PCR产物；按2%转接过夜培养的E.coli YZ2005 到新鲜LB培养基中，震荡培养2h至OD600为0.35到0.4；冰浴10min，2℃以下11000转离心30s；去上清，用1ml的冰水悬浮菌体，再次离心，重复一次；去上清，分别加入2ul的pLAC载体片段和重叠PCR产物（2-3µg/ul DNA）；电击转化和复苏后，涂氨苄抗性的LB平板，37度培养过夜，次日挑选抗性斑划线，用菌落PCR初步筛选阳性转化子；然后将阳性转化子转接摇瓶，37℃摇床培养过夜，提取质粒，提取质粒进行用Hind III /NdeI酶切鉴定转化子质粒，酶切的结果见图5；进一步确定转化子，将鉴定正确的质粒pLAC-HA测序；
[0062] 具体操作方法可进一步参照以下文献：A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics , 1998 , 20(2):123-128；
[0063] （5）胞外分泌表达工程菌LMA1的构建
[0064] 提取重组整合质粒pLAC-HA，酶切鉴定后，电击转化大肠杆菌 Nissle 1917，经电转和复苏后涂氨苄抗性的LB平板，37℃培养过夜，次日挑选抗性斑划线，用菌落PCR初步筛选阳性转化子；然后将阳性转化子转接摇瓶，37℃摇床培养过夜，提取质粒，提取质粒用Hind III /NdeI双酶切鉴定转化子质粒,，进一步确定转化子，将酶切鉴定正确的质粒pLAC-HA测序；测序正确，即为胞外分泌表达抗肿瘤靶向工程菌 LMA1，也就是基因重组大肠杆菌LMA1。
[0065] 实施例2：本发明之抗肿瘤靶向工程菌菌剂的制备方法实施例
[0066] 工艺流程参照图8：
[0067] (1)菌种活化
[0068] 将保藏的基因重组大肠杆菌LMA1划线接种于固体种子培养基斜面上，37℃条件倒置培养12h；挑取单菌落划线，37℃条件倒置培养12h作进一步的纯化；
[0069] (2)发酵种子液的制备
[0070] 挑取大肠杆菌LMA1接种到10ml含有12.5µg.mL-1氯霉素的LB培养基中，37℃下-1 -1200r.min 振荡培养8h至对数生长中期，将10mL培养液接种于1000mL含12.5µg.mL 氯霉-1
素的LB培养基，37℃下200r.min 振荡培养13h，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在
121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按4.5％（体积）接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；
素的LB培养基，37℃下200r.min 振荡培养13h，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在
121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按4.5％（体积）接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，得二级种子罐发酵菌液；
[0071] (3)生产发酵罐培养
[0072] 先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按4.5％（体积）的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通入无菌空气；
[0073] (4)制备制剂
[0074] 发酵罐中发酵结束后，将菌液通过洗涤、纯化，补加各种添加剂制成菌剂；
[0075] 所述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.4kg/cm2条件下灭菌30min，发酵-1罐接种后，在37℃条件下培养8小时，通气量4L.min ，灌压为0.03MPa；
[0076] LB培养液配方：蛋白胨10 g.L-1，NaCl 10 g.L-1，酵母提取物5 g.L-1，余为水，pH值消毒前7.2；
[0077] 发酵罐培养基配方为：蛋白胨20g.L-1，酵母浸粉12g.L-1，NaCl 10 g.L-1，葡萄糖. -1 . -1 . -1 . . -113.7 gL ，K2HPO4 2.3 gL ，KH2PO4 1.5 gL ，MgSO42 7H2O 0.25 gL ，余为水，pH值7.2；
[0078] 发酵液要求：菌体的发酵液密度达到20 g.L-1以上，菌体量不足1020 g.L-1时放罐，pH值7.2，无杂菌污染；
[0079] 收集菌液，1100rpm 2min 离心收集菌体；生理盐水洗涤6-8遍；先使微生物在-70℃下快速冷冻，然后真空干燥，利用升华现象除去水分；真空包装在玻璃瓶中，-20度保藏。
[0080] 抗肿瘤靶向工程菌—大肠杆菌LMA1功能验证：
[0081] 1. Western-Blot检测azurin 基因的胞外分泌表达
[0082] 将已纯化的目标AZURIN蛋白免疫兔子，获得抗体后与辣根过氧化物酶连接，形成酶联抗体；收集培养液，离心后沉淀上清，将总蛋白电泳后转膜、用抗体杂交，洗脱、显色，确定是否有AZURIN蛋白分泌表达（参见图7）。
[0083] 2. AZURIN蛋白在肿瘤中表达情况的检测
[0084] 将4T1乳腺癌细胞在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至对数期后，用5
0.25%的胰酶消化收集细胞，PBS洗3次重悬至细胞浓度1×10/10ul。选取6-8周BABL/C雌鼠4只，在第四对乳腺注射4T1乳腺癌细胞10ul。9天后，把小鼠随机分为四组（PBS、E.coli Nissle 1917、E.coli Nissle 1917+Vector、E.coli LMA1），每组10只，分别尾静脉给药
6
100ul，PBS组：100ul PBS；E.coli Nissle 1917组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle
6
1917；E.coli Nissle 1917+Vector组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle+Vector；E.coli
6
LMA1组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli LMA1。第16天注射第2次，注射后第3天去肿瘤组织，4%多聚甲醛固定24h,然后包埋、切片，通过免疫组化检测AZURIN在肿瘤中的表达情况（见图9-1、9-2、9-3、9-4）。
0.25%的胰酶消化收集细胞，PBS洗3次重悬至细胞浓度1×10/10ul。选取6-8周BABL/C雌鼠4只，在第四对乳腺注射4T1乳腺癌细胞10ul。9天后，把小鼠随机分为四组（PBS、E.coli Nissle 1917、E.coli Nissle 1917+Vector、E.coli LMA1），每组10只，分别尾静脉给药
6
100ul，PBS组：100ul PBS；E.coli Nissle 1917组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle
6
1917；E.coli Nissle 1917+Vector组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle+Vector；E.coli
6
LMA1组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli LMA1。第16天注射第2次，注射后第3天去肿瘤组织，4%多聚甲醛固定24h,然后包埋、切片，通过免疫组化检测AZURIN在肿瘤中的表达情况（见图9-1、9-2、9-3、9-4）。
[0085] 3.下面的实验例用于进一步说明本发明。
[0086] 实验例一：本发明基因重组重组大肠杆菌LMA1菌剂对B16F10小鼠黑色素瘤生长的抑制作用
[0087] 本实验目的是研究大肠杆菌LMA1菌剂对B16F10小鼠黑色素瘤生长的抑制作用[0088] 将与人黑色素瘤相近的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞常规培养于10%FCS的1640培养基中，置于5%CO2的细胞培养箱中37℃培养。指数增殖期细胞经0.25%胰酶消化，离心收集后用PBS洗3次，台盼蓝染色，细胞悬液经计数后，检测细胞活力95%以上，最后用PBS重6
悬到1×10/mL。选取6-8周C57BL/6雌鼠40只，在小鼠的背部右侧皮下注射100ul B16F10小鼠黑色素瘤细胞。6天后，小鼠被随机分为4组，每组10只，分别尾静脉给药100ul，PBS
6
组：100ul PBS；E.coli Nissle 1917组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle 1917；E.coli
6
Nissle 1917+Vector组：2ⅹ 10 CFU/100ul E.coli Nissle+Vector；E.coli LMA1 组：
6
2ⅹ10 CFU/100ul E.coli LMA1。每周注射一次，22天后剥取肿瘤称重，计算肿瘤的抑制率，抑制率达到了54.89%（图10-1、10-2）。
悬到1×10/mL。选取6-8周C57BL/6雌鼠40只，在小鼠的背部右侧皮下注射100ul B16F10小鼠黑色素瘤细胞。6天后，小鼠被随机分为4组，每组10只，分别尾静脉给药100ul，PBS
6
组：100ul PBS；E.coli Nissle 1917组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle 1917；E.coli
6
Nissle 1917+Vector组：2ⅹ 10 CFU/100ul E.coli Nissle+Vector；E.coli LMA1 组：
6
2ⅹ10 CFU/100ul E.coli LMA1。每周注射一次，22天后剥取肿瘤称重，计算肿瘤的抑制率，抑制率达到了54.89%（图10-1、10-2）。
[0089] 实验例二：重组大肠杆菌LMA1菌剂对4T1乳腺癌的转移和增值的抑制作用[0090] 将4T1乳腺癌细胞在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至对数期后，用0.25%的胰酶消化收集细胞，PBS洗3次，经台酚蓝染色，细胞悬液经计数后，检测细胞活力
5
95%以上，最后用PBS重悬到1×10/10ul。选取6-8周BABL/C雌鼠40只，在第四对乳腺注射4T1乳腺癌细胞10ul。9天后，把小鼠随机分为四组（PBS、E.coli Nissle 1917、E.coli Nissle 1917+Vector、E.coli LMA1），每组10只，分别尾静脉给药100ul，PBS组：100ul
6
PBS；E.coli Nissle 1917组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle 1917；E.coli Nissle
6 6
1917+Vector组：2 ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle+Vector；E.coli LMA1组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli LMA1。每周注射一次，40天后剥取肿瘤和小鼠的肺组织称重并计算肺组织的表面转移灶节点数，计算药物对肿瘤增值和转移的抑制率。肿瘤增值抑制率达到了
55.95%，转移抑制率到达了66.5%（见图11）。
5
95%以上，最后用PBS重悬到1×10/10ul。选取6-8周BABL/C雌鼠40只，在第四对乳腺注射4T1乳腺癌细胞10ul。9天后，把小鼠随机分为四组（PBS、E.coli Nissle 1917、E.coli Nissle 1917+Vector、E.coli LMA1），每组10只，分别尾静脉给药100ul，PBS组：100ul
6
PBS；E.coli Nissle 1917组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle 1917；E.coli Nissle
6 6
1917+Vector组：2 ⅹ10 CFU/100ul E.coli Nissle+Vector；E.coli LMA1组：2ⅹ10 CFU/100ul E.coli LMA1。每周注射一次，40天后剥取肿瘤和小鼠的肺组织称重并计算肺组织的表面转移灶节点数，计算药物对肿瘤增值和转移的抑制率。肿瘤增值抑制率达到了
55.95%，转移抑制率到达了66.5%（见图11）。
[0091] 实验例三：大肠杆菌LMA1的急性毒性实验
[0092] 本实验的目的是研究肠杆菌LMA1菌剂的急性毒性。
[0093] 选取6-8周BABL/C雌鼠20只，分为两组（PBS组和E.coli LMA1组，每组10只。6
分别注射PBS（100ul）和E.coli LMA1（2ⅹ10 CFU/100ul），每周注射一次，共注射8次，观察50天。每两天测小鼠体重一次，共测量26次。50天后去小鼠的肝脾组织称重。观察小鼠并没有出现明显的症状，50天内实验组没有小鼠死亡，与对照相比，肝脾重量无统计学差异（见图12-1、12-2）。
分别注射PBS（100ul）和E.coli LMA1（2ⅹ10 CFU/100ul），每周注射一次，共注射8次，观察50天。每两天测小鼠体重一次，共测量26次。50天后去小鼠的肝脾组织称重。观察小鼠并没有出现明显的症状，50天内实验组没有小鼠死亡，与对照相比，肝脾重量无统计学差异（见图12-1、12-2）。
[0094] 本发明与现有的抗肿瘤药物相比具有以下优点：
[0095] (1)、抗肿瘤效果：AZURIN蛋白对人黑色素瘤UISO-Mel-2和MCF-7乳腺癌细胞的具有高效的抗肿瘤效果。抗肿瘤大肠杆菌LMA1菌剂对与人类相近的小鼠黑色素瘤B16-F10和4T1乳腺癌的抑制率达到了54.89%和55.95%。
[0096] (2)、没有任何毒副作用：与其它抗肿瘤药物相比，大肠杆菌LMA1菌剂分泌表达的AZURIN抗癌蛋白对正常细胞没有任何毒副作用；注射菌剂后，与对照相比，小鼠的生活习性、体重和肝脾重量没有任何变化。
[0097] (3)、对环境没有任何污染：大肠杆菌 Nissle 1917为人体益生菌，存在于人体的肠道中；工程菌所携带的Azurin基因对人、畜均无害。