通过花柱切面滴加获得抗旱转基因玉米自交系的方法

摘要

本发明涉及一种转基因玉米的制备方法，具体为一种通过花柱切面滴加获得抗旱转基因玉米自交系的方法。步骤是利用玉米自交系昌7-2、郑58，选取晴朗的天气于14：00－16：00自交授粉，授粉后16-20小时，即第二天上午10：00－12：00，用手术刀在授粉材料的花柱中间切断，在切口处用滴管分三次滴加15-20ul导入液，同时用注射管从授粉穗子中间往外抽空气，然后套袋自交筛选得到玉米自交系，所述的导入液为含有TPS目的基因的以农杆菌为介导的导入液。检测说明应用这种方法转化外源DNA可以得到玉米抗旱性新资源，是一条可行、有效的抗旱育种新方法。

权利要求

1.一种通过花柱切面滴加获得抗旱转基因玉米自交系的方法，其特征是玉米自交系，选取晴朗的天气于14：00－16：00自交授粉，授粉后20小时，即第二天上午10：00－12：

00，用手术刀在授粉材料的花柱中间切断，在切口处用滴管分三次滴加15-20ul导入液，同时用注射管从授粉穗子中间往外抽空气，然后套袋自交筛选得到玉米自交系，所述的导入液为含有TPS目的基因的以农杆菌为介导的导入液。

2.根据权利要求1所述的通过花柱切面滴加获得抗旱转基因玉米自交系的方法，其特征是导入液提取质粒DNA的浓度标准为300-350ug/ml。

说明书

通过花柱切面滴加获得抗旱转基因玉米自交系的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种转基因玉米的制备方法，具体为一种通过花柱切面滴加获得抗旱转基因玉米自交系的方法。

背景技术

[0002] 随着水资源的匮乏，干旱已成为影响玉米高产的最主要的非生物因素。中国干旱2
缺水地区面积占全国国土面积的52%，干旱成灾面积900万hm 左右，年直接粮食减收100亿kg以上，干旱已成为我国农业生产的最大挑战。通过品种改良提高玉米品种耐旱能力，是最为经济有效的方法，但玉米耐旱性多为微效多基因控制，遗传改良困难，进展不大。因此，利用转基因技术，将抗旱耐盐基因导入玉米自交系，打破物种间生殖隔离，创制玉米抗旱新种质，具有重要意义。

[0003] 许多微生物可在干旱、高温、高盐碱等恶劣环境条件下长期生存，这与细胞内高浓度海藻糖含量密切相关。研究表明，海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，广泛存在于酵母、藻类和一些低等维管植物中,最高含量可达10%以上。它能有效地保护细胞膜和蛋白质的结构，使生物体在异常情况下，如高温脱水、冷冻时仍保持细胞内湿润，防止细胞因失水而造成养分的损失和细胞的损伤。在利用植物转基因技术选育抗旱材料的研究中，Kishor等等将P5CS 基因导入烟草，转基因植株脯氨酸含量比对照高10～18 倍，间接证明转基因植株的抗旱性有了提高。杨东歌等利用基因枪轰击法以拟南芥脱水应答转录因子CBF4 基因转化玉米优良自交系的幼胚和胚性愈伤组织, 获得转基因植株。并证明转基因株系的抗旱能力在某种程度上有所提高。

[0004] 利用海藻糖的特性，通过基因工程技术把海藻糖合酶基因导入植物以改良其抗旱性已有一些成功的报道。如Holmstrom 等把来自大肠杆菌的海藻糖合酶基因OtsBA 导入甜菜、马铃薯中，使转基因植物的抗旱性和耐寒性得到了增强；Carlos 等把来源于酵母菌的海藻糖-6-磷酸合酶基因TPS 转入烟草，并初步获得具抗旱性的转基因植株；Yeo 等把来源于酵母菌的海藻糖-6-磷酸合酶基因TPS1 转入马铃薯中也增强了转基因植株的抗旱性；赵恢武等把来源于酵母菌的海藻糖-6-磷酸合酶基因TPS1 导入烟草中也初步获得了抗旱的转基因植株。这些都表明，把来源于微生物的海藻糖合酶基因转入植物中并使其在其体内表达能提高植物的抗旱性。

[0005] 将海藻糖合酶基因导入玉米中，理论上可以使玉米在生长中也能够产生抗旱、耐盐的效果。专利申请号为：201010218665.1公开了一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法，该技术方案公开了一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该基因在卷柏植物体内催化合成海藻糖所表现的优异的抗旱，耐盐等性能，可以预料将其导入玉米等作物中，也可以培育出具有相应的抗旱，耐盐性能的新品种。在其说明书实施例6中记载到以玉米自交系18-599的胚性愈伤组织为受体，农杆菌介导转化，经过筛选分化得到再生植株，经过鉴定基因已得到表达。

[0006] 现有技术中，花粉管通道法是在授粉后通过柱头向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。花粉管通道法基因导入应用在玉米自交系转基因育种中越来越普遍，但其转化效率低仍然是制约其应用的瓶颈。如何进一步提高其导入率将是今后很长一段时间研究的重点；研究发现，现今的花粉管通道法在操作过程中一般是仅切除柱头或者将整个花柱切除。这种操作手段的导入率或转化率据统计在2-5%左右。

发明内容

[0007] 本发明为了通过转基因技术提高玉米的抗旱性能，提供了一种通过花柱切面滴加含目的基因的DNA溶液，获得抗旱转基因玉米自交系的方法。

[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的，一种通过花柱切面滴加获得抗旱转基因玉米自交系的方法，步骤是利用玉米自交系昌7-2、郑58，选取晴朗的天气于14：00－16：00自交授粉，授粉后16-20小时，即第二天上午10：00－12：00，用手术刀在授粉材料的花柱中间切断，在切口处用滴管分三次滴加15-20ul导入液，同时用注射管从授粉穗子中间往外抽空气，然后套袋自交筛选得到玉米自交系，所述的导入液为含有TPS目的基因的以农杆菌为介导的导入液。

[0009] 本发明采用改进的花粉管通道法，通过在花柱中间切断的方法，将抗旱、耐盐基因海藻糖合酶基因（TPS）导入玉米自交系昌7-2、郑58中，利用海藻糖的抗逆耐旱特性，获得田间抗旱性表达较好的转基因玉米植株，进一步培育得到抗旱玉米新品种。然后通过分子检测，可以证明TPS目的基因已经导入玉米植株中，并且得到表达。通过耐旱性和耐盐碱性检测，表明玉米植株的耐旱性也得到明显提高。而且这种花柱中间切断的方法操作简单，操作效率高，导入率或转化率也有明显提高，达到9-12%。突破了传统的只能将花柱或者柱头切断的方法的局限性。

附图说明

[0010] 图1 部分材料的PCR检测电泳分离结果；

[0011] 图中：M 标记；P 质粒；- 阴性对照；1-10 转基因植株。

[0012] 图2 部分T3代转基因植株的Southern blot杂交分析结果；

[0013] 图中：P 质粒 CK 阴性对照 1、2、3 转基因植株。

具体实施方式

[0014] 1.材料与方法。

[0015] 1.1 植物材料与供体。

[0016] 1.1.1 受体。

[0017] 玉米稳定自交系昌7-2、郑58，为山西省农科院旱农中心保存。

[0018] 1.1.2 供体导入液的配置。

[0019] 转化供体质粒是p3UbiTPS，目的基因为TPS，植物筛选标记为bar基因，均由玉米 Ubiquitin 基因启动子驱动。农杆菌菌株为EHA101，由北京大学林忠平教授提供。上述材料已经有成熟的制备技术。

[0020] 1、摇菌过夜后，将菌液倒入2ml离心管中，倒满，10000rpm,1min,沉淀菌落。

[0021] 2、沉淀中加入1mlSTE，振荡均匀，10000rpm,1min,倒掉上清，用纸吸干。

[0022] 3、加溶液Ⅰ280ul，振荡混匀。 溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。

[0023] 4、加溶液Ⅱ320ul，颠倒混匀，冰上裂解5min。溶液Ⅱ： 0.2M NaOH，1% SDS。

[0024] 5、加溶液Ⅲ300ul, 颠倒混匀，冰上放置5min以上。溶液Ⅲ： 5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。

[0025] 6、离心13000rpm，5min,沉淀破碎物。

[0026] 7、将上清倒入一新的离心管中，加等体积氯仿，颠倒混匀。13000rpm,5min,然后将上清仔细吸入一个新的离心管中。

[0027] 8、加满冷冻无水乙醇，颠倒混匀，置于-20℃冰箱沉淀20min以上，然后离心13000rpm,5min。

[0028] 9、倒掉上清，用70%酒精洗沉淀2次，吹干。

[0029] 10、用50ul水，0.5ulRNASE溶解沉淀，即可使用或存于-20℃。

[0030] 11、导入液：用TE稀释，将提取质粒DNA的浓度标准为：300~350ug/ml。

[0031] 1.2 实验方法。

[0032] 1.2.1 DNA的导入方法。

[0033] 2009年夏，在太原选取长势旺盛的玉米自交系昌7-2、郑58，选取晴朗的天气于14：00－16：00自交授粉，授粉后16-20小时，即第二天上午10：00－12：00，用手术刀快速的在授粉材料的花柱中间切断，在切口处用滴管分三次滴加15-20ul导入液，同时用注射管从授粉穗子中间往外抽空气（为了形成压强差，有利于导入液的吸收），然后套袋自交获得T0代材料。

[0034] 1.2.2 田间试验方法。

[0035] 2009～2010年，在海南三亚将太原收获的T0代材料播种，通过抗除草剂筛选获得T1代材料；收获的T1代材料马上在三亚又进行抗除草剂筛选获得T2代材料；2010年6月，在太原将三亚收获的T2代材料种植；2010年12月，在三亚将筛选后的T3代材料种植。海南和太原基地都按穗行单粒播种，行长3m,株行距30cm×80cm，随机排列，筛选到的植株严格套袋自交，管理同大田。

[0036] 1.2.3 后代植株筛选方法。

[0037] 后代材料于3-5叶期时喷雾Basta（0.7%）溶液进行筛选，10天后调查成活苗数，成活苗可以初步认定为 PPT（除草剂草胺膦Phosphinothricin）抗性苗。 6-7叶期取样提取DNA进行分子检测，成活植株挂牌标记。

[0038] 1.2.4 NDA提取方法。

[0039] 各代植株于5叶期取样约200mg，在液氮中迅速冷冻并-40℃保存。其后按王关林方法提取植物总DNA; 质粒DNA的提取采用碱性裂解法，纯化用PCRFragment Recovery Kit 进行。

[0040] 1.2.5 分子检测。

[0041] PCR检测TPS基因的PCR扩增引物序列由Prime Primer V5软件设计，由上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物序列：5-'GGATCAGGTGAGGAAGGACTTGC-3，下游引物序列：5’-TCT TCC ACA TCT CCA CGA CTT GG-3’，扩增片段长度1.6kp。扩增体系20μl，取植物DNA150ng，扩增条件：94℃预变性，4m；94℃变性，45s；55℃退火，45s；72℃延伸60s；循环30次，72℃延伸10m。扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳分离，并于SYN成像系统观察照相。

[0042] Southern blot检测 取转化植株DNA（15μg）、对照植株DNA（15μg）和质粒DNA配制酶切体系。用限制性内切酶HindIII 酶切缓冲液Buffer0+（上海生工），反应体系50μL，加入限制性内切酶各15U，轻微离心后于37℃水浴中酶切过夜。酶切产物于1%琼脂糖凝胶上电泳分离，然后进行DNA变性、转移到尼龙膜上、固定、杂交。分析用DIG DNA Labling and Detection Kit和CSPD荧光染色盒购自Roche公司。TPS基因杂交探针制备按试剂说明书进行，杂交染色后用X—光片自显影曝光。

[0043] 1.2.4 转基因植株的抗旱性鉴定。

[0044] 转基因玉米的T2代经人工抗旱处理6d 后, 用磺基水杨酸法测定其叶片中的游离脯氨酸含量。

[0045] 转基因玉米的T2代经人工抗旱处理6d 后, 参照彭运生等的方法进行叶绿素含量测定, 取玉米叶片的中部, 准确称取鲜重(W), 剪碎, 置于15 mL 试管中,采用丙酮、无水乙醇(2∶1)混合液浸提, 每个样品加10 mL 混合液, 绝对黑暗的环境中浸提24 h。取提取液于721 型分光光度计分别在波长663 nm和645 nm下读取OD 值, 按以下公式计算叶绿素a 和叶绿素b的含量(Ca、Cb)。

[0046]

[0047] 转基因植株抗旱性和耐盐性鉴定 定植的转基因苗和对照的株高(Southern 检测为阳性的株系) 在15～20cm时, 进行胁迫处理, 转基因株系和对照均取3个植株的平均值, 每个株系设3次重复。第1组为不浇水干旱胁迫, 处理10d ; 第2组为盐胁迫,- 1 - 1
用NaCl 溶液浇灌植株, 浓度从50mmol L 开始, 每天提高50mmol L , 处理10d 后
- 1
至终浓度500mmol L ; 第3组为PEG26000 模拟的干旱胁迫, 连续10d用15%PEG浇灌。
未转基因植株也同时处理。处理前测定株高, 胁迫处理10d 后测定相应株号的株高, 对比得出株高增长数据, 用株高增长百分率表示植株生长情况, 同时测定转基因苗和对照正常管理(每天浇水) 10d后的株高增长数据。

[0048] 2 结果与分析。

[0049] 2.1 转化植株的获得。

[0050] 利用花粉管通道法初步筛选获得拟转化穗数，籽粒数为粒，收获的种子播种出苗为T0代材料，3-5叶期时喷雾Basta（0.7%）溶液筛选，获得株PPT抗性苗，随后于6叶期取叶片分子检测。播种的T1代为从T0代筛选抗PPT和分子检测阳性结果的植株；T2代为从T1代筛选抗PPT和分子检测阳性结果的植株。T3代为从T2代筛选和检测后的转化植株。各代植株或株系同时调查和分析抗旱性指标。

[0051] 2.2 PCR检测结果。

[0052] 对转化植株、阴性对照植株以及质粒的提取DNA进行PCR检测，发现T1代PCR扩增阳性结果率仅为43%左右，T2代提高到75-85%，T3代提高到96%。表明转基因材料在逐代纯化，遗传分离逐代减少。如图1所示意，转化植株扩增产物的电泳分离条带与阳性对照一致，所有阴性对照皆表现为PCR阴性结果，证明PCR扩增方法正确，结果可靠。

[0053] 2.2.2 Southern blot杂交分析结果。

[0054] 各代材料的杂交分析结果见表1。随着代数增加。杂交分析的阳性结果率明显提高。特别是T3 代，发现株系1001和1004已为纯合的转基因株系。Southern blot杂交分析结果同时证明目的基因已整合到转化植株的基因组上，而且目的基因可在转化植株中稳定遗传和表达，这从后边的抗旱指标分析结果中可以得到证明。

[0055] 图2是T3代部分转化植株的Southern blot杂交分析结果。一条杂交条带证明目的基因是以单拷贝单位点方式整合到植物基因组上。

[0056] 表1 转化植株的PCR和Southern blot杂交检测结果。

[0057]

[0058] 2.3 转化植株的抗旱性鉴定。

[0059] 2.3.1 转化植株中游离脯氨酸的含量。

[0060] 脯氨酸是一种重要的细胞内渗透调节物质，其在植物体内的含量与植物自身的抗旱性呈正比。而且在植物受到水分胁迫时脯氨酸可大量积累。为了鉴定本研究所获得转基因株系的抗旱能力, 将T1 代长势较好的并且经分子检测阳性的1个转基因株系所获得的种子(T2 代)种植到温室花盆中，通过PCR 的方法筛选到11 个阳性植株。干旱处理下测定这11 个阳性植株的脯氨酸含量。从表2可以看出, 除5 号转基因植株的脯氨酸含量比对照稍低外, 其余转基因植株均比对照高, 其中7 号最高, 达到了196.19μg /g, 约为对照的2.5 倍, 而其余也比对照高出20%以上, 脯氨酸含量测定结果间接表明转基因植株的抗旱能力高于非转因植株。

[0061] 2.3.2 转化植株中叶绿素含量的测定。

[0062] 除脯氨酸含量外, 我们还对筛选的11个阳性转基因植株进行了叶绿素含量测定, 叶绿素是植物叶片的主要光合色素, 为植物抗旱生理研究中的重要指标。从表2中可以看出, 干旱处理下的部分转基因植株的叶绿素含量远远高于对照水平, 其中7号叶绿素含量(2.327 mg/g )是对照的2倍多, 此项结果也表明部分转基因植株的抗旱能力高于非转基因植株。

[0063]

[0064] 2.3.3 转化植株的抗旱性和耐盐性鉴定。

[0065] 选取6株转基因植株和6株非转化植株进行盐胁迫和PEG胁迫试验，记录植株生长状况，7叶期测定植株株高并称量单株重量。结果显示转基因玉米生长状态比对照植株良好，生长势强于未转基因的对照，株高比对照提高了4-7cm ，单株重量比对照增加28 %～34 %；NaCl 和PEG胁迫之间差异不明显(表3)。植株形态学特征未见异常，说明外源基因的导入提高了转基因植株对干旱和盐碱的抗性，而且并未引起转化植株形态的异常。

[0066]

[0067] 3 结论。

[0068] 利用转基因技术创制植物新种质，可以冲破物种的界限，实现物种间的基因传递，改良现有物种的生物性状，进而培育作物抗逆新品种。目前我国学者建立的花粉管通道法在棉花、大豆、玉米等作物中已广泛应用，祁永红等报道利用花粉管通道技术将外源总DNA导入玉米自交系，建立了成熟的导入技术；王罡等将Bt基因通过花粉管通道法导入吉林省骨干玉米自交系中。本发明利用改进的花粉管通道法将抗旱基因TPS导入玉米自交系，通过对后代材料喷雾Basta（0.7%）溶液筛选和分子检测，获得的T3代转基因植株对PPT有较高抗性，取样扩增产物的电泳分离条带与阳性对照一致，所有阴性对照皆表现为PCR阴性结果，说明应用这种方法转化外源DNA可以得到玉米抗旱性新资源，是一条可行、有效的抗旱育种新方法。