一种粉红粘帚霉菌厚垣孢子及其可湿性粉剂的生产方法

摘要

本发明提供了一种粉红粘帚霉菌厚垣孢子及其可湿性粉剂的生产方法，属生物农药技术领域。采用固态发酵方法，通过调控发酵温度和供氧量产生粉红粘帚霉厚垣孢子，将长有厚垣孢子的培养料干燥后直接粉碎并加入相应助剂制成可湿性粉剂。本发明的目的是提供一种低成本、大规模生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法，以克服分生孢子存活期短，货架期短的问题，保证粉红粘帚霉孢子在生产和应用中的生物活性和防治效果。同时克服现有粉红粘帚霉孢子制剂制备工艺中孢子回收率低的难题，并提供一种低成本、操作简单的粉红粘帚霉孢子可湿性粉剂制备方法。本发明的粉红粘帚霉菌厚垣孢子及其可湿性粉剂可用于防治多种蔬菜病害，包括灰霉病及种子传播病害和土传病。

权利要求

1.一种粉红粘帚霉菌厚垣孢子的生产方法，其特征在于，粉红粘帚霉厚垣孢子是通过固态发酵方法生产，通过调控发酵温度和供氧量产生厚垣孢子;固态发酵在一种顶部、底部均透光、透气的固体反应器中进行，该反应器的透气量即供氧量可以根据需要调控, 反应器固体料层下面用带孔塑料膜铺垫，置于透明塑料网上，塑料网由框架支撑；料层上面用带孔塑料膜盖住，即料层处于带孔塑料膜包裹之中，塑料膜上的开孔率为0.1－5％，改变塑料膜的开孔率可以调控料层的供氧量，开孔率是塑料膜的开孔面积与塑料膜面积的比率；带孔塑料膜可以有效减少水分散发，同时，也大幅度减少了染菌风险；用塑料膜铺垫的料层放在纱网支架上，顶部、底部均是透气并透光的；反应器有多个这样的料层组成，每层上、下面均可光照；

发酵第一阶段，温度控制在24－26℃，塑料膜开孔率为2－4％，黑暗培养12小时，光照培养3－5天，菌丝生长丰满；第二阶段，温度控制在18－20℃或者28-30℃，塑料膜开孔率改为0.1－1％，光照培养3－5天;固态发酵培养基各组成成份和质量百分比为麦麸20－30％，玉米粉4－6％，余量为蒸馏水；

所述粉红粘帚霉菌厚垣孢子，可以制成可湿性粉剂，其制备方法是通过将长有粉红粘帚霉厚垣孢子的培养料干燥后直接粉碎并加入相应助剂制成。

说明书

一种粉红粘帚霉菌厚垣孢子及其可湿性粉剂的生产方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物农药技术领域，具体地说本发明涉及一种粉红粘帚霉菌厚垣孢子及其可湿性粉剂的生产方法。

背景技术

[0002] 我国是一个农业大国，每年农作物病虫草害受害面积大约2亿公顷（次），每年需要生产和使用农药约25万吨（有效成份）。大量使用化学农药使我国成为世界上农药污染最严重的国家之一，食品中农药检出率高达90％以上，农田环境和食品安全令人堪忧。随着无害化农业的发展和社会要求的变化，近年来利用活体生物作为农药的趋势越来越高，世界各发达国家正在积极开发以细菌、真菌等微生物为有效成份的生物农药。生物农药顺应了无公害绿色农产品的发展趋势，可减轻农产品生产中因化学农药造成的食品污染和环境污染，对于促进我国农产品生产的可持续发展意义重大。在防治植物病害的生物农药中，微生物真菌制剂扮演重要角色。其中，粘帚霉（Gliocladium spp．）被认为是目前己发现的拮抗微生物中最有希望的植病生防因子之一，可用来防治多种植物病害。粘帚霉是一种土壤习居菌，广泛存在于各种土壤生态环境中。常见的粘帚霉属种类有粉红粘帚霉(G.roseum)、链孢粘帚霉(G catenulatum)和绿粘帚霉(G virens)等，对植物病害表现出良好的防治效果。粉红粘帚霉孢子对人、畜无毒无害，可防治多种蔬菜病害，包括灰霉病及种子传播病害和土传病，不但防治效果好，还具有植物促生作用，且可以与几种化学杀真菌剂共用，有协同效果，这是非常珍贵的特性，使其在市场竞争中具有较大优势，是一种很有开发利用价值的生防菌种。

[0003] 但是，粉红粘帚霉作为生物农药直接用于生产以及菌剂的保质期等方面还存在着一些问题。目前已商品化的粉红粘帚霉制剂多为活分生孢子制剂，尽管分生孢子产孢量大，但存活期较短，通常一年的贮藏期后有70％的孢子失去活力，难以满足粘帚霉作为生物农药制剂的要求。粘帚霉在其生长周期内除了产生菌丝体和分生孢子外，还可以产生厚垣孢子。厚垣孢子是菌体作为抵抗不良环境而休眠的生存结构，具有更容易大规模生产、存活时间长、容易贮藏、施用和商品化及货架寿命长等优点，能满足作为生物农药的要求，在土壤中的增殖比分生孢子更好，并且萌发率也更高。

[0004] 中国专利（申请号200710195587.6，公开号CN101451107A）公开了一种大量制备粘帚霉厚垣孢子的方法，以葡萄糖、豆饼粉、尿素等为培养基主要成份，采用液体发酵培养粘帚霉。该专利采用葡萄糖为碳源，成本较高，不适合大规模工业化生产，同时该专利未说明发酵液孢子产量具体数值，因此无法判断孢子产量。一般的，液体发酵的成本远高于固体发酵，甚至高出50％以上，所以，采用固体发酵将大幅度降低生产成本。

[0005] 中国专利（申请号200910072862.4，公开号CN101643705A）公开了一种抑制番茄灰霉病的粉红粘帚霉菌株WY-1，产生分生孢子。上述粘帚霉菌株及其孢子生产方法均不能满足生产和应用中对孢子的生物活性和防治效果的需求。因此，建立一种低成本、大量生产粉红粘帚霉厚垣孢子的生产方法对推动粉红粘帚霉生防剂的工业应用具有重要意义。目前粉红粘帚霉生防制剂，绝大多数是采用活体，包括菌丝体、分生孢子、厚垣孢子，即以活体农药为主，按一定比例加入各种助剂加工制备而成。由于生产可湿性粉剂要求物料颗粒很细，这是与其他制剂不同的，所以，现有的生产孢子粉可湿性粉剂的方法，是发酵培养结束后，先从发酵培养基中回收孢子，然后再加入各种助剂，混合后制成可湿性粉剂。然而，现有的孢子回收方法孢子回收率较低，甚至低于50％，显著增加了成本，不利于孢子可湿性粉剂的大规模制备。因此，解决孢子回收率低的难题是大幅度降低活孢子制剂生产成本的关键。

[0006] 综上所述，建立一种低成本，大规模生产粉红粘帚霉厚垣孢子，同时建立一种低成本、操作简单可实现活孢子高回收的粉红粘帚霉孢子可湿性粉剂生产工艺具有重要意义，可以解决人们一直渴望解决、但至今尚未成功解决的难题。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种低成本、大规模生产粉红粘帚霉厚垣孢子的方法，以克服分生孢子存活期短，货架期短的问题，保证粉红粘帚霉孢子在生产和应用中的生物活性和防治效果。同时克服现有粉红粘帚霉孢子制剂制备工艺中孢子回收率低的难题，并提供一种低成本、操作简单的粉红粘帚霉孢子可湿性粉剂的制备方法。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 粉红粘帚霉菌厚垣孢子通过固态发酵方式获得，固态发酵培养基各组成成份和质量百分比为麦麸20－30％，玉米粉4－6％，余量为蒸馏水。在发酵中控制温度和供氧量，以改变菌丝体、孢子的生长状态，从而产生厚垣孢子。固态发酵过程中温度控制在17－30℃。

[0010] 固态发酵采用本发明提出的一种新的顶部、底部均透光、透气的低成本固体反应器，该反应器的透气量即供氧量可以根据需要调控。

[0011] 与现有的固体发酵反应器不同之处在于：该反应器固体料层下面用带孔塑料膜铺垫，置于透明塑料网上，塑料网由框架支撑；料层上面用带孔塑料膜盖住，即料层处于带孔塑料膜包裹之中，可以有效减少水分散发，同时，也大幅度减少了染菌风险。用塑料膜铺垫的料层放在纱网支架上，顶部、底部均是透气并透光的。反应器有多个这样的料层组成，每层上、下面均可光照。一般传统的固体发酵反应器，底部是不透光的。因为粉红粘帚霉孢子生长中，在一定的生长阶段，需要光照，采用底部可透光的设计，可增加约1倍的孢子生长面，即料层上、下两面均可生长孢子。所以，本发明提出的固体发酵反应器，较传统的固体发酵反应器有明显的优势。如传统的固定床式反应器，床层是透气的，但是，相对床层很厚，而孢子只能在表层生长，所以料层底部的原料浪费了。又如盘式反应器，其底部一般不透光，因此，料层下面没有孢子生长，有一半面积浪费了。实际上，固体发酵大多要生长气生菌丝，采用顶部、底部均透光透气的反应器，即可增加1倍的生长面，可有效提高产率。所以，本发明提出的反应器，不仅可有效提高孢子产率，也可提高其它产品固体发酵的产率，具有普遍2
意义。本发明所用反应器框架由4层构成，每层的尺寸为2000×400mm，按料层厚度25mm计，每层料层培养基约10kg。实际操作时，反应器层数和每层的尺寸可根据需要而定。

[0012] 根据发酵过程的需要，可以调控反应器的供氧量。用于固体料层的底部和上面的塑料膜是带孔塑料膜，其开孔率可以根据供氧量大小而改变，开孔率为塑料膜的孔面积与塑料膜面积之比。开孔率可以在0.1－5％范围内变化，从而大幅度改变供氧量。

[0013] 首先，发酵的第一阶段，让菌丝在适宜的温度和供氧量下生长，当菌丝已经生长到足够多时，改变温度和供氧量，进入发酵的第二阶段，使温度和供氧量对粉红粘帚霉处于不利状态，作为对不利生长环境的反应，将开始大量生长厚垣孢子。第一阶段的温度为24-26℃，塑料膜开孔率为2－4％，粉红粘帚霉处于正常生长状态；第二阶段温度改为18－20℃或者28-30℃，这种温度范围对粉红粘帚霉正常生长是不利的。塑料膜开孔率改为0.1-1％，即用开孔率为0.1-1％塑料膜覆盖或垫衬在第一阶段的塑料膜上，此时供氧量大幅度减少，迫使粉红粘帚霉处于不利生长状态。由于此时温度和供氧量均不利于粉红粘帚霉菌丝正常生长，菌丝开始大量生长厚垣孢子。

[0014] 发酵结束后，收集长满粉红粘帚霉厚垣孢子的培养基，于30－35℃下，干燥12-24小时后取样，测其含水率。当含水率达到4－6%时，干燥完毕。干燥的含孢子的培养料经8
低温气流粉碎，温度为5－10℃，制成粉红粘帚霉孢子粉，孢子粉孢子含量为5－9×10 个/g，活孢率大于98％。

[0015] 粉红粘帚霉菌厚垣孢子可湿性粉剂各组成成份和质量百分比为：粉红粘帚霉孢子粉9－15％，硅藻土80－90％，壬基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物2－4％，壬基酚聚氧乙烯醚　2－4％，抗坏血酸0.1－0.5％。

[0016] 本发明的一种粉红粘帚霉菌厚垣孢子生产方法及其可湿性粉剂的制备方法，它具有以下优点：

[0017] （1）以廉价易得的麦麸、玉米粉为固体培养基，无需添加辅助碳源、氮源，无需发酵罐，采用固态发酵方式生产，成本大大降低；特别是，麦麸和玉米粉均可以粉碎至通过325目筛，直接用于制备可湿性粉剂。粉碎的麦麸、玉米粉还可在粉剂施用时为孢子提供营养，而营养对孢子萌发有重要作用；

[0018] （2）本发明采用温度和供氧量调控粉红粘帚霉厚垣孢子生长，生产成本低，易大规模生产，所产厚垣孢子存活时间长、容易贮藏、施用和商品化及货架寿命长；

[0019] （3） 本发明的粉红粘帚霉菌产厚垣孢子可湿性粉剂的制备过程中，省去了传统的孢子原粉回收工序，直接将长满粉红粘帚霉厚垣孢子的培养基经烘干、粉碎后，加入各种助剂，混合制成可湿性粉，工艺简单，避免了孢子回收过程中孢子的大量损失，简化了生产工艺，大大降低了孢子制剂的生产成本，满足工业大规模生产的需求。

具体实施方式

[0020] 以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

[0021] 实施例1　固态发酵生产粉红粘帚霉厚垣孢子

[0022] 将粉红粘帚霉菌株接种到PDA平板上，24℃培养7天，产生大量粉红色孢子。转移6
至摇瓶培养3天，再次转移至20升种子罐，培养3天。用无菌水调整孢子浓度至10 个孢子/ml。以此孢子悬液作为液体种子。将制作好的液体种子孢悬液接种到已灭菌的固态发酵培养基（麦麸30％，玉米粉4％，余量为蒸馏水）后，发酵第一阶段，温度为25℃、塑料膜开孔率2.5％，先黑暗培养12小时，再光照培养4天，菌丝生长丰满。第二阶段，温度为20℃、塑料膜开孔率0.3％，光照培养4天，孢子长满培养基，取样测定产孢量，结果，此条件下产
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孢量达到6.84×10 个/g干培养基。

[0023] 实施例2　粉红粘帚霉厚垣孢子可湿性粉剂的制备