基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法和应用，其制备步骤包括凝胶状反应底物的上盖制备与含有凝胶酶基板的底板的制备；激活以前，含有凝胶状的反应底物的上盖与含有凝胶酶基板的底板两部分是分离的，分开在4℃下冷藏；使用时，将含有凝胶状的反应底物的上盖压合在含有凝胶酶基板的底板上，使凝胶状反应底物的底物凝胶与凝胶酶基板接触激活即可；两者接触后便生酶促反应，形成一条黄色带；根据黄色带的扩散长度来判断确立其对时间温度的积累效应；根据建立的TTI的活化能与影响因素之间的关系，与所要预测的食品进行活化能匹配，就可以方便可靠的监测食品在生产、储运和销售过程中的质量状况。

权利要求

1. 一种基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法，其特征是：采用以下制备步骤：（1）、上盖、底板分别采用透明硬质或软质高分子材料制备成长方形；并分别在上盖、底板上设有槽； （2）、凝胶状反应底物的制备：在容器中加入三乙酸甘油酯，然后用质量浓度为8%的聚乙烯醇水溶液定容，用搅拌机以180～220r/min速度搅拌2min得到均匀的乳化液，取

0.3ml乳化液注入上盖的槽中，水平放置，在-20℃温度条件下冷冻16h，然后取出，并在常温下解冻6h，得到凝胶状的反应底物；

所述三乙酸甘油酯和聚乙烯醇水溶液的体积比为5:95 ~ 30:70；

（3）、酶基板的制备：取脂肪酶液、Gly-NaOH缓冲液、0.1%溴百里酚蓝酸碱指示剂、

1mol/L的CaCl2溶液、质量浓度为15%甘露糖醇水溶液、聚乙二醇400混合均匀，用质量浓度为8%的聚乙烯醇水溶液定容，上述各溶液体积含量之和为100%，脂肪酶液体积含量为定容后总体积的2%~10%，Gly-NaOH缓冲液体积含量为定容后总体积的5%~30%，0.1%溴百里酚蓝酸碱指示剂体积含量为定容后总体积的5%，1mol/L的CaCl2溶液体积含量为定容后总体积的1%，质量浓度为15%甘露糖醇水溶液体积含量为定容后总体积的0.5%，聚乙二醇400体积含量为定容后总体积的1%，放在振荡器中振荡15～25min得到混合溶液，取混合溶液

0.6~2.4ml注入底板槽中，在-20℃温度条件下冷冻16h，然后在14℃下解冻6h，即得到凝胶酶基板； 所述脂肪酶液的脂肪酶浓度为10~40g/L；酶活力为20000U/g；

聚乙烯醇水溶液聚合度1750±50；聚乙烯醇水溶液体积含量为定容后总体积的

55%~90%；

（4）、时间温度指示器制备：包括含有凝胶状的反应底物的上盖、含有凝胶酶基板的底板两部分，激活以前，含有凝胶状的反应底物的上盖与含有凝胶酶基板的底板两部分是分离的，分开在4℃下冷藏；使用时，将含有凝胶状的反应底物的上盖压合在含有凝胶酶基板的底板上，使凝胶状反应底物的底物凝胶与凝胶酶基板接触激活即可。

2.如权利要求1所述的基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法，其特征是：步骤（1）中的三乙酸甘油酯和聚乙烯醇水溶液的体积比选用5:95 ~ 20:80；步骤（3）中，Gly-NaOH缓冲液体积含量为定容后总体积的15%~25%；步骤（3）中脂肪酶液体积含量为定容后总体积的2%~6%。

3.如权利要求1所述的基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方

法，其特征是：所述Gly-NaOH缓冲液，PH值10.6。

4.如权利要求1所述的基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方

法，其特征是：所述0.1%溴百里酚蓝酸碱指示剂PH值6.0~7.6。

5.权利要求1所述的基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法制备的时间温度指示器的应用，其特征是：时间温度指示器使用时，将含有凝胶酶基板的底板黏附在包装表面，将含有凝胶状的反应底物的上盖压合在含有凝胶酶基板的底板上，使凝胶状反应底物的底物凝胶与凝胶酶基板接触激活即可；两者接触后便生酶促反应，形成一条黄色带；

根据黄色带的扩散长度来判断确立该时间温度指示器对时间温度的积累效应。

6.如权利要求5所述的基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法制备的时间温度指示器的应用，其特征是：所述含有凝胶酶基板的底板底部涂上干胶粘连性物质，所述粘连性物质表面附上一层保护膜。

7.如权利要求6所述的基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法制备的时间温度指示器的应用，其特征是：所述保护膜为蜡纸、涂膜纸或塑料薄膜。

说明书

基于脂肪酶反应扩散的时间温度指示器的制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于脂肪酶反应和扩散原理的时间温度指示器和使用方法，该时间温度指示器基于脂肪酶反应和扩散原理，可以指示物品在生产、储运和销售过程中对时间温度的积累效应，从而方便可靠的监测物品的质量状况。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到广大消费者的关注。保质期问题是食品安全的一个重要方面，温度对保质期的影响又是至关重要的，对于那些受温度影响较大的食品(如一些易于腐败的需要冷冻或冷藏的食品)来说更是如此。人们通常所见的包装外部标签上的保质期(即公开货架期)指的是在特定温度条件下食品的质量保证期限。但是在整个储运阶段，温度具有不可测性，因此公开货架期不能真实的反应产品的质量状况。在这种情况下，时间温度指示器TTI(Time Temperature Indicator)这一装置就应运而生了。TTI是一种简易的质量记录装置，可以在整个储运过程中对产品的一些关键参数进行监控和记录，通过时间温度的积累效应来动态显示食品的剩余货架期信息。时间温度指示器按照工作原理可以分为物理型、化学型、生物型三种。它们由时间-温度引起的综合变化通过相应的可视的不可逆的颜色扩散、颜色变化或机械变化表现出来。但是在过去的二十多年中，国内外科学研究和商品开发所关注的TTI主要有：扩散型、化学型，酶型、和微生物型，以及其他一些新型的TTI。目前，国内对TTI的研究尚处于起步阶段，主要集中在酶型和扩散型TTI的研究，而且以后者居多。2006年，叶兴乾等研发的CN2801686Y，利用的是脲酶与尿素或其衍生物的酶促反应使PH指示剂变色来动态表征温度对时间的积累效应。陈建初等开发的CN2846321Y，利用的是碱性脂肪酶与脂/酯类底物的水解效应。2007年，蔡华伟等开发了专利CN101055255A，利用的是淀粉酶与淀粉的水解，以碘作为为显色剂。2009年，徐幸莲等开发了专利CN101349599A，利用的是碱性脂肪酶与底物三乙酸甘油酯的水解反应。以上各种酶型TTI主要是利用酶化学反应使PH值降低，通过酸碱指示剂变色来显示时间温度的积累效应，动态指示产品的货架寿命。

[0003] 2009年7月，吕志业等将酶化学反应和扩散原理结合起来，开发了一种新型的酶扩散型TTI，它可以通过显色圈的大小来判断指示器反应进行的程度，从而可视的表征食品的剩余货架寿命。该TTI将酶化学反应和扩散原理很好的结合起来，但在实际运用中会存在以下问题：(1)指示器显色圈变化不够明显，表现在：扩散区域较小，最大半径为7-8mm；随着扩散距离的变大，显色环色带变浅；显色圈在扩散过程中边界模糊，加上扩散区域小，辨认困难，指示效果不理想。(2)TTI中酶没有经过任何处理，容易失活，不能用于长货架期食品的预测。另外，酶是生物大分子，向渗透性不好的琼脂板中扩散是很困难的。(3)TTI中用到的酶液是液态的，实际应用不方便，也不便激活，导致设计出来的TTI结构较复杂，成本高，效果不够稳定性。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服上述不足之处，从而提供一种基于脂肪酶反应和扩散原理的时间温度指示器的制备方法和使用，该时间温度指示器在显色效果、激活方式等方面进行了优化和改进，其结构简单、储藏方便，可明显增强显色效果，易于实际应用。

[0005] 按照本发明提供的技术方案，基于脂肪酶反应和扩散原理的时间温度指示器的制备方法，采用以下制备步骤：

[0006] (1)、上盖、底板分别采用透明硬质或软质高分子材料制备成长方形；并分别在上盖、底板上设有槽；

[0007] (2)、凝胶状反应底物的制备：在容器中加入三乙酸甘油酯(反应底物)，然后用质量浓度为8％的聚乙烯醇水溶液定容，用搅拌机以180～220r/min速度搅拌2min得到均匀的乳化液，取0.3ml乳化液注入上盖的槽中，水平放置，在-20℃温度条件下冷冻16h，然后取出，并在常温下解冻6h，即得到含有凝胶状反应底物的上盖；

[0008] 所述三乙酸甘油酯(反应底物)和聚乙烯醇水溶液的体积比为5∶95～30∶70；

[0009] (3)、酶基板的制备：取脂肪酶液用量体积比为2％～10％、Gly-NaOH缓冲液用量体积比为5％～30％、0.1％溴百里酚蓝酸碱指示剂用量体积比为5％、1mol/L的CaCl2溶液用量体积比1％、质量浓度为15％甘露糖醇水溶液用量体积比0.5％，聚乙二醇400用量体积比为1％混合均匀，用质量浓度为8％的聚乙烯醇水溶液定容，放在振荡器中振荡15～25min得到混合溶液，取混合溶液0.6～2.4ml注入底板槽中，在-20℃温度条件下冷冻
16h，然后在14℃下解冻6h，即得到含有凝胶酶基板的底板；

[0010] 所述脂肪酶液的脂肪酶浓度为10～40g/Ml；酶活力为20000U/g；

[0011] 所述脂肪酶液的脂肪酶浓度优选15～30g/Ml。所述Gly-NaOH缓冲液，PH值10.6。

[0012] 所述0.1％溴百里酚蓝酸碱指示剂由0.1g溴百里酚蓝溶解于100ml60％乙醇中而得到，变色范围为PH值6.0(黄)～7.6(蓝)

[0013] 所述聚乙烯醇水溶液聚合度1750±50；用量体积比为55％～90％；

[0014] (4)、时间温度指示器制备：包括含有凝胶状的反应底物的上盖、含有凝胶酶基板的底板两部分，激活以前，含有凝胶状的反应底物的上盖与含有凝胶酶基板的底板两部分是分离的，分开在4℃下冷藏；使用时，将含有凝胶状的反应底物的上盖压合在含有凝胶酶基板的底板上，使凝胶状反应底物的底物凝胶与凝胶酶基板接触激活即可。

[0015] 所述三乙酸甘油酯(反应底物)和聚乙烯醇水溶液的用量体积比选用5∶95～20∶80；所述Gly-NaOH缓冲液用量体积比选用15％～25％；所述脂肪酶液用量体积比选用2％～6％；所述聚乙烯醇水溶液用量体积比选用45％～75％。

[0016] 所述1mol/L的CaCl2溶液为稳定剂(Ca2+是脂肪酸的受体，能在酶反应的后期降低脂肪酸对酶的抑制作用)。

[0017] 应用：时间温度指示器使用时，将含有凝胶酶基板的底板黏附在包装表面，将含有凝胶状的反应底物的上盖压合在含有凝胶酶基板的底板上，使凝胶状反应底物的底物凝胶与凝胶酶基板接触激活即可；两者接触后便生酶促反应，形成一条黄色带；根据黄色带的扩散长度来判断确立其对时间温度的积累效应；根据建立的TTI的活化能与影响因素之间的关系，与所要预测的食品进行活化能匹配，就可以方便可靠的监测食品在生产、储运和销售过程中的质量状况。

[0018] 所述含有凝胶酶基板的底板底部涂上干胶粘连性物质，所述粘连性物质表面附上一层保护膜。

[0019] 所述不干胶粘连性物质为压敏粘合剂，包括技术领域中已知的用于制作标签、胶带和类似物的任何压敏或可热活化的粘合剂材料。所述胶合剂材料可包含一种粘合聚合物作为主要材料，如丙烯酸型聚合物；嵌段共聚物；天然、再生或苯乙烯-丁二烯橡胶；增粘的天然或合成橡胶；或乙烯和乙烯基乙酸乙酯的无规则共聚物，聚异丁烯等等。除了上述树脂外粘合剂还可包括固体增粘树酯，抗氧剂，填料，颜料，蜡等。

[0020] 所述保护膜为蜡纸、涂膜纸或塑料薄膜等。

[0021] 本发明公开的TTI时间温度指示器的显色机理是：含有凝胶反应底物的上盖与含有凝胶酶基板的底板接触后激活，上盖中的小分子底物(三乙酸甘油酯)向底板中的凝胶酶基板中进行扩散，与脂肪酶分子结合发生水解反应，产生酸性产物，使溴百里香酚兰酸碱+ +指示剂由蓝色变成黄色。由于反应部位的H 浓度比周围的浓度要高，H 会向周边扩散，会使该区域的PH值降低，从而引起给区域酸碱指示剂的变色，形成一条黄色的色带。随着时间的推移，变色带不断向外扩散。而且温度越高，扩散的速度越快，从而指示其对时间温度的积累效应。根据建立的TTI的活化能与影响因素之间的关系，与所要预测的食品进行活化能匹配，就可以方便可靠的监测食品在生产、储运和销售过程中的质量状况。

[0022] 本发明公开的新型时间温度指示器将酶化学反应与扩散原理有效的结合起立，凝胶中的反应底物根据扩散原理不断的向酶基板中扩散，与酶基板中固定化的酶分子接触发生酶促反应使反应体系PH值降低，通过PH指示剂将这种变化表征出来。时间越长，温度越高，扩散的速度也越快。通过扩散长度来动态显示该TTI对时间温度的积累效应。相比现有的酶型TTI，本发明具有以下效果：

[0023] (1)明显增强了显色效果。本发明公开的TTI对时间温度的积累效应是通过有色带的扩散长度来观察，通过分析各因素与TTI显色效果的分析，优化后的反应体系使得TTI颜色变化明显，使用溴百里香酚兰作为指示剂时，酶基板由蓝色变成黄色，而且变色带与非边色带边界清晰，颜色均匀，凝胶结构完整，扩散变化明显，非常方便肉眼观察。

[0024] (2)首次在TTI中引入酶的固定化技术，将大分子生物酶固定在酶基板网络状凝胶中，这样做的目的有两个：一方面可以提高酶分子及酶促反应的稳定性，同时还可以提高酶的储存期，以适合不同货架期产品的要求；另一方面，采用多孔的网络型材料固定化酶，使小分子底物向基质中扩散，使扩散过程更加容易实现，扩散现象更显著。

[0025] (3)TTI反应体系中的反映底物和酶基板都进行了凝胶化，相对于现有酶型TTI的液态体系而言，更利于TTI的生产、储藏，特别是有利于保持TTI在使用过程中性能的稳定性，而不会因为TTI的倒置、倾斜而影响其正常工作。

[0026] (4)本发明公开的TTI结构简单，成本低廉，使用方便，特别是储藏简单，激活方便。激活之前，TTI的上盖和酶基板是分离开来的，可以在常温下储藏；激活时，只须将上盖压合在酶基板上，是底物凝胶与酶基板接触即可。另外，TTI使用时如要将底板黏附在包装表面，可以底板底部涂上不干胶等粘连性物质，根据需要还可以在粘连性物质表面附上一层保护膜，如蜡纸、涂膜纸、塑料薄膜等。

附图说明

[0027] 图1为时间温度指示器结构的剖视图

[0028] 图2为时间温度指示器结构的俯视图

[0029] 图3为时间温度指示器结构的仰视图

[0030] 图4为8℃、14℃、23℃下TTI1的扩散长度x随时间t的变化趋势

[0031] 图5为TTI1的lnk-1/RT关系曲线

[0032] 图6为8℃、14℃、23℃下TTI2的扩散长度x随时间t的变化趋势

[0033] 图7为TTI2的lnk-1/RT关系曲线

[0034] 图8为8℃、14℃、23℃下TTI3的扩散长度x随时间t的变化趋势

[0035] 图9为TTI31的lnk-1/RT关系曲线

[0036] 图10为8℃、14℃、23℃下TTI4的扩散长度x随时间t的变化趋势[0037] 图11为TTI4的lnk-1/RT关系曲线

具体实施方式

[0038] 下面本发明将结合附图中的实施例作进一步描述：

[0039] 图1～图3所示，包括上盖1、底物凝胶2、底板3、酶基板4、限位齿5、不干胶6，视窗7。

[0040] 材料与仪器

[0041] 1、材料：脂肪酶液为碱性脂肪酶(LVK-F100，酶活20000U/g)，三乙酸甘油酯，pH＝10.6的Gly-NaOH缓冲溶液，1mol/L的CaCl2溶液，质量浓度为15％甘露糖醇水溶液，聚乙二醇400，0.1％溴百里酚蓝指示剂，质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液。

[0042] 所述pH＝10.6的Gly-NaOH缓冲溶液的制备方法为：将125mL 0.2mol·L-1Gly溶-1液与113.75mL0.2mol·L NaOH混合(两者体积比为125∶22)，用蒸馏水定容至500mL，得-1
到0.05mol·L pH 10.6的Gly-NaOH缓冲溶液。

[0043] 所述0.1％溴百里酚蓝酸碱指示剂由0.1g溴百里酚蓝溶解于100ml60％乙醇中而得到；

[0044] 所述质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液制备方法为：称取16g聚乙烯醇(聚合度1750±50)磨口圆底烧瓶中，加入蒸馏水使PVA和蒸馏水的总重量为200g。然后放入到水浴槽中90℃恒温水浴，并用搅拌机搅拌2h，转速为180r/s～220r/s。
停止搅拌后，补偿蒸馏水，使蒸馏水加PVA的总质量仍为200g，再在60℃静置30min除去气泡。冷却后，将烧瓶中的溶液经过滤网转移到试剂瓶中，常温放置即可。

[0045] 2、仪器：生物培养箱(SPA-150B-Z型，上海博迅实业有限公司)，BC/BD-160S冰箱(海尔集团)，数字式高速搅拌器(JB200-S型，上海标本模型厂)，恒温恒湿试验机(THS-ADC-100AS型，庆声电子科技有限公司)，恒温水浴锅(YJ501型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，振荡器(HY-4型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)[0046] 3、上盖1、底板3分别采用透明硬质高分子材料制备成长方形；并分别在上盖1、底板3上设有槽；上盖1的外型尺寸(不计材料厚度)长宽高尺寸为20～80mm×10mm×6mm，宽度具体值视应用实际情况而定：其中的凝胶底物槽长宽高尺寸为：10mm×10mm×3mm；底板3外型尺寸(不计材料厚度)长宽高尺寸为20～80mm×10mm×3mm。

[0047] 所述透明硬质高分子材料为常用的塑料材料，包括PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯等。

[0048] 实施例一：本发明基于脂肪酶反应和扩散原理的时间温度指示器的制备方法，采用以下制备步骤：

[0049] 1、凝胶状的反应底物的制备：在50ml小烧杯中加入0.5mL三乙酸甘油酯(反应底物)，然后用聚乙烯醇水溶液质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到10mL(三乙酸甘油酯(反应底物)与聚乙烯醇水溶液的体积比为5∶95)，用搅拌机以180～220r/min速度搅拌2min，得到均匀的乳化液，取0.3mL注入到上盖1的凝胶底物凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取出，常温下解冻6h，得到方形凝胶状的反应底物2，尺寸为10mm×10mm×3mm。

[0050] 2、酶基板的制备：在50ml小烧杯中依次加入配备好的Gly-NaOH缓冲溶液1mL(即体积比用量为5％)、CaCl2溶液0.2mL(即体积比用量为1％)、浓度为15g/L脂肪酶溶液0.4mL(即体积比用量为2％)，质量浓度为15％甘露糖醇水溶液0.1ml(即体积比用量为
0.5％)、聚乙二醇400用量0.2ml(即体积比用量为1％)、0.1％溴百香酚兰指示剂1mL(即体积比用量为5％)，然后用质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到
20mL(即体积比用量为85.5％)，放在振荡器上以中速振荡15min。然后取出2.4mL注入到底板3凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取在14℃下解冻6h，得到长条形凝胶状聚乙烯醇酶基板4，尺寸为10mm×10mm×8mm。

[0051] 3、时间温度指示器制备：该实例中的时间温度指示器由上盖1和底板3两部分组成，激活以前，上盖1和底板3两部分是分离的，分开在4℃下冷藏。使用时，只须将上盖1压合在底板3上，通过限位齿5固定，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活即可，通过视窗7来观察酶基板中颜色带的扩散情况。

[0052] 4、时间温度指示器动力学参数的测定：按照上述步骤1和步骤2制作9个相同的时间温度指示器原型，分为三批，分别在8℃、14℃、23℃条件下进行恒温试验，每个试验组进行3组平行试验，每12小时测量一次TTI的扩散长度，以3个平行组的平均值作为该TTI的响应值x。在8℃、14℃、23℃下TTI1的扩散长度x随时间t的变化趋势如图4所示，不难看出，TTI1的响应值x与时间t呈现很好的线性关系，可以得到不同温度下的反应速率。根据Arrhenius公式：

[0053]

[0054] 建立lnk-1/RT关系曲线，如图5，该直线的斜率即为TTI1的活化能，即Ea＝39.529kJ/mol。

[0055] 5、应用：TTI应用于实际产品时，必须确保它与产品的活化能Ea相同或相近。Taoukis在2001年提出产品的Ea值与TTI的Ea之差小于25kJ/mol时，TTI可以较准确的应用于该产品。表1中列出了食品质量损失的典型活化能，可以将该实例应用于相匹配的食品。使用时，将含有凝胶酶基板的底板3黏附在包装表面，将上盖1压合在底板3上，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活发生酶促反应，形成一条黄色带；根据黄色带的扩散长度来判断确立其对时间温度的积累效应，可以方便的监测食品在生产、储运和销售过程中的质量状况。

[0056] 所述底板1底部涂上不干胶粘连性物质6选用丙烯酸A-13，根据需要在所述粘连性物质表面附上一层保护膜为涂硅牛皮纸。

[0057] 表1食品质量损失的典型活化能值

[0058]

[0059] 实施例二：本发明基于脂肪酶反应和扩散原理的时间温度指示器的制备方法，采用以下制备步骤：

[0060] 1、凝胶状的反应底物的制备：在50ml小烧杯中加入1.5mL三乙酸甘油酯(反应底物)，然后用聚乙烯醇水溶液质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到10mL(三乙酸甘油酯(反应底物)与聚乙烯醇水溶液的体积比为15∶85)，用搅拌机以180～220r/min速度搅拌2min，得到均匀的乳化液，取0.3mL注入到上盖1的凝胶底物凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取出，常温下解冻6h，得到方形凝胶状的反应底物2，尺寸为10mm×10mm×3mm。

[0061] 2、酶基板的制备：在50ml小烧杯中依次加入配备好的Gly-NaOH缓冲溶液2mL(即体积比用量为10％)、CaCl2溶液0.2mL(即体积比用量为1％)、浓度为20g/L脂肪酶溶液0.4mL(即体积比用量为2％)，质量浓度为15％甘露糖醇水溶液0.1ml(即体积比用量为
0.5％)、聚乙二醇400用量0.2ml(即体积比用量为1％)、0.1％溴百香酚兰指示剂1mL(即体积比用量为5％)，然后用质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到
20mL(即体积比用量为80.5％)，放在振荡器上以中速振荡15min。然后取出2.4mL注入到底板3凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取在14℃下解冻6h，得到长条形凝胶状聚乙烯醇酶基板4，尺寸为10mm×10mm×8mm。

[0062] 3、时间温度指示器制备：该实例中的时间温度指示器由上盖1和底板3两部分组成，激活以前，上盖1和底板3两部分是分离的，分开在4℃下冷藏。使用时，只须将上盖1压合在底板3上，通过限位齿5固定，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活即可，通过视窗7来观察酶基板中颜色带的扩散情况。

[0063] 4、时间温度指示器动力学参数的测定：按照上述步骤1和步骤2制作9个相同的时间温度指示器原型，分为三批，分别在8℃、14℃、23℃条件下进行恒温试验，每个试验组进行3组平行试验，每12小时测量一次TTI的扩散长度，以3个平行组的平均值作为该TTI的响应值x。在8℃、14℃、23℃下TTI2的扩散长度x随时间t的变化趋势如图6所示，不难看出，TTI2的响应值x与时间t呈现很好的线性关系，可以得到不同温度下的反应速率。根据Arrhenius公式：

[0064]

[0065] 建立lnk-1/RT关系曲线，如图7，该直线的斜率即为TTI2的活化能，即Ea＝28.312kJ/mol。

[0066] 5、应用：TTI应用于实际产品时，必须确保它与产品的活化能Ea相同或相近。Taoukis在2001年提出产品的Ea值与TTI的Ea之差小于25kJ/mol时，TTI可以较准确的应用于该产品。表1中列出了食品质量损失的典型活化能，可以将该实例应用于相匹配的食品。使用时，将含有凝胶酶基板的底板3黏附在包装表面，将上盖1压合在底板3上，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活发生酶促反应，形成一条黄色带；根据黄色带的扩散长度来判断确立其对时间温度的积累效应，可以方便的监测食品在生产、储运和销售过程中的质量状况。

[0067] 实施例三：本发明基于脂肪酶反应和扩散原理的时间温度指示器的制备方法，采用以下制备步骤：

[0068] 1、凝胶状的反应底物的制备：在50ml小烧杯中加入1.2mL三乙酸甘油酯(反应底物)，然后用质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到10mL(三乙酸甘油酯(反应底物)与聚乙烯醇水溶液的体积比为12∶88)，用搅拌机以180～220r/min速度搅拌2min，得到均匀的乳化液，取0.3mL注入到上盖1的凝胶底物凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取出，常温下解冻6h，得到方形凝胶状的反应底物2，尺寸为10mm×10mm×3mm。

[0069] 2、酶基板的制备：在50ml小烧杯中依次加入配备好的Gly-NaOH缓冲溶液3.6mL(即体积比用量为18％)、CaCl2溶液0.2mL(即体积比用量为1％)、浓度为25g/L脂肪酶溶液1.0mL(即体积比用量为5％)，质量浓度为15％甘露糖醇水溶液0.1ml(即体积比用量为0.5％)、聚乙二醇400用量0.2ml(即体积比用量为1％)、0.1％溴百香酚兰指示剂1mL(即体积比用量为5％)，然后用质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到20mL(即体积比用量为69.5％)，放在振荡器上以中速振荡15min。然后取出
2.4mL注入到底板3凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取在14℃下解冻6h，得到长条形凝胶状聚乙烯醇酶基板4，尺寸为10mm×10mm×8mm。

[0070] 3、时间温度指示器制备：该实例中的时间温度指示器由上盖1和底板3两部分组成，激活以前，上盖1和底板3两部分是分离的，分开在4℃下冷藏。使用时，只须将上盖1压合在底板3上，通过限位齿5固定，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活即可，通过视窗7来观察酶基板中颜色带的扩散情况。

[0071] 4、时间温度指示器动力学参数的测定：按照上述步骤1和步骤2制作9个相同的时间温度指示器原型，分为三批，分别在8℃、14℃、23℃条件下进行恒温试验，每个试验组进行3组平行试验，每12小时测量一次TTI的扩散长度，以3个平行组的平均值作为该TTI的响应值x。在8℃、14℃、23℃下TTI3的扩散长度x随时间t的变化趋势如图8所示，不难看出，TTI3的响应值x与时间t呈现很好的线性关系，可以得到不同温度下的反应速率。根据Arrhenius公式：

[0072]

[0073] 建立lnk-1/RT关系曲线，如图9，该直线的斜率即为TTI3的活化能，即Ea＝78.538kJ/mol。

[0074] 5、应用：TTI应用于实际产品时，必须确保它与产品的活化能Ea相同或相近。Taoukis在2001年提出产品的Ea值与TTI的Ea之差小于25kJ/mol时，TTI可以较准确的应用于该产品。表1中列出了食品质量损失的典型活化能，可以将该实例应用于相匹配的食品。使用时，将含有凝胶酶基板的底板3黏附在包装表面，将上盖1压合在底板3上，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活发生酶促反应，形成一条黄色带；根据黄色带的扩散长度来判断确立其对时间温度的积累效应，可以方便的监测食品在生产、储运和销售过程中的质量状况。

[0075] 实施例四：本发明基于脂肪酶反应和扩散原理的时间温度指示器的制备方法，采用以下制备步骤：

[0076] 1、凝胶状的反应底物的制备：在50ml小烧杯中加入0.8mL三乙酸甘油酯(反应底物)，然后用质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到10mL(三乙酸甘油酯(反应底物)与聚乙烯醇水溶液的体积比为8∶92)，用搅拌机以180～220r/min速度搅拌2min，得到均匀的乳化液，取0.3mL注入到上盖1的凝胶底物凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取出，常温下解冻6h，得到方形凝胶状的反应底物2，尺寸为10mm×10mm×3mm。

[0077] 2、酶基板的制备：在50ml小烧杯中依次加入配备好的Gly-NaOH缓冲溶液3.7mL(即体积比用量为18.5％)、CaCl2溶液0.2mL(即体积比用量为1％)、浓度为20g/L脂肪酶溶液1.2mL(即体积比用量为6％)，质量浓度为15％甘露糖醇水溶液0.1ml(即体积比用量为0.5％)、聚乙二醇400用量0.2ml(即体积比用量为1％)、0.1％溴百香酚兰指示剂1mL(即体积比用量为5％)，然后用质量浓度为8％的聚乙烯醇(聚合度1750±50)水溶液，定容到20mL(即体积比用量为69％)，放在振荡器上以中速振荡15min。然后取出2.4mL注入到底板3凹槽中，水平放置于冰箱中，-20℃下极速冷冻16h，然后取在14℃下解冻6h，得到长条形凝胶状聚乙烯醇酶基板4，尺寸为10mm×10mm×8mm。

[0078] 3、时间温度指示器制备：该实例中的时间温度指示器由上盖1和底板3两部分组成，激活以前，上盖1和底板3两部分是分离的，分开在4℃下冷藏。使用时，只须将上盖1压合在底板3上，通过限位齿5固定，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活即可，通过视窗7来观察酶基板中颜色带的扩散情况。

[0079] 4、时间温度指示器动力学参数的测定：按照上述步骤1和步骤2制作9个相同的时间温度指示器原型，分为三批，分别在8℃、14℃、23℃条件下进行恒温试验，每个试验组进行3组平行试验，每12小时测量一次TTI的扩散长度，以3个平行组的平均值作为该TTI的响应值x。在8℃、14℃、23℃下TTI4的扩散长度x随时间t的变化趋势如图10所示，不难看出，TTI4的响应值x与时间t呈现很好的线性关系，可以得到不同温度下的反应速率。根据Arrhenius公式：

[0080]

[0081] 建立lnk-1/RT关系曲线，如图11，该直线的斜率即为TTI4的活化能，即Ea＝108.065kJ/mol。

[0082] 5、应用：TTI应用于实际产品时，必须确保它与产品的活化能Ea相同或相近。Taoukis在2001年提出产品的Ea值与TTI的Ea之差小于25kJ/mol时，TTI可以较准确的应用于该产品。表1中列出了食品质量损失的典型活化能，可以将该实例应用于相匹配的食品。使用时，将含有凝胶酶基板的底板3黏附在包装表面，将上盖1压合在底板3上，使凝胶状的反应底物2与凝胶状酶基板4接触激活发生酶促反应，形成一条黄色带；根据黄色带的扩散长度来判断确立其对时间温度的积累效应，可以方便的监测食品在生产、储运和销售过程中的质量状况。