一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，包括第二抗体包被酶标板，BSA封闭；加抗Exendin-4第一抗体孵育；加Exendin-4标准品及样品，并设立对照，加生物素标记Exendin-4孵育；加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素孵育；加pH7.5的PBS配制的0.5-2mg/ml HPPA和过氧化物溶液的混合液避光孵育；加甘氨酸缓冲液终止反应，于荧光酶标仪上读取相对荧光单位(RFU)值，根据标准品浓度及其对应的RFU值制作标准曲线，计算出样品中Exendin-4含量。本发明所述方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，成本低，可广泛应用于临床和非临床样品Exendin-4含量的检测。

权利要求

1.一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，包括以下步骤：步骤1：用第二抗体包被酶标板，洗板，BSA封闭，洗板；

步骤2：加抗Exendin-4第一抗体孵育，洗板；

步骤3：加Exendin-4标准品及样品，并设立对照，加生物素标记Exendin-4孵育，洗板；

步骤4：加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，洗板；

步骤5：加pH7.5的PBS配制的1.25mg/ml HPPA和30%双氧水的混合液避光孵育，加甘氨酸缓冲液终止反应；

步骤6：于荧光酶标仪上读取相对荧光单位值，根据标准品浓度及其对应的相对荧光单位值制作标准曲线，计算出样品中Exendin-4含量。

2.根据权利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，所述第二抗体浓度为

5-30μg/ml。

3.根据权利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，所述Exendin-4标准品及样品的基质选自血清、血浆。

4.根据权利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，生物素标记Exendin-4浓度为

1μg/ml。

5.根据权利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，Exendin-4为通过基因工程重组或化学合成。

说明书

一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法。

背景技术

[0002] Exendin-4，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，是从一种巨蜥唾液中提取的由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽，与GLP-1具有一系列相同的抗糖尿病作用，其氨基酸序列如下所示：

[0003] His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser

[0004] Exendin-4能够刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，其调节作用具有血糖浓度依赖性。Exendin-4在生物体内具有更长的生物学半衰期和更强的生物学活性，因此是治疗2型糖尿病的理想药物。目前获得Exendin-4的方法主要为化学合成法和基因工程重组法。2005年4月，化学合成的肠降血糖素类似物Exenatide(酰胺化的Exendin-4)经美国FDA批准上市，主要用于改善二甲双胍和磺酰脲类药物治疗不理想的2型糖尿病患者的血糖控制。

[0005] 目前，生物样品常用的分析方法包括色谱法和免疫法。色谱法灵敏度较低，不能达到临床和非临床试验要求；而且色谱法需要将血样进行预处理(如过C18色谱柱)，试验过程繁琐，回收率不稳定。

[0006] 免疫法是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法，是当前临床和非临床生物样品检测方法中最为常用的一种，多用于蛋白质多肽类物质的检测。免疫法依据不同的标记物可分为放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)等。

[0007] 放射免疫分析法(RIA)是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法，由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物等。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外，由于核素有半衰期，有效期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。

[0008] 酶免疫分析法(EIA)是将酶的高效催化作用和抗原抗体反应的高度特异性相结合，发展建立起来的一种免疫性标记分析方法。酶的催化作用可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。酶免疫分析法试剂制备容易掌握，半衰期长，实验操作简便，试剂对环境污染小，并且测定的特异性和灵敏度高，因此已广泛应用于临床和非临床检测。

[0009] 酶免疫分析法的底物分为普通显色底物、荧光底物等。目前，普通显色底物应用广泛，但灵敏度较低，达不到临床和非临床试验要求。荧光底物具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，因此越来越多的应用于分析检测方法中。荧光底物在吸收特定波长的光能后，发生原子重排，同时发射出更长波长的荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，在荧光酶标仪下可以检测到。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通分析法中杂色光的影响，从而提高了光学分析的灵敏度。现在常用的过氧化物酶的荧光底物包括：对羟基乙酸(HPA)，3-对羟基苯丙酸(HPPA)，高香草酸(HAV)，佳味醇(CV)等。

[0010] 用于检测蛋白多肽类抗原的酶免疫分析法主要是双抗体夹心法和竞争法。蛋白大分子抗原测定多用双抗体夹心法，而对只有单个抗原表位的小分子激素、药物等，因其可能只有一个抗原表位，或因为分子太小，结合一个抗体后，因空间位阻，无法再结合另一个抗体，所以不适合使用双抗体夹心方法测定。由于Exendin-4为含有39个氨基酸残基的小分子多肽，很难找到两个独立的抗原决定簇，不适合使用双抗体夹心方法测定。

发明内容

[0011] 本发明的目的在于提供一种可应用于临床和非临床样品定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，本发明所述方法条件优化，灵敏度高，特异性强。

[0012] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0013] 一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，包括以下步骤：

[0014] 步骤1：用第二抗体包被酶标板，洗板，BSA封闭，洗板；

[0015] 步骤2：加抗Exendin-4第一抗体孵育，洗板；

[0016] 步骤3：加Exendin-4标准品及样品，并设立对照，加生物素标记Exendin-4孵育，洗板；

[0017] 步骤4：加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，洗板；

[0018] 步骤5：加pH7.5的PBS配制的0.5-2mg/ml HPPA和过氧化物溶液的混合液避光孵育，加甘氨酸缓冲液终止反应；

[0019] 步骤6：于荧光酶标仪上读取相对荧光单位值，根据标准品浓度及其对应的相对荧光单位值制作标准曲线，计算出样品中Exendin-4含量。

[0020] 本发明所述酶免疫分析方法采用竞争抑制法对Exendin-4进行检测，竞争抑制法的原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。

[0021] 本发明所述酶免疫分析方法具体程序为：将第二抗体吸附于固相载体表面，孵育后洗板；加抗Exendin-4的第一抗体孵育后洗板，加入可能含抗原的待检溶液和生物素标记Exendin-4，孵育后洗板；再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶作用的底物HPPA及过氧化物，反应产生荧光，以甘氨酸缓冲液终止酶反应，同时使荧光增强。HPPA脱氢生成一种荧光物质DPDPA，该荧光物质吸收320nm波长的光能后，发生原子重排，发射出405nm波长的光，在荧光酶标仪下检测相对荧光单位(RFU)值。

[0022] 根据已知Exendin-4标准品浓度及其对应的RFU值分别标于X-轴(对数标度)和Y-轴(线性标度)，制作标准曲线。标准曲线的最适模型为四参数方程模型，经四参数Logistic函数曲线模型拟合，求得曲线斜率，IC50，及上下端渐进线间的线性范围，其数学模型为：

[0023]

[0024] 函数中A1为曲线的上端渐近线的估计值，A2为曲线下端渐近线的估计值，P为校正曲线的斜率，X0(IC50)为50％吸光度所对应的样品浓度值，通过拟合最优即拟合误差最小的曲线作为标准曲线，进而计算出未知样品浓度。Exendin-4浓度对数值与相应RFU值呈反S型的负相关，即当Exendin-4浓度升高时，RFU值下降。

[0025] 本发明基于竞争抑制法的以上原理，对待测样品中Exendin-4含量进行定量检测，检测范围为10-400pg/ml。

[0026] 作为优选，所述第二抗体浓度为5-30μg/ml。

[0027] 第二抗体简称二抗，是在其它宿主体内制备的能与一抗结合的抗体。二抗需与一抗的类别或亚类相匹配，如一抗是IgG类免疫球蛋白，相应的二抗就是抗IgG抗体；如果一抗是小鼠IgG，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgG抗体。在本发明的具体实施方式中，抗Exendin-4第一抗体为鼠源IgG，可选用的第二抗体为羊抗鼠IgG；抗Exendin-4第一抗体为兔源IgG，可选用的第二抗体为羊抗兔IgG。

[0028] 竞争性酶免疫分析方法常规选用一抗进行包被，但是包被用抗体一般是过量的，用量大，成本高。本发明选用成本很低的二抗进行包被，可节省成本。同时，用二抗包被可以提高方法的精密度和准确度，减少各孔之间的差异。常规选用一抗包被时，可能因为包被条件、清洗处理等各种因素而使该抗体包被量有所差异，影响试验结果。本方法先用过量的第二抗体包被固相载体，封闭后再加入等量的一抗，过量的第二抗体即使在数量上有所差异，也仍能保留足够的位点与第一抗体结合，这样即可避免孔间第一抗体数量上的差异，大大提高试验结果的精密度和准确度。

[0029] 作为优选，所述生物素标记Exendin-4浓度为1μg/ml。

[0030] 作为优选，所述Exendin-4标准品及样品的基质选自血清、血浆。

[0031] 作为优选，底物HPPA浓度为1.25mg/ml。

[0032] 作为优选，所述过氧化物溶液为30％双氧水。

[0033] 所述Exendin-4可通过基因工程重组或化学合成，是一种由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽。

[0034] 对本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法的重复性、特异性、方法稳定性进行考察，结果显示，板内和板间5次重复检测的精密度均小于15％，准确度均在±15％以内；样品的回收率在85-115％之间，精密度小于15％；高、中、低浓度质控样品冻融1次后、室温放置8小时、或者在-70℃放置3个月后，分别重复测定，结果显示高浓度与中浓度的精密度均小于15％，低浓度的精密度均小于20％；高浓度与中浓度的准确度均在±15％以内，低浓度的准确度均在±20％以内。

[0035] 对底物HPPA优化结果显示：本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法的底物HPPA的最佳浓度为1.25mg/ml，用缓冲液为pH7.5的PBS进行配制，达到最佳检测效果。

[0036] 与现有技术相比，本发明所述酶免疫分析方法具有如下优点：

[0037] 1、本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法灵敏度可以达到10pg，灵敏度来自酶的放大效应、生物素亲和素系统以及荧光底物HPPA的选择及优化，从而根据显色反应现象进行检测分析，解决了临床和非临床药代动力学试验中Exendin-4含量检测的问题。

[0038] 2、本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法采用竞争法进行检测，符合Exendin-4为小分子多肽的特点。

[0039] 3、本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法特异性强，其特异性来自抗体或抗原的选择性，抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性，符合临床和非临床试验的要求。

[0040] 4、本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法用第二抗体包被酶标板，封闭后再加入等量的一抗，与常规的一抗包被酶标板相比，不仅大大提高试验结果的精密度和准确度，减少各孔之间的差异，还降低了成本；另外，选用HPPA作为荧光底物，进一步降低了检测成本，具有良好的应用前景。

附图说明

[0041] 图1为本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法测定血浆Exendin-4浓度的四参数函数拟合标准曲线；

[0042] 图2示本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法中不同浓度底物HPPA的RFU值；

[0043] 图3示本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法中由不同pH值的PBS作为底物HPPA缓冲液对发光的影响。

具体实施方式

[0044] 本发明公开了一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0045] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0046] 实施例1：本发明所述定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法检测样品中Exendin-4含量

[0047] 1.试剂配制

[0048] 1)包被缓冲液(pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液)：

[0049] Na2CO3 1.59g

[0050] NaHCO3 2.93g

[0051] 加蒸馏水至1000ml。

[0052] 2)缓冲液PBS(pH7.4，0.1M)：

[0053] KH2PO4 0.2g

[0054] Na2HPO4 1.44g

[0055] NaCl 8.0g

[0056] KCl 0.2g

[0057] 加蒸馏水至1000ml。

[0058] 3)洗涤缓冲液PBST(pH7.4PBS+0.05％Tween-20)：

[0059] 1L PBS中加入Tween-200.5ml。

[0060] 4)封闭液(含1-5％B SA的PBST)：

[0061] 牛血清白蛋白(BSA)0.1-0.5g 加洗涤缓冲液至10ml。

[0062] 5)底物终止液(甘氨酸缓冲液)：

[0063] 50ml 0.2M甘氨酸，加入1M NaOH调节pH至10.3，稀释至200ml。

[0064] 2具体试验步骤：

[0065] 1).包被。用包被缓冲液(pH9.6，50mM)稀释羊抗鼠IgG纯化抗体，浓度为5-30μg/ml，每孔加入100μl，封膜，置于4℃冰箱中过夜。

[0066] 2).洗板。第二天，将酶标板从4℃冰箱中取出，倒掉孔内溶液，用PB ST缓冲液(0.05％Tween-20)洗板3次，每次5min。

[0067] 3).封闭。每孔加入200μl的1-5％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温孵育1h。洗板，方法见步骤2)。

[0068] 4).加鼠抗Exendin-4抗体(购自Abcam，货号：ab23407，批号：712880)。除空白对照孔外，其余各孔均加入50μl鼠抗Exendin-4抗体(1∶2000稀释)。室温孵育1h。洗板，方法见步骤2)。

[0069] 5).加标准品/样品。分别取50μl不同浓度的Exendin-4标准品(用空白人血浆系列稀释3.14mg/ml Exendin-4标准品，浓度分别为10000、1000、500、100、10、1pg/m1)、待测样品，加入预先设计的孔内，PB ST缓冲液作为阴性对照，并设阳性对照孔。

[0070] 6).加生物素标记Exendin-4。除空白对照孔外，其余各孔加入25μl浓度为1μg/ml的生物素标记Exendin-4，室温孵育1.5h。洗板，方法见步骤2)。

[0071] 7).加酶标链霉亲和素(Streptavidin/HRP)。各孔加入100μl 1∶1000稀释的酶标链霉亲和素，室温孵育1h。洗板，方法见步骤2)。

[0072] 8).加底物。HPPA底物液(浓度为0.5-2mg/ml，用pH7.5的PB S缓冲液进行配制)和30％双氧水混合，各孔加入100μl，室温避光孵育1h。

[0073] 9).加终止液。各孔加入100μl甘氨酸缓冲液终止反应。轻轻敲打荧光酶标板，使其混合均匀，20分钟内进入下一步骤。

[0074] 10).读数。将酶标板置于荧光酶标仪上，读取各孔的RFU值。激发(excitation)和发射(emission)波长分别为320和405nm。

[0075] 3结果计算：

[0076] 将已知Exendin-4标准品浓度及其对应的RFU值分别标于X-轴(对数标度)和Y-轴(线性标度)，见图1，结果说明Exendin-4浓度对数值与相应RFU值呈反S型的负相关，即当Exendin-4标准品浓度升高时，RFU值下降。标准曲线的最适模型为四参数方程模型，经四参数Logistic函数曲线模型拟合，求得曲线斜率，IC50，及上下端渐进线间的线性范围。其数学模型为：

[0077]

[0078] 函数中A1为曲线的上端渐近线的估计值，A2为曲线下端渐近线的估计值，P为校正曲线的斜率，X0(IC50)为50％吸光度所对应的样品浓度值，通过拟合最优即拟合误差最小的曲线作为标准曲线，进而计算出未知样品浓度。

[0079] 实施例2：本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法的重复性[0080] 制备高、中、低三个浓度(100、50和25pg/ml)的质控样品，板内每个质控浓度重复测定5次；板间每个质控浓度重复测定5次；计算方法的板内及板间精密度、准确度。精密度用变异系数(CV)表示，结果见表1-2。结果表明，板内和板间5次重复检测的精密度均小于15％，准确度均在±15％以内。

[0081] 表1.方法的板内重复性

[0082]

[0083] 表2.方法的板间重复性

[0084]

[0085] 实施例3：本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法的特异性[0086] 按照制备标准曲线的方法分别用5份不同个体的空白人血浆制成25pg/ml浓度的Exendin-4标准品，在标准曲线范围内进行测定，每样品重复5次，由标准曲线回归方程计算出检测浓度，计算回收率和精密度。检测结果如表3所示，样品的回收率在85-115％之间，精密度小于15％，符合要求。

[0087] 表3、特异性验证结果

[0088]

[0089] 实施例4：本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析法稳定性考察[0090] 考虑到样品分装及部分样品需要重复检测，有必要考查其冻融稳定性(样品冻融1次)，用空白人血浆配制好高、中、低三个浓度(100、50和25pg/ml)的质控样品，冻融一次后进行检测，结果见表4。

[0091] 另外，样品在离心以及检测过程中需要在室温(20-23℃)放置一段时间，因此需要对其室温放置稳定性进行考查，将配制的高、中、低三个浓度(100、50和25pg/ml)的质控样品室温放置8小时后进行测定，结果见表5。

[0092] 考虑到样品采集到检测需要间隔一段时间，因此有必要对其长期稳定性进行考查(在-70℃保存3个月)，用空白人血浆配制好高、中、低三个浓度(100、50和25pg/ml)的质控样品置于-70℃保存3个月后进行检测。每个浓度多次重复测定，计算精密度及准确度，结果见表6。

[0093] 稳定性验证结果见表4-6所示，高、中、低浓度质控样品冻融1次后、室温放置8小时、或者在-70℃放置3个月后，分别重复测定。结果显示高浓度与中浓度的精密度均小于15％，低浓度的精密度均小于20％；高浓度与中浓度的准确度均在±15％以内，低浓度的准确度均在±20％以内，符合要求。

[0094] 表4、冻融稳定性实验

[0095]

[0096] 表5、室温放置8小时稳定性实验

[0097]

[0098] 表6、长期(3个月)稳定性实验

[0099]

[0100] 实施例5：稀释倍数对本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法的影响[0101] 考虑到当血药浓度较高时，需要将其稀释到本方法的线性范围内，再进行测定，因此有必要考虑稀释倍数对结果的影响。用空白人血浆将浓度为1000pg/ml标准品Exendin-4分别稀释10倍、20倍、40倍后，得到高、中、低三个浓度样品，每个浓度测定4次，计算精密度和准确度。样品稀释倍数的影响见表7。精密度小于15％，准确度在±15％以内，符合要求。

[0102] 表7、稀释倍数影响

[0103]

[0104] 实施例6：本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法底物HPPA最佳浓度的优化

[0105] 无荧光HPPA在过氧化物酶的催化下，和双氧水反应1小时，以甘氨酸缓冲液终止酶反应，同时使荧光增强。HPPA脱氢生成一种荧光物质DPDPA，该荧光物质吸收320nm波长的光能后，发生原子重排，发射出405nm波长的光，在荧光酶标仪下可以检测到。

[0106]

[0107] 将HPPA倍比稀释(浓度分别为0.078、0.156、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10mg/ml)，在其它条件为最优的情况下，根据RFU值确定最佳工作浓度，RFU值越大，则相对分析误差越小。检测结果如图2所示，HPPA在浓度为1.25mg/ml时，RFU值达到最大。确定底物最佳浓度为1.25mg/ml，浓度范围为0.5-2mg/ml。

[0108] 实施例7：本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法底物HPPA的pH值的优化

[0109] 配制不同pH值的PBS缓冲液，用本发明所述方法进行检测，RFU值与pH关系的数据见表8及图3。可以看出，HPPA在碱性条件下，RFU值高(发光强度越大，则相对分析误差越小)，且RFU值变化不大。同时，辣根过氧化物酶的最适反应pH为中性，因此，选择pH7.5作为HPPA的反应pH。

[0110] 表8、HPPA溶液不同pH值对RFU的影响

[0111]

[0112] 实施例8：本发明所述定量检测Exendin-4酶免疫分析方法底物HPPA不同缓冲液的优化

[0113] 分别配制pH7.5的PBS、Tris-HCl、碳酸盐缓冲液(0.1M)，检测RFU值，结果如表9所示，以PBS为反应缓冲液配制HPPA底物溶液时RFU值最高，因发光强度越大，则相对分析误差越小，因此选择PBS为反应缓冲液。

[0114] 表9、配制HPPA的不同缓冲液的优化

[0115]1 2 Mean
PBS缓冲液 27234 28690 27962
Tris-HCl缓冲液 20703 21376 21039.5
碳酸盐缓冲液 22190 22870 22530

[0116] 由实施例6-8对HPPA底物溶液的优化结果显示：本发明定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法的底物HPPA的最佳浓度为1.25mg/ml，最佳缓冲液为pH7.5的PBS。

[0117] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。