流体检测试片及其测试方法

摘要

本发明提供一种流体检测试片及其测试方法。流体检测试片包含有具有流道的基板，流道上设置有依序连接的第一流体区、第二流体区与第三流体区。此外，流道具有位于第一流体区的第一抗体、位于第一流体区或第二流体区的醣类材料及过氧化物酶、固定于第二流体区的第二抗体，并与第一抗体辨识同一待测物上相异的抗原决定位置、位于第三流体区中的发光剂与包含有醣氧化酶的受质反应试剂。当流体注入流道后，利用醣氧化酶催化流至第三流体区的醣类材料，并产生出过氧化氢，并同流至第三流体区的过氧化物酶催化发光剂进行反应，产生光学信号。

权利要求

1.一种流体检测试片，主要包含基板，该基板包含至少一个流道，该流道包含依序连接的第一流体区、第二流体区与第三流体区，该第一流体区是供流体的注入，其特征在于：该第一流体区的底部形成有纤维层；

该第二流体区与该第三流体区的底部各自形成有硝化纤维层；

该流体检测试片进一步包含有：

第一抗体，位于该第一流体区的纤维层中，用于辨识待测物质；

醣类材料，位于该第一流体区或该第二流体区中；

过氧化物酶，位于该第一流体区或该第二流体区中；

第二抗体，固定于该第二流体区的硝化纤维层中，该第二抗体亦辨识该待测物质，且该第二抗体及该第一抗体是辨识相异的抗原决定位置；以及发光剂与受质反应试剂，位于该第三流体区的硝化纤维层中，该受质反应试剂包含有醣氧化酶；

其中，该第一抗体与该过氧化物酶直接形成共轭结合，或是该第一抗体与一生物素形成共轭结合且该过氧化物酶与一亲和素形成共轭结合；

藉此，当包含有该待测物质的流体注入该流道后，该第一抗体、该醣类材料及该过氧化物酶是随着该流体流动，部分的过氧化物酶会与该第一抗体、该待测物质及该第二抗体结合并留置于该第二流体区中，未结合的过氧化物酶则随流体流至该第三流体区，且该醣氧化酶会催化流至该第三流体区的该醣类材料进行氧化反应，并产生出过氧化氢，且该发光剂会受到流至该第三流体区的该过氧化物酶催化与该过氧化氢进行反应，并产生光学信号。

2.如权利要求1的流体检测试片，其中该亲合素是选自由下列单元所组成的群组其中之一，包括有卵白素、链霉亲合素，及中性链亲和素。

3.如权利要求1的流体检测试片，其中该流道进一步包括第四流体区，该第四流体区的底部亦形成有硝化纤维层，该硝化纤维层包含有中空网状构型，供多余流体的贮存。

4.一种流体检测方法，包含有下列步骤：

提供流体，该流体包含有待测物质；

提供基板，该基板包含至少一个流道，该流道包含依序连接的第一流体区、第二流体区与第三流体区，该第一流体区是供流体的注入，其特征在于：该第一流体区的底部形成有纤维层，且该第二流体区与该第三流体区的底部各自形成有硝化纤维层；及该基板进一步包含有：

第一抗体，位于该第一流体区的纤维层中，用于辨识该流体内的该待测物质；

醣类材料，位于该第一流体区或该第二流体区中；

过氧化物酶，位于该第一流体区或该第二流体区中；

第二抗体，固定于该第二流体区的硝化纤维层中，该第二抗体亦辨识该待测物质，且该第二抗体及该第一抗体是辨识相异的抗原决定位置；以及发光剂与受质反应试剂，位于该第三流体区的硝化纤维层中，该受质反应试剂包含有醣氧化酶；

其中，该第一抗体与该过氧化物酶直接形成共轭结合，或是该第一抗体与一生物素形成共轭结合且该过氧化物酶与一亲和素形成共轭结合；

将该流体加至该流道的第一流体区，使该第一抗体、该醣类材料及该过氧化物酶随着该流体流动；

使该待测物质与该第一抗体、该第二抗体及部分的过氧化物酶结合并留置于该第二流体区中，使该流体带着该醣类材料、未结合的第一抗体及过氧化物酶流至该第三流体区，使该醣类材料受到该醣氧化酶的催化进行氧化反应，并产生出过氧化氢，该发光剂会受到流至该第三流体区的该过氧化物酶催化与该过氧化氢进行反应，并产生光学信号；以及侦测该光学信号。

5.如权利要求4的流体检测方法，其中该亲合素是选自由下列单元所组成的群组其中之一，包括有卵白素、链霉亲合素，及中性链亲和素。

6.如权利要求4的流体检测方法，其中该流道进一步包括第四流体区，该第四流体区的底部亦形成有硝化纤维层，该硝化纤维层包含有中空网状构型，供多余流体的贮存。

说明书

流体检测试片及其测试方法

技术领域

[0001] 本发明是关于一种流体检测试片，特别是一种有关于用于定量检测的流体检测试片。

背景技术

[0002] 在生物检体的定量的已知的技术中，常利用免疫分子具有专一性辨识能力的特定来进行测量，例如传统的酵素连结免疫吸附测试(enzyme linked immunolsorbent assay，ELISA)，多在96孔盘(96-well plate)中操作，并通过侦测最终酵素反应所发出的信号，回推待测物质的浓度。但是由于此种测试，为了要避免免疫分子与待测物中包含的其它杂质进行非专一性结合，所以必须在各个反应阶段加入清洗的步骤，藉以将未与待测物或是其它免疫分子结合的反应试剂自96孔盘中清除，以免造成过多的酵素留置于各孔位(well)中所造成的伪阳性信号，导致测试失败。

[0003] 由于机电技术的发展，已有利用具有微流道结构的测试试片进行免疫侦测，简化上述传统测试方法中于各步骤后进行清洗等繁琐流程。然目前已知的测试试片，在进行侦测时仍需将反应试剂或反应所需的受质(substrate)以额外添加的方式加入测试试片中。此种反应试剂或受质与检测试片分离存放，于侦测时再行添加的方式乃是起因于其所需的反应试剂或受质，在室温中无法长期存放，需保存于特定环境中(如冷藏或避光保存)，以避免因反应物变质所导致的测试误差。故此种检测试片在操作及保存上仍多有所不便。

[0004] 此外已知的具有流道或微流道结构的流体检测试片，因流道周围并非吸水材质，且待测流体多为含有如蛋白质或是醣类等黏滞度高的组成物，所以当待测流体流过后，会在流道上残留，使得待测流体无法完全反应，如此一来，不仅造成待测流体的浪费，更可能造成最终测试结果的误差。

[0005] 此外，已知的具有微流道结构的流体检测试片在流体传送方面，则是利用微流道结构产生的毛细现象，将流体经过流道被动传送至反应侦测区域；另一种方式则是在注入待测流体时即利用加压等方式，给予流体驱动力，使得流体可主动通过流道，到达反应侦测区域。但是无论是上述任一种方式，待测流体注入流道后常常产生大小不一的气泡使得流道阻塞，造成实际测量上的误差，甚至致使测试失败。

发明内容

[0006] 为克服上述缺点，本发明提供一种流体检测试片，包含有具有流道的基板。流道上设置有依序连接的第一流体区、第二流体区与第三流体区，其中第一流体区是供流体的注入。此外，流道中具有第一抗体、醣类材料、过氧化物酶、第二抗体、发光剂与受质反应试剂。第一抗体位于第一流体区中，用于辨识待测物质。醣类材料及过氧化物酶则位于第一流体区或第二流体区中。第二抗体则是固定(immobilized)于第二流体区中，且亦辨识同一待测物质，并且第二抗体及第一抗体是辨识相异的抗原决定位置(epitope)。发光剂与受质反应试剂是共同位于第三流体区中，受质反应试剂包含有醣氧化酶。藉此，当包含有待测物质的流体注入流道后，第一抗体、醣类材料及过氧化物酶是随着流体流动，部分的过氧化物酶会与第一抗体、待测物质及第二抗体结合并留置于第二流体区中，未结合的过氧化物酶则随流体流至该第三流体区，且醣氧化酶会催化流至第三流体区的醣类材料进行氧化反应，并产生出过氧化氢(H2O2)，且发光剂会受到流至第三流体区的过氧化物酶催化与过氧化氢进行反应，并产生光学信号。

[0007] 因此，本发明的主要目的，是提供一种流体检测试片，由于具有所有反应所需的试剂及材料，无须经由繁琐的操作步骤即可直接测量最终反应信号进行定量侦测。

[0008] 本发明的另一目的，是提供一种流体检测试片，其中反应所须的试剂与材料，在反应前是以干燥方式留存于试片中，故可长期保存，不致因试剂变质而导致测试误差。

[0009] 本发明亦提供一种流体检测方法，主要包含下列步骤。(1)提供具有待测物的流体。(2)提供基板，基板包含至少流道，而流道包含依序连接的第一流体区、第二流体区与第三流体区，第一流体区是供流体的注入。基板上进一步包含有第一抗体，位于第一流体区中，用于辨识该流体内的该待测物质；醣类材料，位于第一流体区或第二流体区中；过氧化物酶，位于第一流体区或第二流体区中；第二抗体，固定于第二流体区中，且亦辨识同一待测物质，而第二抗体及第一抗体是辨识相异的抗原决定位置；以及发光剂与受质反应试剂，位于第三流体区中，受质反应试剂包含有醣氧化酶。(3)将流体加至流道的第一流体区，使第一抗体、醣类材料及该过氧化物酶随着流体流动。(4)使待测物质与第一抗体、第二抗体及部分的过氧化物酶结合并留置于第二流体区中，使流体带着醣类材料、未结合的第一抗体及过氧化物酶流至第三流体区，使醣类材料受到醣氧化酶的催化进行氧化反应，并产生出过氧化氢，发光剂会受到流至第三流体区的过氧化物酶催化与过氧化氢进行反应，并产生光学信号。(5)侦测产生的光学信号。

[0010] 因此，本发明的另一目的，是提供一种流体检测方法，由于具有所有反应所需的试剂及材料，无须经由繁琐的操作步骤即可直接测量最终反应信号进行定量侦测。

[0011] 本发明的另一个目的，是提供一种流体检测方法，其中反应所须的试剂与材料，在反应前是以干燥方式留存于试片中，故可长期保存，不致因试剂变质而导致测试误差。

附图说明

[0012] 图1A，为本发明的第一较佳实施例流体检测试片的示意图。

[0013] 图1B，为本发明第一较佳实施例流体检测试片流道中反应材料分布示意图。

[0014] 图1C至图1E，为本发明第一较佳实施例流体检测试片流道中反应材料在不同反应阶段的分布示意图。

[0015] 图1F至图1H，为本发明第一较佳实施例流体检测试片流道中反应材料其它方式分布示意图。

[0016] 图1I，为本发明第一较佳实施例流体检测试片剖面示意图。

[0017] 图2，为本发明第二较佳实施例流体检测方法的流程示意图。

[0018] 主要组件符号说明

[0019] 流体检测试片 1

[0020] 基板 10

[0021] 流道 11

[0022] 待测物质 1101

[0023] 第一流体区 111

[0024] 纤维层 1110

[0025] 第一抗体 1111

[0026] 醣类材料 1112

[0027] 过氧化物酶 1113

[0028] 第二流体区 112

[0029] 第二硝化纤维层 1120

[0030] 第二抗体 1121

[0031] 第三流体区 113

[0032] 第三硝化纤维层 1130

[0033] 发光剂 1131

[0034] 受质反应试剂 1132

[0035] 醣氧化酶 1133

[0036] 步骤 21、22、23、24、25

具体实施方式

[0037] 由于本发明是公开一种流体检测试片及其测试方法，其中所利用化学原理及生物检测技术，已为相关技术领域具有通常知识者所能明了，所以下文中的说明，不再作完整描述。同时，以下文中所对照的附图，是表达与本发明特征有关的示意，并没有也不需要依据实际情形完整绘制，事先叙明。

[0038] 请参考图1A，为本发明的第一较佳实施例流体检测试片的示意图。流体检测试片1包含有基板10，基板10包含有流道11。流道11上设置有依序连接的第一流体区111、第二流体区112与第三流体区113，其中第一流体区111是供流体的注入。

[0039] 请继续参考图1B，为本发明第一较佳实施例流体检测试片流道中反应材料分布示意图。第一流体区111中具有第一抗体1111、醣类材料1112及过氧化物酶1113。第二流体区112中具有第二抗体1121，而第二抗体1121是固定在第二流体区112之中。并且，第一抗体1111与第二抗体1121都是辨识流体中的同一种待测物质1101，但是第一抗体1111与第二抗体1121是各自辨识待测物质1101上不同的抗原决定位置。所以在第一抗体1111和第二抗体1121的选用上，两者均可为单株抗体(mAb)或多株抗体(pAb)，只需要第一抗体1111和第二抗体1121是一组抗体配对(antibody pair)，在进行抗原辨识时，不致发生互相干扰的状况即可。第三流体区113的中则具有发光剂1131与受质反应试剂1132，受质反应试剂1132包含有醣氧化酶1133。其中，过氧化物酶1113可以是辣根过氧化物酶(HRP，Horseradish Peroxidase)、抗坏血酸过氧化物酶(AP，Ascorbate Peroxidase)或是过氧化氢酶(hydrogen peroxidase)。在较佳的实施状态中，发光剂1131是用3-氨基邻苯二甲酰肼(5-Amino-2，3-dihydro-1，4-phthalazinedione)，而醣类材料1112则可为葡萄糖，于此同时，醣氧化酶1133则是选用葡萄糖氧化酶。

[0040] 请继续参考第1C至图1E，为本发明第一较佳实施例流体检测试片流道中反应材料在不同反应阶段的分布示意图。首先请参考图1C，当含有待测物质1101的流体注入流道11之后，第一抗体1111会辨识到待测物质1101，并与其做结合。此外，由于第一抗体1111、醣类材料1112及过氧化物酶1113并未固定于第一流体区中，所以此时第一抗体1111、与第一抗体1111结合的待测物质1101、过氧化物酶1113，及醣类材料1112会随着流体一起继续往第二流体区112流动。

[0041] 请继续参考图1D，当流体流至第二反应区112之后，第二抗体1121会与待测物质1101结合。此时，由于第二抗体1121是固定在第二流体区112之中，所以会将已经与待测物质1101结合的第一抗体1111以及在第一抗体1111之上的过氧化物酶1113一并留置于第二流体区112之中；而此时亦流至第二流体区112的醣类材料1112则会和未与待测物质
1101结合的第一抗体1111和过氧化物酶1113随着流体继续向第三流体区113流动。

[0042] 请继续参考图1E，醣类材料1112和未与第一抗体1111、第二抗体1112以及待测物质1101结合留置在第二流体区112之中的过氧化物酶1113会流至第三流体区113。此时，醣类材料1112会与已经存在于第三流体区113之中的醣氧化酶1133进行氧化反应，产生出过氧化氢，而产生出的过氧化氢以及发光剂1131会受到流至第三流体区113的过氧化物酶1113进行催化，产生光学信号。此时，可通过侦测光学信号的强度，推算出参与反应的酵素浓度，亦即可通过侦测光学信号的强度推算出有多少过氧化物酶1113流至第三流体区113，且由于在制作流体检测试片1之时，要添加的过氧化物酶1113含量是为已知的固定值，所以留置于第二流体区112之中的过氧化物酶1113其浓度亦可通过两者简单相减后推算得知。最后，利用已知的留置于第二流体区112之中的过氧化物酶1113的浓度，可再推算出流体中所含有的待测物质1101的浓度，以达到定量检测的目的。

[0043] 在未反应前，第一抗体1111与过氧化物酶1113两者的结合型态可以是直接形成共轭结合(conjugation)；或是第一抗体1111上共轭结合有生物素(Biotin)，而过氧化物酶1113则与亲和素(Avidin)共轭结合，利用生物素与亲和素会强力结合成错合物(AB complex)的特性，使得在进行反应时，当有第一抗体1111留置于第二流体区112时，也会将部分的过氧化物酶1113固定留置于第二流体区112。上述的亲合素可以是卵白素(Avidin)、链霉亲合素(Streptavidin)，或是中性链亲和素(NeutrAvidin)。

[0044] 请继续参考图1F至图1H，为本发明第一较佳实施例流体检测试片流道中反应材料其它方式分布示意图。为达成本发明的定量检测的目的，流体检测试片1中醣类材料1112及过氧化物酶1113在流道11中的分布方式除如图1B所示的均存在于第一流体区111的分布方式之外，还可以分布在第二流体区112之中。

[0045] 首先，请参考图1F，第一抗体1111和过氧化酶1113位于第一流体区111中，而醣类材料1112则位于第二流体区112中，此时，第一抗体1111与过氧化物酶1113两者的结合型态方式则与上述的直接共轭结合，或是利用生物素与亲和素结合成错合物(AB complex)的特性，第一抗体1111与过氧化物酶1113各自以结合有生物素与亲和素的方式存在。流道11中其余的反应材料第二抗体1121、发光剂1131、受质反应试剂1132，及醣氧化酶1133的分布方式则与图1B中相同。采用此种分布的设置状态，在流体流过第二流体区112后，醣类材料1112一样会随着流体流至第三流体区113，所以其后的各反应阶段中反应材料的流动分布情形及所进行的反应则与图1C至图1E所示，在此不再重复赘述。

[0046] 请再参考图1G，此种分布设置下，第一抗体1111是位于第一流体区111中，而过氧化酶1113与醣类材料1112则位于第二流体区112中。而在图1H所代表的分布方式，则是第一抗体1111与醣类材料1112位于第一流体区111、过氧化酶1113则位于第二流体区112中。流道11中其余的反应材料第二抗体1121、发光剂1131、受质反应试剂1132，及醣氧化酶1133的分布方式则与图1B中相同，且其后的各反应阶段中反应材料的流动分布情形及所进行的反应则与图1C至图1E所示，在此不再重复赘述。

[0047] 请继续参考图1I，为图1A沿AA联机的剖面示意图。如图所示，在第一流体区111的底部包含有纤维层1110，而第一抗体(1111，图1B)是形成于纤维层1110之中，如此使得在流体注入第一流体区111之后，第一抗体(1111，图1B)会随流体一起流至第二流体区112。而在第二流体区112与第三流体区113的底部各自具有第二硝化纤维层1120与第三硝化纤维层1130。第二抗体(1121，图1B)是固定于第二硝化纤维层1120之中，而受质反应试剂(1132，图1B)是形成于第三硝化纤维层1130中。

[0048] 上述的第二硝化纤维层1120与第三硝化纤维层1130可以是以一层硝化纤维膜(NC membrane)的形式铺设在第二流体区112以及第三流体区113的底部。

[0049] 另一种较佳的制作形式，则可以将硝化纤维溶液以浇注(casting)的方式，浇注在第二流体区112以及第三流体区113的底部，再经过风干或是冷冻干燥的步骤，藉此各自形成具有中空网状构型的第二硝化纤维层1120与第三硝化纤维层1130。此外，为了降低流道与流体之间的毛细作用所造成的影响，此种以浇注方式所制成的流道并非已知的技术所谓的微流道，且第二流体区112与第三流体区113的最小宽度较佳为0.3mm，而基板10则可采用生物兼容材料。为达较佳的浇注效果，流道11的表面粗糙度较佳范围(Ra值)在3微米至50微米之间，而第二硝化纤维层1120的平均厚度等于第三硝化纤维层1130厚度。此外，流道11可进一步包括第四流体区(未图示)，第四流体区的底部亦形成有硝化纤维层，供多余流体的贮存，且此硝化纤维层具有中空网状构型。

[0050] 上述的硝化纤维溶液是将硝化纤维粉末与包含有酯类及酮类溶剂混合后制成，而硝化纤维粉末与酯类及酮类溶剂所混合的较佳体积比例为1∶9。并且，在此种以浇注方式形成硝化纤维层的状态下，可在第二硝化纤维层1120与第三硝化纤维层1130干燥后，将第二抗体1121以溶液的方式注入第二硝化纤维层1120，再经过风干或冷冻干燥的过程，使第二抗体1121以粉末状的方式留存于第二硝化纤维层1120之中。

[0051] 除上述先形成硝化纤维层于流体区底部后再将第二抗体1121及受质反应试剂形成于其中的方式之外，还可将第二抗体1121以溶液的方式注入预先制备好的硝化纤维溶液，混合均匀后，再浇注于第二流体区112的底部，再经风干或冷冻干燥过程，同时将硝化纤维溶液形成第二硝化纤维层1120及第二抗体1121以粉末状的方式留存其中。

[0052] 此外，受质反应试剂1132形成于第三硝化纤维层1130中的方式亦与上述第二抗体1121形成于第二硝化纤维层1120的方式大致相同，可采用先形成第三硝化纤维层1130后再注入受质反应试剂并干燥，或是与硝化纤维溶液混合后一同注入第三流体区113底部干燥成型的两种方式，故在此不再重复赘述。

[0053] 除上述的第一较佳实施例之外，本发明亦提供一种流体检测方法，如下的第二较佳实施例中所述，其中检测方法中所采用的检测试片，其构造特征与第一较佳实施例中大致相同，故不再重复赘述，且其中提及的检测试片组件编号，请参考图1B至图1H。

[0054] 请参考图2，为本发明第二较佳实施例流体检测方法的流程示意图。流体检测方法2包含以下步骤：

[0055] 步骤21：提供流体，流体包含有待测物质1101，请参考图1B。

[0056] 步骤22：提供基板10，基板10包含至少有流道11。流道11包含依序连接的第一流体区111、第二流体区112与第三流体区113，第一流体区111是供流体的注入。第一流体区111中具有第一抗体1111。第二抗体区112中具有第二抗体1121，且第二抗体1121是固定在第二抗体区112之中。并且，第一抗体1111与第二抗体1121都是辨识流体中的同一种待测物质1101，但是第一抗体1111与第二抗体1121是各自辨识待测物质1101上不同的抗原决定位置。所以在第一抗体1111和第二抗体1121的选用上，两者均可为单株抗体或多株抗体，只需要第一抗体1111和第二抗体1121是一组抗体配对，在进行抗原辨识时，不致发生互相干扰的状况即可。第三流体区113之中则具有发光剂1131与受质反应试剂1132，受质反应试剂1132包含有醣氧化酶1133。其中，过氧化物酶1113可以是辣根过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶或是过氧化氢酶。在较佳的实施状态中，发光剂1131是用3-氨基邻苯二甲酰肼，而醣类材料1112则可为葡萄糖，于此同时，醣氧化酶1133则是选用葡萄糖氧化酶。此外，醣类材料1112及过氧化物酶1113在流道11的各种分布情形，则如第一较佳实施例中所述(请参考图1B、图1F、图1G及图1H)。

[0057] 步骤23：将流体加至流道11的第一流体区111。流体会沿着流道11依序由第一流体区111流经第二流体区112，流至第三流体区113，并藉使存在于流道11中的第一抗体1111、醣类材料1112及过氧化物酶1113随着流体流动。

[0058] 步骤24：待测物质1101会随流体流至第二流体区112，使待测物质1101与第一抗体1111、第二抗体1121及部分的过氧化物酶1113结合并一同留置于第二流体区112中。流体继续带着醣类材料1112、未结合的第一抗体1111及过氧化物酶1113流至第三流体区
113。在第三流体区中醣类材料1112受到醣氧化酶1133的催化进行氧化反应，并产生出过氧化氢。而发光剂1131会受到流至第三流体区113的过氧化物酶1113催化与过氧化氢进行反应，并产生光学信号。

[0059] 步骤25：侦测由步骤24产生的光学信号。此时，可通过侦测光学信号的强度，推算出参与反应的酵素浓度，亦即可通过侦测光学信号的强度推算出有多少过氧化物酶1113流至第三流体区113，且由于在制作流体检测试片1之时，要添加的过氧化物酶1113含量是为已知的固定值，所以留置于第二流体区112之中的过氧化物酶1113其浓度亦可通过两者简单相减后推算得知。最后，利用已知的留置于第二流体区112之中的过氧化物酶1113的浓度，可再推算出流体中所含有的待测物质1101的浓度，以达到定量检测的目的。

[0060] 此外，根据本发明的流体检测方法，其中第一抗体1111与过氧化物酶1113的结合方式与较佳选用种类、各流体区的构造组成、硝化纤维层的构型、形成方式、使用的硝化纤维溶液的成份与较佳比例、各项反应材料的组成及形成方式，均与前述的第一较佳实施例相同，在此不再重复赘述。

[0061] 以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并非用以限定本发明申请专利权利；同时以上的描述对于熟知本技术领域的专门人士应可明了与实施，因此其它未脱离本发明所揭示的精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含于下述的申请专利范围。