本发明提供了一种基于局域表面等离子体共振(LSPR)光谱检测致癌基因C-myc重组蛋白(6)的LSPR传感芯片。本发明是在LSPR传感芯片的金膜(1)表面组装上一层DTT单分子层(2)，接上金纳米粒子层(3)，在所述金纳米粒子层(3)表面修饰上3-巯基丙酸单分子层(4)，然后通过DMAP-EDC活化，使所述的3-巯基丙酸单分子层(4)与C-myc单克隆抗体(5)结合，通过C-myc单克隆抗体(5)与C-myc重组蛋白(6)的免疫反应结合，引起金纳米粒子表面产生局域表面等离子体共振吸收峰的位移，以此来检测癌变组织中C-myc重组蛋白(6)的含量。本发明的效果和益处在于所述LSPR传感芯片具有组装简便、定量快速、可实现多通道检测，且灵敏度高、选择性和重现性好，优于传统的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
1.一种用于检测致癌基因C-myc重组蛋白(6)的LSPR传感芯片，其特征在于所述LSPR传感芯片的组装结构自聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面到最外层依次为：厚度均匀的金膜(1)、DTT单分子层(2)、金纳米粒子层(3)、3-巯基丙酸单分子层(4)、C-myc单克隆抗体(5)。
2.根据权利要求1所述的LSPR传感芯片，其特征在于所述LSPR传感芯片的制备过程如下：
1)采用磁控溅射镀膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面镀上一层金膜(1)，-3通过控制镀膜真空度≤1.0×10 Pa， 使所述金膜(1)表面平整光滑；
2)将Piranha溶液滴加在上述金膜(1)表面浸润5～30s，取出后用二次蒸馏水反复冲洗3次；其中，Piranha溶液为浓硫酸∶双氧水＝7∶3的溶液；
3)将上述步骤处理的金膜(1)依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声5～600s；
4)将上述步骤处理的金膜(1)浸入10～200mmol/L的1，4-二硫苏糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1～24h，形成DTT单分子层(2)，用无水乙醇反复冲洗3次以去除表面游离的DTT，再用二次蒸馏水反复冲洗干净；
5)将上述步骤处理的金膜(1)浸入纳米金溶胶溶液中，放置1～24h，取出后用二次蒸馏水反复冲洗干净，这样金纳米粒子通过Au-S键固定在上述步骤处理的金膜(1)表面形成金纳米粒子层(3)，然后保存于二次蒸馏水中备用；
6)将上述步骤处理的金膜(1)浸入0.1～100mmol/L的3-巯基丙酸中，静置1～24h，在金纳米粒子层(3)上形成3-巯基丙酸单分子层(4)；
7)用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加1～200mmol/L DMAP-EDC的乙醇溶液于上述步骤处理的金膜(1)上活化1～30min，再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；其中，DMAP为
4-二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；
8)在上述步骤处理的金膜(1)上滴加0～2.6μg/mL C-myc单克隆抗体水溶液，反应
3～600min后，再用二次蒸馏水冲洗干净，保存于4℃环境中备用，即得C-myc单克隆抗体(5)修饰的LSPR传感芯片。
3.根据权利要求1所述的LSPR传感芯片，其特征在于所述LSPR传感芯片的检测方法是通过固定于传感芯片上的C-myc单克隆抗体(5)与C-myc重组蛋白(6)的免疫反应结合，引起芯片上金纳米粒子层(3)表面产生局域表面等离子体共振光谱吸收峰的位移，与C-myc重组蛋白(6)含量成线性响应关系。
4.根据权利要求2所述的LSPR传感芯片，其特征在于在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面所镀金膜(1)的厚度控制为30～300nm之间。
5.根据权利要求2所述的LSPR传感芯片，其特征在于所述金溶胶溶液中金纳米粒子的粒径大小在5～50nm之间。
6.根据权利要求2所述的LSPR传感芯片，其特征在于固定于LSPR传感芯片上的C-myc-1 -2单克隆抗体(5)的吸附量在0.01～0.4g·mL ·mm 之间。
7.根据权利要求3所述的LSPR传感芯片，其特征在于所述LSPR传感芯片上金纳米粒子层(3)表面所展现的局域表面等离子体共振光谱的吸收峰范围在200～700nm之间。
8.根据权利要求3所述的LSPR传感芯片，其特征在于所述LSPR传感芯片对癌变组织中C-myc重组蛋白(6)含量能进行准确测定，其回收率为92.31～109.23％，线性范围为-3
6.5×10 ～1.3μg/mL，检测下限达到6.5ng/mL。
用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的LSPR传感芯片
技术领域
[0001] 本发明属于肿瘤细胞中蛋白含量检测技术领域，涉及一种用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的传感芯片及其方法。
背景技术
[0002] C-myc是一种原癌基因，在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及细胞周期的进程中起重要作用。由C-myc基因编码的C-myc重组蛋白不仅在细胞生命活动如细胞增殖、细胞分化和细胞周期中有极其重要的作用，而且还密切地参与了细胞肿瘤的转化。C-myc重组蛋白的表达与很多癌组织和细胞肿瘤的启动及癌性程度密切相关。
[0003] 目前针对蛋白质、抗原、抗体的检测方法分别有Bradford法以及传统生物学酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，并没有专门针对C-myc重组蛋白的检测方法。而Bradford法抗干扰性、选择性不好；传统的ELISA方法仅能做到定性或半定量，上述方法操作繁琐、精度低，使其应用受到限制。因此需要寻找一种能够快速定量地检测C-myc重组蛋白的方法。本发明提供了一种基于金纳米粒子的局域表面等离子体共振(LSPR)光谱技术的生物传感检测芯片及其方法，能简便、快速、定量地检测癌变组织中C-myc重组蛋白的含量。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供了一种致癌基因C-myc重组蛋白检测用的LSPR传感芯片及其方法，其特征在于利用基于金纳米粒子表面产生的局域表面等离子体共振光谱技术实现快速、简便、定量地检测癌变组织中C-myc重组蛋白的含量，即所述LSPR传感芯片的检测方法是通过固定于传感芯片上的C-myc单克隆抗体与C-myc重组蛋白的免疫反应结合，引起芯片上金纳米粒子表面产生局域表面等离子体共振光谱吸收峰的位移，与C-myc重组蛋白含量成线性响应关系而达到检测目的。
[0005] 为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
[0006] 采用磁控溅射镀膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃表面镀上一层金膜(30～-3300nm)，通过控制镀膜真空度≤1.0×10 Pa， 使所述金膜表面平整光滑。
然后将Piranha溶液(注：Piranha溶液为浓硫酸∶双氧水＝7∶3的溶液)滴加在上述金膜表面浸润5～30s，取出用二次蒸馏水反复冲洗3次处理后，将上述金膜依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声5～600s；然后将上述金膜浸入10～200mmol/L的1，4-二硫苏糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1～24h，可在金膜表面组装上一层DTT单分子膜层；分别用无水乙醇、二次蒸馏水反复冲洗后，将上述步骤处理的金膜浸入纳米金溶胶溶液(粒径大小为5～50nm)中放置1～24h，这样金纳米粒子可通过Au-S键固定在上述步骤处理的金膜表面形成金纳米粒子层，用二次蒸馏水反复冲洗干净，并保存于二次蒸馏水中备用。
[0007] 将上述步骤处理的金膜浸入0.1～100mmol/L的3-巯基丙酸中，静置1～24h，可在金纳米粒子层表面修饰上3-巯基丙酸单分子层；用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加1～200mmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注：DMAP为4-二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)于上述步骤处理的金膜上活化1～30min，再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净。经过DMAP-EDC活化，在上述步骤处理的金膜上滴加0～2.6μg/mL C-myc单克隆抗体水溶液，反应3～600min后，使3-巯基丙酸与C-myc单克隆抗体键合，-1 -2
C-myc单克隆抗体的吸附量范围为0.01～0.4g·mL ·mm ；再用二次蒸馏水冲洗干净，保存于4℃环境中备用，即得C-myc单克隆抗体修饰的LSPR传感芯片。
[0008] 当入射光照射传感芯片，入射光子频率与金纳米粒子上的自由电子的集体振动发生共振时，导致金纳米粒子表面的局部电场被增强，反射光能量增强，从而展现出强烈的表面等离子体吸收，其局域表面等离子体共振光谱的吸收峰范围在200～700nm之间。当C-myc单克隆抗体与C-myc重组蛋白结合后，等离子体共振频率变小，共振吸收峰向长波方-3向移动，该峰位移与待测C-myc重组蛋白含量在6.5×10 ～1.3μg/mL范围内成线性响应关系，检测下限达到6.5ng/mL，可实现在线动态监测、快速定量检测致癌基因C-myc重组蛋白分子的目的。同时，所述LSPR传感芯片对癌变组织中C-myc重组蛋白含量能进行准确测定，其回收率为92.31～109.23％，在癌症疾病预测和治疗等生物医学方面具有非常重要的应用前景和经济价值。
[0009] 本发明的有益效果是，该LSPR传感芯片与传统的酶联免疫吸附测定法(ELISA)相比，灵敏度高，选择性和重现性好，且具有组装简便、定量快速、可实现多通道检测等优点。
附图说明
[0010] 图1是LSPR传感芯片敏感膜结构示意图。图2是LSPR传感芯片组装膜层直观图。
[0011] 图3是基于金纳米粒子的局域表面等离子体共振光谱检测示意图。
[0012] 图4是传感芯片的局域表面等离子共振吸收峰位移与C-myc重组蛋白浓度的对应-3关系曲线图，其在6.5×10 ～1.3μg/mL范围的标准曲线(见图4内插图)方程为：
[0013] Δλ＝-9.5075×10-5+1.9156C
[0014] 其中Δλ表示为最大吸收峰位移值(nm)，C表示C-myc重组蛋白的浓度(μg/mL)。上述关系曲线是在室温25℃时绘制的。
[0015] 图1、2中，1.厚度均匀的金膜，2.DTT自组装单分子层，3.金纳米粒子层，4.3-巯基丙酸单分子层，5.C-myc单克隆抗体，6.C-myc重组蛋白。
具体实施方式
[0016] 实施例1
[0017] LSPR传感芯片的组装制备：
[0018] 1)采用磁控溅射镀膜法在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面镀上一层100nm-4的金膜，通过控制镀膜真空度为1.0×10 Pa，镀膜速度为 使所述金膜表面平整光滑；
[0019] 2)将Piranha溶液(注：Piranha溶液为浓硫酸∶双氧水＝7∶3的溶液)滴加在上述金膜表面浸润15s，取出后用二次蒸馏水反复冲洗3次；
[0020] 3)将上述步骤处理的金膜依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声60s；
[0021] 4)将上述步骤处理的金膜浸入50mmol/L的DTT溶液中，放置10h，形成DTT单分子层，用无水乙醇反复冲洗3次以去除表面游离的DTT，再用二次蒸馏水反复冲洗干净；
[0022] 5)将上述步骤处理的金膜浸入粒径为10.5nm的纳米金溶胶中，放置24h，取出后用二次蒸馏水反复冲洗干净，这样金纳米粒子通过Au-S键固定在上述步骤处理的金膜表面形成金纳米粒子层，然后保存于二次蒸馏水中备用；
[0023] 6)将上述步骤处理的金膜浸入10mmol/L的3-巯基丙酸中，静置6h，在金纳米粒子层上形成3-巯基丙酸单分子层，然后用二次蒸馏水冲洗干净；
[0024] 7)用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加100mmol/L DMAP-EDC的乙醇溶液(注：DMAP为4-二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)于上述步骤处理的金膜上活化10min，再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
[0025] 8)在上述步骤处理的金膜上滴加2.4μg/mL C-myc单克隆抗体水溶液，反应60min后，再用二次蒸馏水冲洗干净，保存于4℃环境中备用，即制得用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的C-myc单克隆抗体修饰的LSPR传感芯片。
[0026] 实施例2
[0027] C-myc重组蛋白标准曲线的测定：
[0028] 1)所用试剂(二次蒸馏水、PBS缓冲溶液)经灭菌处理后均保存于4℃环境中备用；
[0029] 2)取1μLC-myc重组蛋白(抗原)置于1.5mL小试管中，以PBS为缓冲溶液，分别稀释1～100000倍，配制成0～6.5μg/mL的一系列溶液备用；
[0030] 3)采用上述C-myc单克隆抗体修饰的LSPR传感芯片分别测试各浓度的C-myc重组蛋白样品，通过C-myc单克隆抗体与C-myc重组蛋白的免疫反应结合，引起芯片上金纳米粒子局域表面等离子体共振光谱吸收峰红移，该峰位移与C-myc重组蛋白含量成线性响应关系；以C-myc重组蛋白的浓度C(μg/mL)为横坐标，最大吸收峰位移值Δλ(nm)为纵坐标，绘制测定C-myc重组蛋白样品浓度的标准曲线(见图4内插图)，通过C-myc对应浓度的LSPR吸收峰位移信号，即可测定出癌变组织样品中的C-myc重组蛋白的含量；
[0031] 4)测试完后，用0.1mol/L HCl溶液洗脱回复，再分别用PBS缓冲溶液、二次蒸馏水冲洗干净，可保存于4℃环境中备用。
[0032] 实施例3
[0033] 肝癌组织中C-myc重组蛋白含量的测定：
[0034] 组织中蛋白的提取：取0.1g组织标本，在4℃环境下用预冷的PBS冲洗干净除去3
组织异物。用剪刀剪成0.5mm 小块并加入配置好的1.0mL裂解液，再用PBS稀释备用。
[0035] C-myc重组蛋白含量的测定：将上述制备好的LSPR传感芯片置于PBS缓冲溶液中，先记录PBS缓冲溶液的吸收峰波长位置读数λ1＝353.47nm。取上述稀释后的样品溶液进行测定，记录吸收峰波长位置读数λ2＝354.68nm。该样品的吸收峰位移值(从，nm)可由下式得出：Δλ＝λ2-λ1，把Δλ代入到拟合好的标准曲线方程中，即可算出该肝癌组织样品中C-myc重组蛋白的浓度值为0.632μg/mL。检测结果表明肝癌组织中致癌基因C-myc高表达，与ELISA的检测结果一致，且该芯片能进行定量检测，优于ELISA方法，说明该方法能对癌变组织中的C-myc重组蛋白含量进行准确测定，具有通用性。
[0036] 实施例4
[0037] 乳腺癌细胞中C-myc重组蛋白含量检测：
[0038] 采集乳腺组织样品，在实验室进行培养，得到C-myc突变的肿瘤细胞(MDA-MB-231)。培养条件：L-15培养基，15％(胎牛或小牛)血清，5％CO2，37摄氏度温箱中培养。细胞生长状态：上皮样贴壁生长。
[0039] 取0.1g组织标本，在4℃的环境下用预冷的PBS冲洗干净除去组织异物。用剪刀3
剪成0.5mm 小块并加入配置好的1.0mL裂解液，再用PBS稀释备用。
[0040] 取上述稀释后的样品溶液，用所制备LSPR传感芯片进行测试，峰位移为0.23nm，代入到拟合好的标准曲线方程中，可以算出乳腺癌细胞稀释液中的C-myc含量为120ng/mL。检测结果表明致癌基因C-myc高表达，与ELISA的检测结果一致，且该芯片能进行定量检测，优于ELISA方法，说明该方法能对癌变组织中的C-myc重组蛋白含量进行准确测定，具有通用性。
[0041] 实施例5
[0042] 回收率的测定：
[0043] 本实施例测定LSPR传感芯片对不同浓度C-myc重组蛋白样品的回收率，并与ELISA方法比较。在已知浓度溶液中加入已知量的C-myc样品溶液，然后测定各样品的吸收峰，计算位移值Δλ，对照工作曲线找出浓度，比较测得的加入量和实际加入量，所得回收率在92.31～109.23％范围，平均回收率为100.66％，而ELISA仅能做出定性检测，说明本发明方法优于ELISA法，且回收率好，在致癌基因C-myc重组蛋白检测方面具有实际应用价值。
[0044] 实施例6
[0045] 选择性的测定：
[0046] 固定主响应C-myc重组蛋白浓度为1.08μg/mL，增大干扰物质浓度为主响应蛋白浓度100倍，即干扰蛋白浓度为108μg/mL。所考察的干扰蛋白分别为：牛血清白蛋白、猪血红蛋白、牛白蛋白、转铁蛋白、人血红蛋白、凝血酶、溶菌酶。当C-myc重组蛋白的浓度为1.08μg/mL的时候，LSPR吸收峰位移为2.07±0.07nm。当加入浓度为响应蛋白浓度100倍的干扰物时，吸收峰位置的移动偏差均在5％以内，由此可见，上述蛋白物质对C-myc单克隆抗体识别C-myc重组蛋白的过程不会产生明显的干扰影响，说明所述LSPR传感芯片对C-myc重组蛋白有很好的特异选择性。
[0047] 实施例7
[0048] 重现性的测定：
[0049] 本实施例测定LSPR传感芯片对响应不同浓度C-myc重组蛋白溶液的吸收峰位置的重现性，对650ng/mL和260ng/mL的C-myc重组蛋白样品重复测定12次，获得的相对标准偏差分别为3.22％和1.56％，说明所述LSPR传感芯片有着良好的重现性，确保了所测实验数据的准确性。
