快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米线生物传感器芯片及系统

摘要

本发明公开一种快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米线生物传感器芯片及系统。TiO2纳米线生物传感器芯片是在两个平行的金电极之间连接有TiO2纳米线，TiO2纳米线为同轴层状纳米结构，TiO2纳米线的表面键合有羟基。快速检测致病大肠杆菌的系统的生物传感器的进样容器和出样容器通过微流通道连通，TiO2纳米线生物传感器芯片中的TiO2纳米线置于微流通道内，TiO2纳米线生物传感器芯片中的两个平行的金电极分置于微流通道两侧，且TiO2纳米线置于交变磁场内；该系统的第一蠕动泵通过细菌进样管与进样容器连通，第二蠕动泵通过清洗液进样管与进样容器连通；阻抗检测电路分别与两个金电极、第一蠕动泵和第二蠕动泵电连接。本发明不需对细菌样本做复杂预处理，缩短细菌检测时间。

权利要求

1.一种快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米线生物传感器芯片，其特征是：在两个平行的金电极之间连接有TiO2纳米线，所述TiO2纳米线为同轴层状纳米结构，所述同轴层状纳米结构是由TiO2纳米线轴及包裹该轴的一层以上TiO2纳米管构成，所述TiO2纳米线的表面键合有羟基。

2.一种包含权利要求1的TiO2纳米线生物传感器芯片的快速检测致病大肠杆菌的系统，其特征是：包括生物传感器、阻抗检测电路、第一蠕动泵、第二蠕动泵和交变磁场，所述生物传感器包括进样容器、出样容器和TiO2纳米线生物传感器芯片，进样容器和出样容器通过微流通道连通，TiO2纳米线生物传感器芯片中的TiO2纳米线置于所述微流通道内，TiO2纳米线生物传感器芯片中的两个平行的金电极分置于微流通道的两侧；所述TiO2纳米线生物传感器芯片中的TiO2纳米线置于所述交变磁场内；所述第一蠕动泵通过细菌进样管与进样容器连通，第二蠕动泵通过清洗液进样管与进样容器连通；所述阻抗检测电路分别与两个金电极、第一蠕动泵和第二蠕动泵电连接。

3.根据权利要求2所述的快速检测致病大肠杆菌的系统，其特征是：所述阻抗检测电路包括相互连接的单片机和型号为AD5933的阻抗检测芯片。

说明书

快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米线生物传感器芯片及系

统

技术领域

[0001] 本发明涉及一个用于快速灵敏检测致病性大肠杆菌的TiO2纳米线生物传感器芯片检测系统。

背景技术

[0002] 传统的细菌检测手段如细胞培养、荧光测试等不仅检测周期长而且耗费大量的人力物力，难以满足目前国内外对食品安全检测的要求。目前，酶联免疫吸附测定技术(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)以及聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)等常用的检测手段与传统方法相比，虽然能够有效的缩短分析时间，但是其检测时间仍长达五到六个小时，而且不能实现对细菌的实时检测。因此，实现对细菌的快速、实时检测以确保人们的日用生活安全成为目前急需解决的重要问题。 [0003] 近年来，抗体或免疫传感器已经成为人们研究的热点，通过抗原抗体的相互作用，微生物可以被直接或间接的快速检测出来。随着纳米技术的发展和微加工技术的不断成熟，基于纳米材料的传感器引起了人们的广泛关注。而一维纳米线由于具有较大的比表面积和特殊的电子传输性能被广泛应用于制备各种电子器件。

[0004] TiO2是一种宽带隙半导体氧化物，其在传感、光催化、燃料敏化太阳能电池以及电化学锂存储等方面有着重要的潜在应用价值。此外，其还具有良好的生物相容性、化学稳定性和可忽略的蛋白质变性作用，这些特殊的性能都使其成为理想的生物传感材料。 发明内容

[0005] 针对传统食品细菌检测方法的诸多问题，本发明目的是提供一种快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米线生物传感器芯片及系统。

[0006] 为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：其快速检测致病大肠杆菌的TiO2纳米线生物传感器芯片是在两个平行的金电极之间连接有TiO2纳米线，所述TiO2纳米线为同轴层状纳米结构，所述TiO2纳米线的表面键合有羟基。

[0007] 进一步地，本发明所述TiO2同轴层状纳米结构是由TiO2纳米线轴及包裹该轴的一层以上TiO2纳米管构成。

[0008] 本发明快速检测致病大肠杆菌的系统包括生物传感器、阻抗检测电路、第一蠕动泵、第二蠕动泵和交变磁场，所述生物传感器包括进样容器、出样容器和TiO2纳米线生物传感器芯片，进样容器和出样容器通过微流通道连通，TiO2纳米线生物传感器芯片中的TiO2纳米线置 于所述微流通道内，TiO2纳米线生物传感器芯片中的两个平行的金电极分置于微流通道的两侧；所述TiO2纳米线生物传感器芯片中的TiO2纳米线置于所述交变磁场内，使免疫磁分离的细菌在微流通道内的TiO2纳米线上易于捕获；所述第一蠕动泵通过细菌进样管与进样容器连通，第二蠕动泵通过清洗液进样管与进样容器连通；所述阻抗检测电路分别与两个金电极、第一蠕动泵和第二蠕动泵电连接，第一蠕动泵和第二蠕动泵可以分别自动给生物传感器注入流量可控的细菌和清洗液。

[0009] 进一步地，本发明所述阻抗检测电路包括相互连接的单片机和型号为AD5933的阻抗检测芯片。利用AD5933阻抗检测芯片来测定TiO2纳米线生物传感器芯片在抗体修饰前后及细菌捕获后1Hz～1MHz范围内的阻抗谱。

[0010] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用同轴层状TiO2纳米线做传感材料，其表面键合有一定数目的羟基，羟基可以很容易的与抗体相互作用，使得抗体被固定在纳米线表面，从而抗体可以快速捕获细菌，使用该纳米线生物传感器芯片检测细菌的时间由传统的五、六个小时缩短为50分钟；同时，由于TiO2纳米线直径可控，因而表面羟基的数目可2
控，致使抗体固定数目随之可控，从而在细菌数目较低到10～10cfu/ml时，细菌仍能被很好的检测到。蠕动泵可以实现高精度的给传感器进样，检测过程所需的细菌用量很少，节约成本。采用AD5933型阻抗测量芯片测定阻抗，操作简单，测试速度快，便于使用。同时，与现有技术相比，利用本检测系统不需要对含有细菌的样本做复杂的预处理，从而缩短了细菌的检测时间，易于满足对细菌快速检测的需求。

附图说明

[0011] 图1是本发明具有同轴层状结构的TiO2纳米线示意图；

[0012] 图2是本发明含有TiO2纳米线生物传感器芯片的快速检测致病大肠杆菌的系统的结构示意图；

[0013] 图3是本发明一种阻抗检测电路的单片机与串行通信模块的电路图； [0014] 图4是本发明一种阻抗检测电路的蠕动泵驱动及外围接口模块的电路图； [0015] 图5是本发明一种阻抗检测电路的阻抗检测模块的电路图；

[0016] 图6是本发明一种阻抗检测电路的电源模块的电路图；

[0017] 图7是本发明利用含TiO2纳米线生物传感器芯片的系统检测致病大肠杆菌时，抗体固定前后及细菌捕获后TiO2纳米线生物传感器芯片的阻抗值与频率的关系曲线。 具体实施方式

[0018] 本发明同轴层状结构TiO2纳米线采用溶液法制备，以下举例说明：将0.2g TiO2粉末在不断搅拌下加入到2.0mol/L的Ca(OH)2和10mol/L的NaOH混合液中，将此混合液转移到聚四氟乙烯反应釜中密封，在100～250℃下反应4小时至7天后得到产物，即具有同轴层状 结构的TiO2纳米线。所得产物用去离子水冲洗至中性备用。

[0019] 本发明所制得同轴层状纳米结构的TiO2纳米线的结构示意图见图1。该同轴层状TiO2纳米线是由中心的TiO2纳米线轴1及在轴外层包裹的一层以上的TiO2纳米管2构成(图1中仅示出了两层TiO2纳米管2，但本发明的TiO2纳米线还可以具有一层或三层以上TiO2纳米管2，各层TiO2纳米管2均以TiO2纳米线轴1为中心层层包裹。)，TiO2纳米线轴1的直径通常在200nm左右，每一层TiO2纳米管2层的厚度大约在20nm左右。多层TiO2纳米管2在TiO2纳米线轴1上外延生长，TiO2纳米线轴1与外延生长的TiO2纳米管2层的分界可明显的看出。同轴层状TiO2纳米线的表面键合有一定数目的羟基。如图1所示，TiO2纳米线的表面包括TiO2纳米线轴1、各层TiO2纳米管2的裸露在外部分的表面。该同轴层状纳米线具有价带可调、表面羟基数量可控的优点。通过调控反应时间的长短可以控制TiO2纳米线的直径，从而调节TiO2纳米线表面羟基的数目。羟基数目多，则固定抗体数
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量相应增加，可以提高TiO2纳米线的敏感性，使得在细菌数目低到10～10cfu/ml时，仍能被很好的检测到。

[0020] 同轴层状结构的TiO2纳米线生物传感器芯片的制备过程如下：将TiO2纳米线置于氧化硅基片上，然后采用光刻法制备两个平行的金电极与TiO2纳米线相连，使得在两个平行的金电极之间连接有TiO2纳米线。

[0021] 使用本发明同轴层状TiO2纳米线生物传感器芯片时，将该生物传感器芯片的表面进行抗体修饰，具体过程如下：将TiO2纳米线生物传感器芯片置于2-甲基-2-丙硫醇中对金电极表面进行修饰，然后分别用99.5％乙醇和二次去离子水清洗。将致病性大肠杆菌抗体直接滴在TiO2纳米线生物芯片的表面上，在室温下孵育2小时，然后用去离子水冲洗，并在氮气气氛下干燥。这样表面修饰有抗体的TiO2纳米线生物传感器芯片就制成了。 [0022] 本发明包含有同轴层状的TiO2纳米线生物传感器芯片的快速检测致病大肠杆菌的系统主要有三部分构成：生物传感器、自动进样清洗装置和阻抗检测电路。 [0023] 图2是本发明快速检测致病大肠杆菌的系统的结构示意图。该系统中的生物传感器包括微流通道3、进样容器4、出样容器5和TiO2纳米线生物传感器芯片，进样容器4和出样容器5通过微流通道3连通。TiO2纳米线生物传感器芯片中的TiO2纳米线6置于微流通道3内，TiO2纳米线生物传感器芯片中的相互平行的金电极7和金电极8分置于微流通道3的两侧。TiO2纳米线生物传感器芯片的金电极7和金电极8通过导线与图4的阻抗检测电路的外围接口模块中的接线端子P3的VIN接线柱和VOUT接线柱连接。使用时，在微流通道3的两侧施加交变磁场9，使TiO2纳米线生物传感器芯片微流通道中的TiO2纳米线处于交变磁场内，这就会使免疫磁分离的细菌在微流通道3内流动时更易被TiO2纳米线上的抗体捕获。

[0024] 在本发明快速检测致病大肠杆菌的系统的自动进样清洗装置中，第一蠕动泵12通过细菌 进样管10与进样容器4连通，第二蠕动泵13通过清洗液进样管11与进样容器4连通。第一蠕动泵12通过细菌进样管10自动给生物传感器定量注入致病大肠杆菌的培养液。第一蠕动泵12的步进电机转速范围为0.1～50rpm，流量最低可达1μL/min，以此来保证系统高精度控制细菌培养液的进样量。第二蠕动泵13通过清洗液进样管11注入清洗液(如蒸馏水)来清洗TiO2纳米线生物传感器芯片。

[0025] 本发明的阻抗检测电路包括单片机与串行通信模块、蠕动泵驱动及外围接口模块、阻抗检测模块及电源模块四部分构成，各个模块之间通过图3至图6所示的各模块电路图中相同网络标号的引脚相连接。

[0026] 图3和图4分别是本发明一种阻抗检测电路的单片机与串行通信模块以及蠕动泵驱动及外围接口模块的电路图。图3中阻抗检测电路的核心控制芯片采用飞利浦公司P89C51型单片机。单片机P89C51通过图4中的步进电机直流电机驱动电路中的ULN2803A达林顿集成驱动芯片U3和光电耦合器U6来分别控制图2的第一蠕动泵12和第二蠕动泵13的开启、停止、加速减速及正反转。由于核心控制电路中的微控制器U1的GPIO驱动能力有限，因此采用ULN2803A达林顿集成驱动芯片U3驱动图2中第一蠕动泵12的步进电机，蠕动泵驱动电路板中接线端子P2的1、2、3、4、5接线柱分别与图2中第一蠕动泵12的步进电机相连。微控制器U1通过发出有序的矩形脉冲，控制ULN2803A驱动四相步进电机实现加速、减速、正反转等功能。同时阻抗检测电路中接线端子P3的1号接线柱与图2的第二蠕动泵13的直流电机电连接。以此，通过微控制器U1控制光电耦合器U6来驱动第二蠕动泵13的直流电机。

[0027] 图5是本发明一种阻抗检测电路的阻抗检测模块的电路图。在阻抗检测模块中采用ADI公司的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定抗体固定前、抗体固定后以及细菌滴加后TiO2纳米线生物传感器芯片在1Hz～1MHz频率范围内的阻抗谱。AD5933芯片由片上集成频率发生器与12位、1MSPS的模数转换器(ADC)组成。用频率发生器产生的信号来激励外部复阻抗，外部阻抗的响应信号由片上ADC进行采样，然后由片上DSP引擎进行离散傅里叶变换(DFT)处理。通过DFT算法在每个频率上返回一个实部(R)数据字和一个虚部(I)数据字。校准之后，算出各扫描频率点的阻抗幅度和相对相位。随后图3中单片机P89C51通过串行通信模块的RS232接口把数据传递给上机位(PC机)用户。

[0028] 图6是本发明阻抗检测电路的电源模块的电路图。阻抗检测电路的各个模块通过相应的端口与电源模块相连。以此来通过电源驱动各个模块的正常运转。 [0029] 以下举例说明利用本发明系统检测细菌的过程如下：

[0030] 1)将TiO2纳米线生物传感器芯片置于微流通道中，使TiO2纳米线6与微流通道3的流 体流动方向相垂直，然后利用阻抗测定电路中的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定抗体固定前1Hz～1MHz频率范围内TiO2纳米线生物传感器芯片的阻抗值； [0031] 2)取出TiO2纳米线生物传感器芯片，对芯片表面进行抗体修饰，随后将抗体修饰的TiO2纳米线生物传感器芯片置于微流通道3中，使TiO2纳米线6与微流通道3的流体流动方向相垂直，然后利用阻抗测定电路中的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定抗体固定后1Hz～1MHz频率范围内TiO2纳米线生物传感器芯片的阻抗值；

[0032] 3)将第一蠕动泵12和第二蠕动泵13分别与阻抗检测电路电连接，通过阻抗检测电路控制第一蠕动泵向固定有TiO2纳米线生物传感器芯片的微流通道3注入致病大肠杆菌。利用阻抗测定电路中的AD5933型高精度的阻抗测量芯片测定细菌吸附后1Hz～1MHz频率范围内TiO2纳米线生物传感器芯片的阻抗谱。随后利用阻抗检测电路控制第二蠕动泵13对固定有TiO2纳米线生物传感器芯片的微流通道3注入一定量的去离子水进行清洗，以用于重复使用。

[0033] 图7是本发明利用含TiO2纳米线生物传感器芯片的系统检测致病大肠杆菌时，抗2
体固定前后及浓度为10cfu/ml的细菌捕获后TiO2纳米线生物传感器芯片的阻抗值与频率的关系曲线。从图7可以看出，抗体加入后，TiO2纳米线生物传感器芯片阻抗值降低。而当加入细菌后，TiO2纳米线生物传感器芯片阻抗值升高。这是由于当TiO2纳米线表面固定抗体后，TiO2纳米线表面羟基与抗体结合使得抗体固定，同时TiO2纳米线与抗体发生静电吸引亦使得抗体被固定，由于抗体加入TiO2纳米线表面电荷减少引起阻抗降低；当对致病大肠杆菌进行检测时，抗体捕获细菌使得TiO2纳米线表面电荷增加而使得阻抗升高。这表明固定有抗体的TiO2纳米线生物传感器芯片可以快速检测致病性大肠杆菌。