一种海葵溶细胞素及其应用

摘要

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种海葵溶细胞素的编码基因、氨基酸序列及其应用。海葵溶细胞素(actinoporin)是一类分子量在20KD左右，对膜上鞘磷脂有特异性偏好的一类的蛋白家族，具有十分广泛的生理活性，包括心肌毒性、溶细胞作用、引起肺水肿、抗菌、抗肿瘤等。本发明目的是提供一种新的海葵溶细胞素，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的海葵溶细胞素有很强的溶血活性和鞘磷脂酶的活性。

权利要求

1.一种海葵溶细胞素，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种海葵溶细胞素，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1或2所述的海葵溶细胞素在制备溶血药物或抗肿瘤药物中的应用。

说明书

一种海葵溶细胞素及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种海葵溶细胞素的编码基因、氨基酸序列及其应用。

背景技术

[0002] 海洋生物中，很多可以产生毒素，如海蛇、水母、海葵、芋螺等。这些毒素性质独特，具有广泛的神经系统活性、心血管系统活性和细胞活性等多种生物学活性，在生物医学、分子生物学以及药学的研究和应用方面有广阔的前景。

[0003] 海葵的触手及身体均含有大量的刺细胞，每个刺细胞里都有一个特殊囊状的细胞器，名为刺丝囊，内储存着毒液，刺丝管盘曲在刺丝囊内，刺丝尖端为刺针，当受到机械或化学刺激时，会释放刺丝刺入猎物身体并通过刺丝管将毒素注入猎物体内。对海葵毒素的研究自20世纪70年代开始，目前已经从约40种海葵中分离到超过300种毒素，根据分子量以及生物学功能的不同，可以分为海葵溶细胞毒素以及海葵多肽类神经毒素两大类。

[0004] 海葵溶细胞素(actinoporin)是一类分子量在20KD左右，对膜上鞘磷脂有特异性偏好的一类的蛋白家族。目前，已经从20多种海葵中分离鉴定了30多种溶细胞素。从海葵Actinia equina中分离的Equinatoxin-2和从海葵Stichodactylahelianthus中分离的Sticholysins-2是目前研究的最深入的两种actinoporin。它们的氨基酸序列已测定，并且作了基因克隆、表达和功能研究以及晶体结构的测定(Lanio，M.E.，Morera，V.，Alvarez，C.，Tejuca，M.，Gomez，T.，Pazos，F.，Besada，V.，Martinez，D.，Huerta，V.，Padron，G.，de los Angeles Chavez，M.，2001.Purificationand characterization of two hemolysins from Stichodactyla helianthus.Toxicon 39，187-194；Macek，P.，Lebez，D.，1988.Isolation and characterization of three lethaland hemolytic toxins from the sea anemone Actinia equina L.Toxicon 26，441-451.)。

[0005] 海葵溶细胞素是研究真核生物成孔类毒素与膜相互作用的最常用的模式蛋白。目前研究认为膜孔形成的机制过程如下：毒素的正电荷与磷脂双分子层表面的负电荷相互吸引而靠近，为可逆过程；然后，可变换构象的N端双亲性螺旋区插入膜内，一定浓度的毒素蛋白聚合形成三或四聚体形成阳离子通道，该过程为不可逆过程。

[0006] 海葵溶细胞素具有十分广泛的生理活性，包括心肌毒性、溶细胞作用、引起肺水肿、抗菌、抗肿瘤等，其中最典型的是在细胞膜上形成穿孔，使细胞破碎、溶解，在抗菌、杀虫、抗肿瘤方面有应用价值。Sticholysins-2对红细胞的半数溶解浓度为30ng/ml。对老鼠离体心脏的研究表明，Equinatoxin-2降低左心室血压，引起心律失常以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放，最终导致心力衰竭(Bunc，M.，Drevensek，G.，Budihna，M.，Suput，D.，1999.Effects of equinatoxin II from Actiniaequina(L.)on isolated rat heart：the role of direct cardiotoxic effects in equinatoxin IIlethality.Toxicon 37，109-123.)。

[0007] 随着对海洋资源的日益关注，新发现的海葵溶细胞素会不断增多，对海葵溶细胞素的结构和功能研究也将不断深入。对海葵神经毒素广泛而深入的研究有助于合理而充分的利用我国丰富的海葵资源，为新药研制以及海葵蛰伤的救治措施都具有重要意义。

发明内容

[0008] 本发明目的是提供一种新的海葵溶细胞素编码基因、氨基酸序列，载体，以及在制药中的应用。

[0009] 本发明中所用海葵为地毯海葵(Heteractis magnifica)，采自南海海域。其形态特征如下：地毯海葵，又称巨大异辐海葵，柱体为红色，触手呈褐色。触手自基部到末端的直径相当，呈直筒状。整株海葵的直径为1m左右。

[0010] 经过对该地毯海葵的触手进行蛋白质分离，获得了分子量约19KD的溶细胞毒素Cytolysin-4，对Cytolysin-4进行N端测序，得到N端的20个氨基酸序列。在此基础上，设计引物，从海葵触手总RNA中扩增Cytolysin-4的cDNA序列，获得了Cytolysin-4的cDNA全长序列，其cDNA全长为629bp，将序列递交Genbank进行同源序列比对，结果显示与已报道的海葵溶细胞素核酸序列不完全相同，是一个新的毒素蛋白。CLUSTLW氨基酸序列比对结果表明，Cytolysin-4与已报道的海葵溶细胞素Cytolysin-3、RTX-A、Sticholysin-1和Sticholysin-2，有较高的同源性，相似性分别为90％、88％、83％、87％。

[0011] 本发明提供了一种海葵溶细胞素Cytolysin-4的编码基因，其核苷酸序列如下：

[0012] CTCATCGTCTTATTTCTGATCGTTACCATGATATGTGCGACCATCGCTGTGCC

[0013] ATCTGGAAAGGAATTCCAAGGCAGAAAAGAGGACAAGAAGAGTGCAGCA

[0014] CTCGCTGGCACAATTATCGAAGGGGCAAGTCTAGGTTTCCAAATCCTTGAC

[0015] AAAGTACTCACAGAACTTGGTAAAGTGTCTCGGAAGATTGCTATCGGTATC

[0016] GACAACGAGTCAGGAGGGTCATGGACAGCAATGAATGCATATTTCCGTTCT

[0017] GGTACTACAGACGTCATTCTACCAGAGTTTGTCCCAAACCAAAAAGCGCTA

[0018] CTCTACAGCGGTCGGAAGGACACAGGCCCTGTTGCAACGGGCGCTGTGGG

[0019] TGCCCTTGCCTATTACATGAGCGATGGAAACACTCTTGCCGTTATGTTCAGC

[0020] GTTCCCTTTGACTACAACCTGTACAGCAACTGGTGGGATGTCAGAGTCTAT

[0021] AGTGGGAAGAGGAGAGCCGACCAAAAGATGTACGAAGACCTCTATAATGG

[0022] CTCTCCATTTCGAGGGGACAATGGATGGCACCAGAAGAATCTTGGATATGG

[0023] ACTGAGGATGAAGGGAATCATGACAAGTGCTGGCGAAGCAAAACTGCAA

[0024] ATTAGGATTTCACGCTAATA(SEQ ID NO：1，划线部分不翻译)

[0025] 本发明还提供了一种海葵溶细胞素Cytolysin-4的氨基酸序列如下：

[0026] LIVLFLIVTMICATIAVPSGKEFQGRKEDKKSAALAGTIIEGASLGFQILDKVLT

[0027] ELGKVSRKIAIGIDNESGGSWTAMNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALLYSGRK

[0028] DTGPVATGAVGALAYYMSDGNTLAVMFSVPFDYNLYSNWWDVRVYSGKRR

[0029] ADQKMYEDLYNGSPFRGDNGWHQKNLGYGLRMKGIMTSAGEAKLQIRISR

[0030] (SEQ ID NO：2，划线部分为成熟蛋白)

[0031] 本发明还提供了海葵溶细胞素Cytolysin-4在制备治疗海葵蛰伤药物、溶血药物、抗肿瘤药物中的应用。

[0032] 本发明通过对海葵溶细胞素Cytolysin-4的性质研究，发现其有很强的溶血活性，且具有鞘磷脂酶的活性，可以特异性地水解各种细胞膜及脂质体上的鞘磷脂。

[0033] 本发明提供了一种新的溶细胞毒素蛋白Cytolysin-4的序列信息及作用机制，可为治疗海葵蛰伤提供新的思路，同时，Cytolysin-4能特异性地水解细胞膜上的鞘磷脂从而破坏细胞膜的完整性，可辅助药物的穿膜吸收，有可能在肿瘤治疗中发挥一定的作用。

附图说明

[0034] 图1是本发明的海葵溶细胞素Cytolysin-4的鞘磷脂酶活性实验结果。

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

[0036] 实施例1：海葵溶细胞素Cytolysin-4的分离纯化

[0037] 取地毯海葵(采自南海海域，北纬17.3°N，东经113°E)触手组织5g剪碎，加入20ml冷的去离子水匀浆，15000rpm离心20分钟去除残渣。0.45μm的滤器过滤即得到海葵毒素的粗毒，保存于-75℃。取1ml粗毒样品上HitrapCapto S阳离子交换柱，该柱预先用0.05mol/L的醋酸铵缓冲液(pH 5.5)平衡。上样完毕后用0％，11％，21％，30％和100％1mol/L氯化钠缓冲液(含0.05mol/L的醋酸铵，pH 5.5)梯度洗脱，每个梯度洗脱时间为5min，流速为1ml/min。收集洗脱时间为11-14min的组分并冷冻干燥。将冻干样品用
0.15mol/L醋酸铵缓冲液(pH 5.5)复溶，取2ml过HiLoad 16/60Superdex 75prep grade凝胶层析柱，以同样的缓冲液平衡和洗脱，流速为1ml/min。收集洗脱体积为83-88ml的组分并冷冻干燥，即得到Cytolysin-4的纯品，将Cytolysin-4保存在-75℃。另取少量进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，显示其分子量约为19KD。

[0038] 实施例2：地毯海葵触手总RNA提取和cDNA合成

[0039] 准备无RNA酶的器具，地毯海葵触手总RNA的提取按照TaKaRa公司RNAiso Plus的说明书操作；cDNA合成按照Fermentas RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit的说明书操作。提取的总RNA经电泳检测可见18S和28S两条带，说明总RNA的完整性较好。

[0040] 实施例3：Cytolysin-4基因的克隆、序列测定和分析

[0041] 根据与Cytolysin-4同源性较高的海葵溶细胞素Hmg III的CDS序列设计两条引物，

[0042] 上游引物为：5’CGTCTCATCGTCTTATTT 3’(SEQ ID NO：3)；

[0043] 下游引物为：5’TGTCTTCTTATTAGCGTG 3’(SEQ ID NO：4)。

[0044] 以实施例2得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，琼脂糖电泳检测，在630bp附近有特异性扩增条带。回收此条带送至上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)进行核酸序列测定，得到的序列进行blast同源分析，结果显示与已报道的海葵溶细胞素核酸序列不完全相同，是一种新的毒素蛋白。CLUSTLW氨基酸序列比对结果表明，Cytolysin-4与已报道的海葵溶细胞素Cytolysin-3、RTX-A、Sticholysin-1和Sticholysin-2，有较高的同源性，相似性分别为90％、88％、83％、87％。

[0045] 实施例4：本发明的海葵溶细胞素Cytolysin-4的溶血活性

[0046] 将成熟人血用PBS漂洗几次至上清清亮，弃上清。红细胞与PBS按1∶50稀释，反应总体积1.5ml，其中红细胞悬液0.5ml，PBS与Cytolysin-4共1ml。每组另设阴性对照(不加毒素)、阳性对照(0.5％Triton X-100)。加样后37℃振荡30min，然后3000×g离心5min，取上清检测420nm吸光度值，重复3次，计算溶血分数。

[0047] 溶血分数＝[(样品管吸光度值-阴性对照管吸光度值)/阳性对照管吸光度值]×100％。

[0048] 结果表明Cytolysin-4的浓度为40ng/ml时，即可引起50％的红细胞溶血，说明该溶细胞素具有很强的溶血活性。其溶血活性与来自海葵Stichodactylahelianthus中分离的Sticholysins-1和Sticholysins-2基本一致，它们引起50％的红细胞溶血的浓度约是30-45ng/ml。

[0049] 实施例5：本发明的海葵溶细胞素Cytolysin-4的鞘磷脂酶活性

[0050] TNPAL-sphingomyelin(三硝基苯氨基月桂酰基鞘磷脂，购自Sigma公司)是人工合成的带有显色基团的鞘磷脂衍生物，是鞘磷脂酶的特异性底物。该底物与鞘磷脂酶反应后，水解产生TNPAL显色基团，该基团在330nm处有吸收值。将不同浓度(0.15μg、0.3μg、0.6μg、1.2μg、2.4μg)的Cytolysin-4与TNPAL-sphingomyelin在37℃反应2min，然后终止反应，在330nm检测吸光度值。阳性对照是商品化的来自金黄色葡萄球菌的鞘磷脂酶。
结果表明0.3μg的Cytolysin-4就能水解3nmol的底物，表现出了比较显著的鞘磷脂酶活性，如图1所示。