一种泛素连接酶及其应用转让专利
申请号 : CN201010114623.3
文献号 : CN102168076B
文献日 : 2013-04-03
发明人 : 石太平 , 彭智 , 邓唯唯 , 李娜 , 郭帅 , 马大龙
申请人 : 北京诺赛基因组研究中心有限公司
摘要 :
本发明提供了一种泛素连接酶及其应用，所述泛素连接酶为如下所述的蛋白：由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的蛋白。本发明还提供了制备所述泛素连接酶的方法，还提供了编码所述的泛素连接酶蛋白的氨基酸序列的多核苷酸、包含所述多核苷酸的基因工程载体、宿主细胞，还提供了与所述泛素连接酶特应性结合的抗体，还提供了所述泛素连接酶、所述多核苷酸、所述载体以及所述抗体的应用。
权利要求 :
1.由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白作为泛素连接酶的应用。
说明书 :
一种泛素连接酶及其应用
技术领域
[0001] 本发明是关于一种新的泛素连接酶及其应用，本发明还涉及该泛素连接酶的制备方法，还涉及该泛素连接酶的编码基因及含有该基因的载体、宿主细胞，该泛素连接酶的抗体，以及它们的应用。
背景技术
[0002] 内质网相关的蛋白降解过程(ER associated degradation，ERAD)是细胞内重要的质量控制过程，对细胞内稳态的维持非常重要。在此过程中，内质网中的一些分子伴侣首先识别错误折叠的蛋白或者其它需要降解的蛋白，然后在泛素-蛋白酶体的参与下完成这种蛋白的降解。
[0003] 泛素-蛋白酶体是真核细胞靶向性降解正常、错误折叠胞浆或膜蛋白的主要途径。泛素-蛋白酶体系统包括泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和泛素解离酶(DUB)。蛋白酶体具有精确降解细胞内各种目的靶蛋白的功能，进而参与基因转录和细胞周期调节，以及受体胞吞、抗原提呈、细胞防御和信号转导等各种细胞生理过程。因此泛素-蛋白酶体也在治疗疾病特别是癌症和神经系统退行性疾病中发挥重要作用。例如，一种泛素-蛋白酶体抑制剂万珂(硼替佐米)已被用于多发性骨髓瘤的治疗。2004年诺贝尔化学奖授予了三位科学家，以表彰他们发现了蛋白质泛素化引起的细胞蛋白质降解。
[0004] 蛋白质的泛素化过程是一个依赖ATP的酶促反应：首先在E1的催化下，泛素C末端甘氨酸残基与E1的半胱氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性；E1-泛素结合的中间体再将泛素转移给E2，形成E2-泛素中间体；最后靶蛋白的泛素化还需要另一个特异的泛素蛋白连接酶E3。E3可以直接或间接与底物结合，促使泛素从与E2形成的硫酯中间产物转移到靶蛋白赖氨酸残基的ε氨基基团上，形成异肽键。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3的催化下相继与底物相连的泛素分子的第48位赖氨酸残基相连，形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26S蛋白酶体，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs从底物上水解下来而被重复利用。因为泛素-蛋白酶体对蛋白质的选择性降解是通过泛素连接酶来实现的，所以泛素连接酶就在这个过程中起到最为关键性的作用。
[0005] 泛素连接酶从结构域上主要分为三类，其中一种类型是含RING finger(指环)结构域的蛋白质。RING finger结构域是由40到60个氨基酸组成的一种锌指结构，能够结合两个锌原子，这个结构域可能参与蛋白与蛋白之间的相互作用，其基本组成是：CX2CX(9-39)C(1-3)HX(2-3)C/HX2C(4-48)CX2C，其中C是半胱氨酸，H是组氨酸，X代表任意氨基酸，括号中的数字代表任意氨基酸的个数。RING finger结构域最基本的组成是其中的几个最为保守的半胱氨酸和组氨酸，根据这些保守的氨基酸，这个结构域可以分为两种：
C3HC4和C3H2C3，后面的这种通常被命名为RING-H2型。含有RING finger结构域的分子参与到各种生命活动中。RING finger结构域的发现为了解泛素-蛋白酶体这个降解途径提供了更广泛的思路，且部分RING蛋白质还是潜在的靶点，有可能为治疗疾病提供帮助。然而，是不是所有的RING蛋白质均同泛素-蛋白酶体相关，并没有得到验证或证实，对于这方面的验证还需要进行更进一步的大量实验研究。
C3HC4和C3H2C3，后面的这种通常被命名为RING-H2型。含有RING finger结构域的分子参与到各种生命活动中。RING finger结构域的发现为了解泛素-蛋白酶体这个降解途径提供了更广泛的思路，且部分RING蛋白质还是潜在的靶点，有可能为治疗疾病提供帮助。然而，是不是所有的RING蛋白质均同泛素-蛋白酶体相关，并没有得到验证或证实，对于这方面的验证还需要进行更进一步的大量实验研究。
[0006] 另外，凋亡是所有多细胞生物的一个最基本的生理过程，是细胞的一种主动死亡行为，以维持机体细胞增殖和细胞死亡的平衡。它对于植物和动物的发育、昆虫和两栖类动物的变形、胚胎生长及器官的形态发生、组织的自稳、老化及感染和坏死细胞的清除等方面具有非常重要的意义。根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导通路分成两条：外源性通路(死亡受体通路)和内源性通路(线粒体通路)。两条信号通路汇集于下游的效应Caspase。效应Caspase在细胞凋亡的执行阶段能够直接引起重要蛋白质的降解和染色体DNA的断裂并最终导致细胞凋亡。
发明内容
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种新的泛素连接酶。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明所述的泛素连接酶蛋白的氨基酸序列。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种基因工程载体，其包含本发明所述的多核苷酸。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种经所述的基因工程载体转化、转染或转导得到的宿主细胞。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种与本发明所述泛素连接酶特应性结合的抗体。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种制备所述泛素连接酶的方法。
[0013] 本发明的另一目的在于提供所述泛素连接酶、所述多核苷酸、所述载体、所述抗体的应用。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种用于诊断肿瘤、治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物组合物。
[0015] 一方面，本发明提供了一种泛素连接酶，该泛素连接酶为如下a)或b)所述的蛋白：
[0016] a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
[0017] b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由a)衍生的蛋白。
[0018] 另一方面，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如上述a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：
[0019] a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或
[0020] b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或
[0021] c)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同泛素连接酶活性的蛋白的核苷酸序列。
[0022] 另一方面，本发明还提供了一种基因工程载体，其包含如上所述的多核苷酸；所述的载体优选选自细菌质粒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒。
[0023] 另一方面，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞经所述的基因工程载体转化、转染或转导得到；所述的宿主细胞优选选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
[0024] 另一方面，本发明还提供了一种抗体，其与由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其保守变异多肽或片段特异性结合；所述抗体优选为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0025] 另一方面，本发明还提供了一种制备所述泛素连接酶的方法，该方法包括：
[0026] 在适于表达的条件下，培养含有所述多核苷酸的宿主细胞；所述的宿主细胞优选为上述的宿主细胞；
[0027] 从所述细胞培养物中获得多核苷酸编码的蛋白，制备得到泛素连接酶。
[0028] 另一方面，本发明还提供了如下a)或b)所述的蛋白作为泛素连接酶的应用：
[0029] a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
[0030] b)在a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与a)限定的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的由a)衍生的蛋白。
[0031] 另一方面，本发明还提供了所述的泛素连接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程载体、或所述的宿主细胞在制备用于抑制ERK磷酸化的制剂中的应用。
[0032] 另一方面，本发明还提供了所述的泛素连接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程载体、所述的宿主细胞、或所述的抗体在制备用于肿瘤的诊断、基因治疗和/或疗效评价的药物组合物中的应用；优选所述的药物组合物为用于治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物组合物；优选所述的肿瘤为未分化甲状腺癌、胃癌、直肠癌、食道癌或肺癌肿瘤。
[0033] 另一方面，本发明还提供了一种用于诊断肿瘤、治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物组合物，该组合物含有所述的泛素连接酶，或所述的多核苷酸，或所述的载体，或所述的宿主细胞，或所述的抗体；以及一种或多种药用赋形剂或药用载体。优选所述的肿瘤为未分化甲状腺癌、胃癌、直肠癌、食道癌或肺癌肿瘤。
附图说明
[0034] 图1为本发明中人类RNF122基因的核苷酸序列，其中，方框标记的为起始密码子和终止密码子。
[0035] 图2为本发明中人类RNF122基因编码的氨基酸序列，其中，方框标记的为RINGfinger结构域的保守氨基酸。
[0036] 图3为pEGFP-N1-RNF122的构建流程示意图。
[0037] 图4为pEGFP-N1-RNF122-ΔTM的构建流程示意图。
[0038] 图5为真核表达质粒RNF122C92A-myc的构建流程示意图。
[0039] 图6为pGEX4T-1-RNF122ΔTM的构建流程示意图。
[0040] 图7显示RNF122ΔTM和mut-RNF122ΔTM原核表达结果。其中，左图片为GST-RNF122ΔTM和突变型GST-RNF122ΔTM原核表达蛋白SDS-PAGE图，右图片为Western blot验证实验结果，利用GST抗体证实所表达蛋白。
[0041] 图8显示RNF122经泛素-蛋白酶体途径降解实施例中检测RNF122的表达结果。其中，从左向右数第1、2、3道为HEK293T细胞，第4、5道为HeLa细胞。
[0042] 图9显示RNF122降解经RING finger结构域实现的实施例中的检测结果。
[0043] 图10显示体内RNF122的泛素化实验中的检测结果。
[0044] 图11显示RNF122重组蛋白自身泛素化实验结果。其中，左图片为RNF122泛素化，右图片中是使用突变型RNF122重组蛋白。
[0045] 图12为RNF122-ΔTM的亚细胞定位。
[0046] 图13显示RNF122跨膜区和RING finger结构域对细胞凋亡的影响。
[0047] 图14显示RNF122抑制ERK通路的活化实验结果。
[0048] 图15显示RNF122对EGF刺激产生信号的影响实验结果。
[0049] 图16显示RNF122与内质网应激的关系的实验结果。
[0050] 图17为Western blot鉴定RNF122多克隆抗体的实验结果。
具体实施方式
[0051] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种泛素连接酶，来源于人，其具有如SEQID NO：2所示的氨基酸序列；或者，该泛素连接酶为在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的蛋白。
[0052] 如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列为本发明的泛素连接酶的蛋白序列，称为RNF122蛋白，其由155个氨基酸残基组成，蛋白分子量为17.5kD，等电点为8.21，其具有泛素连接酶活性。根据本发明，可以对如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列进行取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，而获得与如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白具有相同泛素连接酶活性的衍生序列。所述取代、缺失或添加一个或几个(一般不超过10个)氨基酸而获得具有相同功能的衍生物的技术是本领域技术人员所已知的，例如可以是进行非极性氨基酸间或是极性氨基酸间(特别是不带电荷的极性氨基酸间或带相同电荷(带正电荷或负电荷)的极性氨基酸间)的取代。
[0053] 本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的泛素连接酶。所述的多核苷酸优选为具有以下核苷酸序列：
[0054] a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或
[0055] b)在严格条件下与a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；所述的严格条件例如为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜；
[0056] c)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性、且编码与由SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有相同泛素连接酶活性的蛋白的核苷酸序列。
[0057] RNF122基因为编码本发明的SEQ ID NO：2的多核苷酸，其核苷酸序列可以为SEQID NO：2所示氨基酸的编码序列，除了上述氨基酸序列的编码序列之外，还可以包括非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。所述多核苷酸可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及人工合成的DNA，可以是单链的或双链的，可以是编码链或非编码链。其中优选的基因为具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该序列全长1868个核苷酸，其包含编码RNF122蛋白的序列(例如编码序列(CDS：核苷酸第403～870位)和5′的非编码区(核苷酸第1～402位)和3′的非编码区(核苷酸第871～1868位))。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含RNF122蛋白的编码序列。
[0058] RNF122的基因组基因染色体定位8p12，由5个外显子和4个内含子组成。
[0059] 本领域普通技术人员已知，本发明RNF122的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ IDNO：1所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。例如，根据每个具体的原核宿主或者真核宿主所使用的密码子的频率不同，可以选择相应的密码子，从而提高所述的多核苷酸在相应的宿主中表达效率。也可以为了获得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸(如更长的半衰期)而转换密码子。
[0060] 本发明的多核苷酸能用本领域已有的方法获得。这些技术包括但不局限于：(1)通过杂交技术分离DNA序列；(2)人工化学合成DNA序列；(3)通过构建cDNA文库大规模获得所需的多核苷酸；(4)PCR扩增技术。例如，本发明的RNF122的核苷酸序列或其免疫性片段可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到核苷酸可以克隆进合适的载体中，然后利用在所述载体中的复制得到。也可以通过标准DNA合成技术得到，例如使用可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺三酯法在DNA合成仪上合成。本发明的基因，或者各种DNA片段等核苷酸序列的测定可用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)；也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需要反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
[0061] 本发明的RNF122蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白、半合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。
[0062] 本发明的RNF122蛋白可以通过常规方法获得，例如可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid PhasePeptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成仪或PioneerTM合成仪按固相化学技术合成，或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白或多肽。也可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生蛋白或多肽产物(Science，1984；224：1431)，例如包括以下步骤：(1)用本发明的多核苷酸(或其变异体)，或用含有此多核苷酸的表达载体转化、转染或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养步骤(1)得到的宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化所需的蛋白或多肽。
[0063] 根据本发明的另一方面，本发明提供一种含有本发明的多核苷酸的载体。本发明中的多核苷酸可以插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒，如腺病毒、逆转录病毒，或者其它载体。在本发明中适宜的载体可以是选自细菌质粒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒等。
[0064] 本发明还涉及用上述载体或者本发明的多核苷酸经基因工程产生的适于表达本发明泛素连接酶的宿主细胞。本发明的载体和多核苷酸可以用于转化适当的宿主细胞，如大肠杆菌，酵母菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞等，以使其能够表达RNF122蛋白。
[0065] 本发明还提供一种生产所述泛素连接酶的方法：在适于表达的条件下，培养含有编码本发明的多核苷酸或其片段的宿主细胞；从所述细胞培养物中获得多核苷酸编码的蛋白，即制备得到本发明的泛素连接酶。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组蛋白。具体地说，在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，这些方法是本领域技术人员所熟知的，如冻融法、超声处理法、渗透破菌、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的蛋白或融合蛋白，这些方法包括硫酸铁或乙醇沉淀法、酸萃取法、超离心、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法、高效液相层析和其它各种液相层析技术或这些方法的结合。
[0066] 本发明还提供针对所述的RNF122蛋白的抗体。所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体，优选中和性抗体。所述的抗体优选为与SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白或其保守变异多肽或片段特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体。所述“特异性结合”是指多克隆抗体或单克隆抗体特异性识别靶抗原并与靶抗原的不同抗原表位或抗原决定簇结合的特性。上述抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab片段和Fab表达文库产生的抗体；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的多肽蛋白或其免疫性片段的抗体可用本领域公知的抗体制备方法来生产。例子有：单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。多克隆抗体的生产可用本发明的蛋白或其免疫性片段免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。在本发明的一个实施例中(参见实施例14)，以本发明制备的纯化的RNF122N蛋白为例，制备了多克隆抗体，经Western blot鉴定抗体特异性，证实得到特异性好的抗体，该抗体可以用于检测本发明RNF122的存在或水平，或用于检测RNF122基因，可将该抗体进一步用于RNF122的表达谱分析和功能研究。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术产生(Morrison et al.PNAS，1985，81：6851)。单链抗体也可用已有的技术生产(U.S.Pat No.4946778)。本发明的各类抗体可以利用本发明的蛋白或其免疫性片段、衍生物、类似物或表达它们的细胞作为抗原，通过常规免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。
[0067] 根据本发明的一个方面，本发明证实了所述的RNF122蛋白为一种泛素连接酶(参见实施例5、6、7、8)。
[0068] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了所述的泛素连接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程载体、或所述的宿主细胞在制备用于抑制ERK磷酸化的制剂中的应用(参见实施例11)。
[0069] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了所述的泛素连接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程载体、所述的宿主细胞、或所述的抗体在制备用于肿瘤的诊断、基因治疗和/或疗效评价的药物组合物中的应用；优选所述的药物组合物为用于治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物组合物；优选所述的肿瘤为未分化甲状腺癌、胃癌、直肠癌、食道癌或肺癌肿瘤。本发明的RNF122的基因和蛋白可以以基因和蛋白的形式直接包含在用于治疗相关疾病的药物组合物中利用其瞬时表达产物进行治疗，也可以以包含在表达载体中的形式包含在用于治疗相关疾病的药物组合物中利用瞬时和稳定的表达产物进行治疗。
[0070] 本发明还提供了一种用于诊断肿瘤、治疗肿瘤、抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物组合物，该组合物含有所述的泛素连接酶，或所述的多核苷酸，或所述的载体，或所述的宿主细胞，或所述的抗体；以及一种或多种药用赋形剂或药用载体。药用赋形剂或药用载体指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。
[0071] 本发明的实验研究表明，本发明的泛素连接酶相关蛋白RNF122为一个新的泛素连接酶，定位于内质网，在大多数细胞中广谱表达，但在多数肿瘤组织中低表达或表达缺失。其过表达能够诱导细胞凋亡，N端跨膜区和RING finger结构域对于其发挥凋亡发挥重要作用。RNF122通过抑制ERK磷酸化参与调控ERK MAPK通路，并调节EGFR介导的信号通路，及在内质网应激相关通路发挥功能。本发明为进一步研究RNF122与细胞凋亡之间的调控关系，以及开发治疗肿瘤新药物，开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标提供了一个新的基础。实施例
[0072] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中未标明来源的试剂和材料均可商购获得。
[0073] 实施例1、RNF122基因的cDNA的克隆
[0074] 通过生物信息学分析，利用两步法RT-PCR技术扩增目的基因。
[0075] (1)对NCBI的refseq数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列，并利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，最终得到的序列：SEQID NO：1(RNF122基因，请参见图1所示，其所编码的氨基酸序列请参见SEQ ID NO：2及图2所示)。根据此类序列设计基因RNF122的特异引物：
[0076] 上游引物(5′-3′)：CATTGATGCACCCATTCCAGTG(SEQ ID NO：3)；
[0077] 下游引物(5′-3′)：TCTCCAGGTCTCGGTGTAGCG(SEQ ID NO：4)。
[0078] (2)用上述引物，按目的基因的表达谱在现有的cDNA文库和肿瘤文库中选择模板，进行初扩。现有的文库包括12种人体正常组织(心、胰、睾丸、卵巢、前列腺、结肠、小肠、骨骼肌、胸腺、淋巴结、扁桃体、白细胞)；6种人肿瘤组织(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌)；和8种胎儿组积(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎肾、胎脑、胎骨骼肌、胎胸腺)的cDNA文库(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初扩反应条件如下：
[0079] 50μl PCR反应：
[0080]
[0081] PCR延伸时间根据所扩目的基因的最长片段，按50sec/Kb的原则进行扩增：94℃5分钟； 4℃∞。初扩产物纯化到30μl，以去除PCR反应体系中大量的引物及dNTPs等，并浓缩整个体系，得到对应目的基因序列的二级扩增库，作为二扩(大扩)的模板。
[0082] (3)将(2)中的纯化产物作为模板，分别对目的基因进行二扩，反应条件如下：
[0083] 50μl PCR(每个基因)反应：
[0084]
[0085] PCR延伸时间根据所扩目的基因的最长片段，按50sec/Kb的原则进行扩增：94℃5分钟； 4℃∞。得到的PCR产物取10μl上样电泳，挑选有扩增条带的PCR产物，进行等体积纯化(40μl)。
[0086] 通过两步PCR反应扩增出非单一条带的基因，用Qiagen胶回收试剂盒(Qiagen，28706)切胶并纯化回收目的片段。
[0087] 取1μg 载 体 质 粒pcDNA3.1/myc-His(-)B( 以 下 简 称 pcDB)(Invitrogen，V85520)进行内切酶Xho I和EcoR I双酶切(37℃1小时)，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后将线形化的质粒条带切下，进行凝胶回收待用。将纯化的片断与Xho I和EcoR I处理后的载体连接、并转化大肠杆菌DH5α(可由TakaRa等公司市售购得)，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，表明序列正确，得到pcDB-RNF122(RNF122-myc)。
[0088] 实施例2、pEGFP-N1-RNF122与pEGFP-N1-RNF122-ΔTM质粒的构建
[0089] 用特异的引物(上游引物(5′-3′)：CTCGAGATGCACCCATTCCAGTG(SEQ ID NO：5)；下游引物(5′-3′)：TCTCCAGGTCTCGGTGTAGCG(SEQ ID NO：6)，从pcDB-RNF122扩增RNF122片断，同时去掉终止码，并引入Xho I和BamH I酶切位点，用相应的酶切EGFP-N1载体，T4连接酶连接，获得GFP-RNF122的融合表达载体pEGFP-N1-RNF122(参见图3所示)。使用引物5′-CCC CTC GAG AGG ATG AGC AAA CTG CGG AACCA-3′(SEQ ID NO：
7)和引物5′-CGG GGA TCC ACC ACC AGC TCA TCC AAT AGA-3′(SEQ ID NO：8)，以pEGFP-N1-RNF122为模板，PCR扩增目的片段，产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用Xho I和BamH I酶切回收片段，经纯化后与用Xho I和BamH I处理的pEGFP-N1载体连接，得到pEGFP-N1-RNF122-ΔTM(参见图4所示)，转化大肠杆菌DH5α，PCR筛选阳性克隆，测序验证。
7)和引物5′-CGG GGA TCC ACC ACC AGC TCA TCC AAT AGA-3′(SEQ ID NO：8)，以pEGFP-N1-RNF122为模板，PCR扩增目的片段，产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用Xho I和BamH I酶切回收片段，经纯化后与用Xho I和BamH I处理的pEGFP-N1载体连接，得到pEGFP-N1-RNF122-ΔTM(参见图4所示)，转化大肠杆菌DH5α，PCR筛选阳性克隆，测序验证。
[0090] 实施例3、真核细胞表达质粒RNF122C92A-myc和RNF122C95A-myc的构建[0091] 使用基于PCR的定点突变的方法构建突变型RNF122。所使用引物分别为P1：5′-CCGCTC GAG ATG CAC CCA TTC CAG TGG TG-3′(SEQ ID NO：9)，P2：5′-CGC GGA TCCGGC ACC AGC TCA TCC AAT AGA AT-3′(SEQ ID NO：10)，P3：5′-AG ACC GCAGTC TGT-3′(SEQ ID NO：11)，P4：5′-ACA GAC TGC GGT CT-3′(SEQ ID NO：12)，P5：
5′-A GTC CTG GAA GAC TT-3′(SEQ ID NO：13)和P6：5′-AA GTCTTC CAG
GAC T-3′(SEQ ID NO：14)；其中方框标记为引入的突变位点。
5′-A GTC CTG GAA GAC TT-3′(SEQ ID NO：13)和P6：5′-AA GTCTTC CAG
GAC T-3′(SEQ ID NO：14)；其中方框标记为引入的突变位点。
[0092] 如图5所示，RNF122C92A-myc以pcDB-RNF122为模板，先使用P1和P4为引物扩增，使用P3和P2为引物扩增，回收二者产物混合；以此为模板，使用P1和P2为引物进行扩增回收纯化，使用Xho I和BamH I酶切回收产物并纯化，然后连接到pcDB载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR筛选阳性克隆，并进行测序验证，表明序列正确。RNF122C95A-myc的构建基本同上述方法，其中使用引物P5和P6替换P3和P4。
[0093] 实施例4、RNF122原核蛋白的表达、纯化
[0094] (1)RNF122原核蛋白质粒的构建
[0095] 本实施例中的GST-RNF122ΔTM质粒是将去掉跨膜区的RNF122开放读码框插入到pGEX4T-1表达载体中构建的。设计的引物为：Forward 5′-CGC GGA TCC ATG AGC AAACTG CGG AAC CA-3′(SEQ ID NO：15)和Reverse 5′-CCG CTC GAG TCA CAC CAG CTCATC CAA TAG AAT-3′(SEQ ID NO：16)。开放读码框由pcDB-RNF122质粒中扩增而来，经测序表明序列正确。然后将PCR产物用Xho I/BamH I双酶切后连接到pGEX4T-1载体并测序验证得到表达质粒pGEX4T-1-RNF122ΔTM(参见图6)。而RING finger结构域突变型GST-mutRNF122ΔTM质粒则使用第92位氨基酸突变型RNF122作为模板，其余构建方法与表达质粒pGEX4T-1-RNF122ΔTM相同。
[0096] (2)将质粒克隆入表达宿主菌E.coli BL21
[0097] 取E.coli BL21甘油菌40μl于小试管中接种入2ml LB培养基，37℃300rpm振荡培养，待菌体生长后，再连续两次活化以得到状态良好的菌体；8000rpm 4℃离心5分钟得到菌体，并以1.2ml 0.1M CaCl2重悬菌体；去除CaCl2，以150μl CaCl2再次重悬，置于冰水中保存，使宿主菌处于感受态；
[0098] 18小时后，向感受态菌中加入2μl质粒，轻轻旋转混匀，在冰浴中放置30分钟；置于预先加温的37℃水浴中放置90s，不可摇动；快速移回冰浴之中，冷却5分钟，然后加入
850μl LB培养基，30℃水浴静置一小时使菌体复苏并表达质粒编码的抗生素标记，涂布带有氨苄青霉素的LB平板，倒置培养，过夜后得到阳性克隆并经酶切测序鉴定。
850μl LB培养基，30℃水浴静置一小时使菌体复苏并表达质粒编码的抗生素标记，涂布带有氨苄青霉素的LB平板，倒置培养，过夜后得到阳性克隆并经酶切测序鉴定。
[0099] (3)GST-RNF122ΔTM和GST-mutRNF122ΔTM重组蛋白表达
[0100] 从平板上挑取阳性克隆，置于3ml带有50U/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃静置培养过夜；次日转入100ml同样的培养基中37℃振荡培养；菌体达到对数生长期后转入1L同样培养基中同条件培养至OD600为0.75～0.85(此条件下表达量高，收获菌体多)；留取不诱导培养的对照以后，向培养基中加入IPTG至终浓度为0.4mM，并补加四分之一体积的新鲜培养基，37℃振荡培养4小时；以Beckman公司Avanti J-25型高速离心机JA-10转头4℃7000rpm离心10分钟收获菌体，并用pH 7.4的PBS洗涤菌体两次。
[0101] (4)重组蛋白RNF122ΔTM和mutRNF122ΔTM的纯化
[0102] 将洗涤好的菌体(1L培养基)重悬于100mL pH7.2的PBS中，置于冰浴中超声破碎。采用Uibra cell超声破碎仪，200W％Duty cycle为60，Out put为7，200秒一个循环，超声两次。JA-25.5转头12,000rpm 4℃离心30分钟，收集上清；以0.45μM微孔滤膜过滤上清等待上样。
[0103] 准备Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱。取层析柱料1毫升，置于小柱之中，以PBS(pH7.4)平衡一小时，将25毫升已过滤的裂解上清液在层析柱中循环使之充分结合，流速为1mL/min，4个循环，循环后的裂解液可以与下次合并再次过柱；用PBS洗涤柱料约10个柱体积以去除非特异结合的杂质蛋白；此时穿过液经紫外检测仪检测，读数为0.2A时基线为0；然后将层析柱再用10mmol/L还原型谷胱甘肽洗脱，用SDS-PAGE鉴定蛋白的纯度。将柱子用50mL 10mM GSH，50mM Tris，pH8.0洗涤，并用PBS清洗以再生层析柱料，20％乙醇保存备用。
[0104] 图7显示了本实施例中RNF122ΔTM和mut-RNF122ΔTM的原核表达情况。其中，左边的图片为GST-RNF122ΔTM和突变型GST-RNF122ΔTM原核表达蛋白的SDS-PAGE图，右边的图片为Western blot验证实验结果，利用GST抗体证实所表达蛋白。
[0105] 实施例5、RNF122经泛素-蛋白酶体途径降解
[0106] 构建带HA标签的泛素于真核表达载体pcDB中。293T细胞转染带有HA标签的泛素和带有myc标签的RNF122，收集细胞总蛋白使用抗myc抗体做免疫沉淀，然后再用HA抗体做Western blot来检测泛素。
[0107] 在转染了RNF122-myc的细胞中加入一种泛素蛋白酶体抑制剂MG132，然后提取细胞总蛋白检测是否有RNF122的表达。结果参见图8所示，在加入MG132的细胞中，能够检测到RNF122-myc的表达，并能随着时间的延长表达量增加。该实验提示RNF122是一个泛素蛋白酶体的底物，RNF122是通过泛素-蛋白酶体途径而被降解。
[0108] 实施例6、RNF122的降解通过RING finger结构域实现
[0109] 为了探讨RNF122降解的机制，本发明构建了RNF122的RING finger结构域突变体，分别将RNF122第92和第95个氨基酸即半胱氨酸突变为丙氨酸，从而改变RING finger结构域(参见实施例3、实施例4)。然后转染细胞HEK293T(ATCC：CRL-11268)检测其表达。参见图9所示，突变型的RNF122在未加入MG132即能够检测到蛋白质的存在且并不随MG132的加入表达量发生变化，说明RNF122通过RING finger结构域被降解。
[0110] 实施例7、体内自身泛素化实验
[0111] HEK293T细胞转染带有HA标签的泛素和带有myc标签的RNF122，如果RNF122是一个泛素连接酶，那么一般在转染之后会有自身的泛素化，也就是它自身也会被泛素化。本实施例中，HA-UB分别同pcDB、RNF122-myc、RNF122C92A-myc共转染HEK293T细胞，然后通过myc做免疫沉淀，然后再用HA抗体做Western blot来检测泛素。结果如图10所示，RNF122-myc组明显能够检测到弥散(smear)条带，而pcDB组则没有。在RNF122C92A-myc组能检测到稍弱的smear条带。提示RNF122在细胞内能够被泛素化，且同RING finger结构域相关。
[0112] 实施例8、无细胞系统的泛素化实验
[0113] 根据Biomol泛素化试剂盒提供方法，简述如下：先按如下量加入试剂：
[0114] 10×buffer 5μl
[0115] IPP(100U/mL) 10μl
[0116] DTT(50mM) 1μl
[0117] Mg-ATP(0.1M) 2.5μl
[0118] 20×E1(2μM) 2.5μl
[0119] 10×E2(0.5mg/ml，18-28μM) 5μl
[0120] 重组蛋白RNF122(2μM) 5μl
[0121] 20×Bt-Ub(50μM) 2.5μl
[0122] 水 16.5μl
[0123] 混匀，然后在37℃孵育30～60分钟。加50μl 2×非还原上样缓冲液，上样使用SDS-PAGE分离样品，转膜后使用HRP标记的streptavidin抗体，暗室胶片曝光。
[0124] 本实施例使用了RNF122ΔTM和mutRNF122ΔTM重组蛋白(实施例4制备)进行泛素化实验。结果参见图11所示，RNF122重组蛋白能够被泛素化，并且RNF122泛素化是通过泛素结合酶UbcH5a，、UbcH5b、UbcH5c、Ubc6和Ubc13介导(图中左边的图片)，而突变型RNF122被泛素化的程度明显降低(图中右边的图片)。提示RNF122能够在体外被泛素化，RNF122能够引起自身的泛素化。因此，证实了RNF122为一个新的泛素连接酶。
[0125] 实施例9、RNF122N端TM结构域是其细胞定位所必需的
[0126] 生物信息学分析提示RNF122分子的N端具有一个TM结构域(SEQ IDNO：2所示第37位～第59位氨基酸残基)。为了证明这一结构域与RNF122的内质网定位有关，本实施例通过PCR扩增去除了RNF122分子N端的60个氨基酸残基，生成一个截短突变体分子，称其为RNF122-ΔTM，并分别构建了真核表达质粒pcDB-RNF122-ΔTM和pEGFP-RNF122-ΔTM，以研究RNF122-ΔTM分子的细胞内定位情况及其功能。定位实验结果表明，TM结构域的去除破坏了RNF122的原有定位，如图12所示，在HeLa细胞中，RNF122-ΔTM分子不再定位于内质网，而是呈现胞质中弥散分布。野生型RNF122与RNF122-ΔTM分子之间显著的定位差异说明，TM结构域对RNF122分子特定的亚细胞定位至关重要。
[0127] 实施例10、RNF122跨膜区和RING finger结构域对细胞凋亡的影响
[0128] 本发明进一步研究了TM结构域和RING finger结构域对于RNF122分子诱导细胞凋亡的影响。在293T细胞中，通过流式细胞术分析PS外翻结果表明，RNF122-ΔTM和突变型RNF122分子转染后不能诱导细胞凋亡(参见图13)。这些功能实验的结果显示N端TM结构域和RING finger结构域对于RNF122分子在细胞内功能的发挥起着关键作用。
[0129] 实施例11、RNF122抑制ERK通路的活化
[0130] 本实施例通过免疫印迹分析实验验证RNF122调节的细胞通路。用pcDB、RNF122、RNF122C92A、RNF122C95A转染HEK293T，转染后24小时，提取细胞总蛋白进行Western blot分析pERK、ERK的表达量。参见图14显示，用抗磷酸化ERK抗体和抗非磷酸化ERK抗体检测，与pcDB组比较，RNF122组磷酸化ERK的水平明显降低，而转染两个突变型RNF122组则能够明显提高了ERK的磷酸化。以上结果证实，RNF122有可能抑制ERK磷酸化参与调控了ERK MAPK通路。
[0131] 实施例12、RNF122对EGF刺激产生信号的影响
[0132] 用表皮生长因子(EGF)刺激pcDB、RNF122、RNF122C92A、RNF122C95A转染的HEK293T细胞，在刺激的不同时间观察EGFR表达量的变化，结果参见图15所示，表明在EGF的作用下，突变型RNF122能够明显增强EGF刺激5分钟后EGFR的量。本实施例中同时还观察了在EGF刺激不同时间ERK磷酸化的情况。与pcDB转染组相比，在突变型RNF122转染的细胞，ERK磷酸化的程度在EGF刺激时间为5分钟时明显增高。以上结果表明，RNF122的表达对EGFR介导的信号可能具有调节作用。
[0133] 实施例13、RNF122与内质网应激的关系
[0134] RNF122为定位在内质网的蛋白质。本实施例是为研究RNF122是否同内质网应激相关并发挥功能。CD3δ被认为是内质网应激的一个通用底物。本实施例首先观察了野生型RNF122(wt RNF122)和突变型RNF122(mtRNF122)对CD3δ蛋白质表达量的影响。结果参见图16中上面的图片，相比于空载体pcDB组，野生型和突变型RNF122对CD3δ的含量没有显著影响。本实施例进一步使用诱导细胞发生内质网应激的方法，检测RNF122量是否能够随着内质网应激而发生变化。结果参见图16中下面的图片，无论何种方法诱导ER stress，RNF122的含量均没有明显的改变。而使用的对照HRD1则能够在加入BFA、DTT、TM等诱导剂的情况下表达量上升。
[0135] 实施例14、RNF122多克隆抗体及其制备
[0136] 用纯化的RNF122蛋白免疫家兔，一共免疫四次，制备多克隆抗体。初次免疫，将300μg纯化蛋白与0.5ml氟氏完全佐剂混合，于两足趾部各0.25ml皮下注射，其余背部皮下多点注射。初次免疫后每2周加强免疫一次，加强免疫时用同样量蛋白与0.5ml的不完全氟氏佐剂混合，加强免疫的不同时间取血用ELISA进行抗体滴度检测。步骤如下：
[0137] (1)包被抗原：用包被液将RNF122蛋白稀释至1μg/ml，加入酶标板，每孔加100μl，用保鲜膜包好后，置37℃孵育4小时。(2)洗涤：弃去孔中液体，每孔加满洗液，拍干，重复三次。(3)封闭：每孔加满封闭液，用保鲜膜包好后，置37℃孵育2小时。(4)重复
4 5 5
步骤2。(5)加不同稀释度的一抗(兔血清)；稀释度为1∶10、1∶10、1∶(5×10)、
6
1∶10，每孔加入100μl；免疫前正常兔血清也按照同等稀释度稀释后，每孔加入100μl，设做对照孔；用保鲜膜包好后，置37℃孵育2小时。(6)重复步骤2。(7)加入稀释的HRP标的二抗(羊抗兔抗体，Santa Cruz)，每孔50μl用保鲜膜包好后，置37℃孵育1小时。
(8)重复步骤2。(9)显色：采用OPD法显色，每孔加入50μl底物显色液，置室温避光显色
15～30分钟。(10)终止反应：每孔加入25μl 2M硫酸终止显色。(11)测值：终止后于20分钟内在酶标仪490nm波长下测定OD值。大于正常血清OD值10倍孔的为阳性孔。
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步骤2。(5)加不同稀释度的一抗(兔血清)；稀释度为1∶10、1∶10、1∶(5×10)、
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1∶10，每孔加入100μl；免疫前正常兔血清也按照同等稀释度稀释后，每孔加入100μl，设做对照孔；用保鲜膜包好后，置37℃孵育2小时。(6)重复步骤2。(7)加入稀释的HRP标的二抗(羊抗兔抗体，Santa Cruz)，每孔50μl用保鲜膜包好后，置37℃孵育1小时。
(8)重复步骤2。(9)显色：采用OPD法显色，每孔加入50μl底物显色液，置室温避光显色
15～30分钟。(10)终止反应：每孔加入25μl 2M硫酸终止显色。(11)测值：终止后于20分钟内在酶标仪490nm波长下测定OD值。大于正常血清OD值10倍孔的为阳性孔。
[0138] ELISA测得抗RNF122的多抗效价达到1∶106之后，利用Western Blotting检测其特异性。末次免疫后第14天心脏取血，免疫血清于-70℃保存。用带有融合myc标签的RNF122的质粒转染293T细胞，48小时后，裂解细胞，收取上清，做Western blot鉴定抗体特异性，结果请参见图17，分别用兔免疫血清(抗anti-C95)和anti-myc抗体检测。两个抗体都可以在相应的位置检测到特异的条带。表明免疫兔所获得的anti-C95能够识别真核表达的蛋白，在17kD和25kD可见两条带，推测分子量较大的带是经过修饰过的，例如泛素化。