一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物及其制备方法

摘要

一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物及其制备方法，涉及一种天然产物熊果酸的结构改造技术，将熊果酸C3位羟基氧化或乙酰化或形成肟基或形成乙酰氧亚氨基，C11位成羰基后C28位羧基与胺、氨基酸甲酯、氨基醇等进行的缩合反应已达到对熊果酸的结构改造，得到一系列熊果酸衍生物(Ⅰ1-11，Ⅱ1-3，Ⅲ1-5，Ⅳ1-3，Ⅴ1-9)。并测定其对人体宫颈癌HeLa细胞、人卵巢癌SKOV3细胞、人肝癌HepG2细胞和胃癌BGC-823细胞具有一定的抑制作用。其中熊果酸衍生物的结构如下所示：。

权利要求

1.一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物，其特征在于，所述的熊果酸化学修饰物为：

其中：

R1为乙酰氧亚氨基，R2为氢时，R3为-NHC6H5 ，-NHC6H4(o-CH2OH)， 。

2.一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物的制备方法，其特征在于， N- [3-乙酰氧亚氨基-乌苏烷型-12-烯-28-酰]-吗啉的制备包括如下步骤：将50mg、 0.1066mmol 3-肟基熊果酸溶解在4mL 四氢呋喃(THF)中，然后于室温下加入吡啶0.25mL和0.337g、3.3mmol乙酸酐和少量DMAP，室温下搅拌，以TLC检测反应终点，反应完毕，减压蒸除反应溶剂，以水分散固体，2mol/L盐酸调pH3～4，抽滤，滤饼水洗至中性，室温自然干燥， 粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=10/1(V/V)，得

3-乙酰氧亚氨基熊果酸40.2mg；

将50mg、 0.0978mmol 3-乙酰氧亚氨基熊果酸溶解在4mL二氯甲烷中，加入

0.3914mmol草酰氯，室温搅拌20小时，生成3-乙酰氧亚氨基-乌苏烷型-12-烯-28-酰氯，蒸除反应溶剂和未反应的草酰氯，残余物加入2mL环己烷，减压蒸除环己烷，反复操作2次；酰氯中加入2mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺调pH为9～10，搅拌5分钟后，加入33.64, 0.3912mmol吗啉，室温下反应，TLC监测反应终点；反应结束后，减压蒸除二氯甲烷，向反应液中加入2mL水，以2mol/L盐酸调pH至3～4，析出白色固体，减压抽滤，水洗滤饼至中性；室温干燥，粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=10/1(V/V)，得白色固体20.7mg。

说明书

一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种天然产物熊果酸的结构改造技术，特别是涉及一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物及其制备方法。

背景技术

[0002] 熊果酸(Ursolic acid, UA)又名乌索酸，乌苏酸，化学名为3β-Hydroxy -urs-12–en-28-oic acid，分子式C30H48O3，相对分子质量456.68, 熔点285~291℃。UA以游离形式或与糖结合成苷的形式分布于约7个科46个属62种植物。现代研究证明，熊果酸具有抗炎抑菌、抗肝炎、抗糖尿病、抗艾滋病病毒、降低血脂和抗动脉硬化等多种生物学效应和明显的抗氧化功能。同时熊果酸具有明显的抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成等作用，具有广谱的抗癌活性、良好的药用前景和开发价值。

[0003] 熊果酸的化学结构式：

[0004] 。

[0005] 近年来，熊果酸对肿瘤的抑制和杀伤效应日益受到重视。研究表明，熊果酸除了可以抑制DNA聚合酶及DNA拓扑酶活性、抑制细胞的增殖之外，还可以提高细胞内钙离子水平，激活半胱天冬酶(caspase)的蛋白酶解级联反应，诱导肺癌细胞A-549、白血病细胞P-388等多种肿瘤细胞凋亡。

[0006] 对具有多种生物活性的熊果酸为先导化合物，设计系列熊果酸的化学修饰物是目前非常重要的课题。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物及其制备方法，以具有多种生物活性的熊果酸为先导化合物，设计出一系列熊果酸的化学修饰物。

[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0009] 一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物，所述的熊果酸化学修饰物包括：

[0010] 一类结构式如下的熊果酸衍生物：

[0011]

[0012] 其中：R1为羰基或烷酰氧基或肟基或烷酰氧亚氨基；R2为羰基或氢；R3为脂肪胺基，芳胺基及取代芳胺基，苯肼基，醇氨基，苄氧基，吗啉基，酯氨基；

[0013] 熊果酸修饰物：

[0014] 其中：R1为羰基，R2为氢时，为化合物�，

[0015]

[0016] 其 中：R3 为 -NHC4H9，-NHC6H4(p-Cl)，-NHC6H4(p-CH3)，-NHC6H4(p-OCH3)，-NHC6H3(p-Cl)(o-F)，-NHNHC6H5，-NHCH2CH2OH，-NH(CH2)3OH，-NHCH(CH3)CH2OH，-NHCH(CH2C6H5)COO CH3，-NHCH2CH2COOCH3；

[0017] R1为羰基，R2为羰基时，为化合物Ⅱ，

[0018]

[0019] 其中：R3为-NHC6H11，-NHCH(CH3)CH2OH， ；

[0020] R1为乙酰氧基，R2为羰基时，为化合物Ⅲ，

[0021]

[0022] 其中：R3为-NHC6H5，-NHC6H11，-NHCH(CH3)CH2OH，

[0023] -NHCH(COOCH3)CH2CH(CH3)2；

[0024] R1为肟基，R2为氢时，为化合物Ⅳ，

[0025]

[0026] 其中： R3为-OBn，-NHNHC6H5，-NHC6H11；

[0027] R1为乙酰氧亚氨基，R2为氢时，为化合物Ⅴ，

[0028]

[0029] 其中：R3为 -OBn，-OC6H4(o-NO2)，-NH(CH2)3CH3，-NHC6H5，-N(CH2CH2CH2CH3)2，-NHCH2CH2OH，-NHC6H4(o-CH2OH)， 。

[0030] 一种抗肿瘤活性的熊果酸化学修饰物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

[0031] (1) 熊果酸和Jones试剂反应得3-氧代熊果酸；

[0032] (2) 3-氧代熊果酸与草酰氯反应，再与脂肪胺、取代芳胺、苯肼、氨基醇、氨基酸甲酯反应得化合物Ⅰ1-11 ；

[0033] (3) 3-氧代熊果酸与CrO3在5%醋酐的醋酸溶液中反应得中间体3,11-二氧代熊果酸，再与草酰氯反应，再与脂肪胺、氨基醇和杂环胺反应得化合物Ⅱ1-3 ；

[0034] (4) 熊果酸和醋酐在DMAP催化下反应得3-乙酰氧基熊果酸，再与CrO3在5%醋酐的醋酸溶液中反应得中间体3-乙酰氧基-11-羰基熊果酸；

[0035] (5) 3-乙酰氧基-11-羰基熊果酸与草酰氯反应，再与芳胺、脂肪胺、氨基醇、杂环胺和氨基酸甲酯反应得化合物Ⅲ1-5 ；

[0036] (6) 3-氧代熊果酸与盐酸羟胺在吡啶中反应得3-肟基熊果酸，与溴苄反应或与草酰氯反应，再与苯肼和环己胺反应得化合物Ⅳ1-3 ；

[0037] (7) 3-肟基熊果酸和醋酐在DMAP催化下反应得3-乙酰氧亚氨基熊果酸Ⅴ1 ；

[0038] (8) 3-乙酰氧亚氨基熊果酸与溴苄反应或与草酰氯反应，再与对硝基苯酚、脂肪胺、芳胺、氨基醇和杂环胺反应得化合物Ⅴ2-9 。

具体实施方式

[0039] 下面对本发明进行详细说明。

[0040] 1. 枇杷叶的乙醇提取浸膏以石油醚、1%氢氧化钠和水至洗出液无色，无水乙醇加热溶解，活性炭脱色，滤液放置析出白色结晶，以热甲醇重结晶得熊果酸(UA)。

[0041] 2. UA与Jones试剂在0℃下反应，经草酰氯活化后进一步在碱性条件下与脂肪胺、取代芳胺、苯肼、氨基醇、氨基酸甲酯反应得化合物Ⅰ1-11。

[0042]

[0043] 其中：R1为羰基，R2为氢，R3为 -NHC4H9，-NHC6H4(p-Cl)，-NHC6H4(p-CH3)，-NHC6H4(p-OCH3)，-NHC6H3(p-Cl)(o-F)，-NHNH C6H5，-NHCH2CH2OH，-NH(CH2)3OH，-NHCH(CH3)CH2OH，-NHCH(CH2C6H5) COOCH3，-NHCH2CH2COOCH3。

[0044] 3. 3,11-二氧代熊果酸与草酰氯在室温下反应，进一步在碱性条件下与脂肪胺、氨基醇和杂环胺反应得化合物Ⅱ1-3。

[0045]

[0046] 其中：R1为羰基，R2为羰基，R3为-NHC6H11，-NHCH(CH3)CH2OH， 。

[0047] 4. 3-乙酰氧基-11-羰基熊果酸与草酰氯在室温下反应，进一步在碱性条件下与芳胺、脂肪胺、氨基醇、杂环胺和氨基酸甲酯反应得化合物Ⅲ1-5。

[0048]

[0049] 其中：R1为乙酰氧基，R2为羰基，R3为-NHC6H5，-NHC6H11，-NHCH(CH3)CH2OH，，-NHCH(COOCH3)CH2CH(CH3)2

[0050] 5. 3-肟基熊果酸与溴苄反应或与草酰氯在室温下反应，进一步在碱性条件下与苯肼和环己胺反应得化合物Ⅳ1-3。

[0051]

[0052] 其中：R1为肟基，R2为氢，R3为-OBn，-NHNHC6H5，-NHC6H11 。

[0053] 6. 3-乙酰氧亚氨基熊果酸与溴苄反应或与草酰氯在常温下反应，进一步在碱性条件下与对硝基苯酚、脂肪胺、芳胺、氨基醇和杂环胺反应得化合物Ⅴ2-9。

[0054] 6.

[0055] 其中：R1为乙酰氧亚氨基，R2为氢，R3为 -OBn，-OC6H4(p-NO2)，-NH(CH2)3CH3，-NHC6H5，-N(CH2CH2CH2CH3)2，-NHCH2CH2 OH，-NHC6H4(o-CH2OH)， 。

[0056] 以吉非替尼和VP-16为阳性对照物，采用MTT法对熊果酸及所合成的化合物进行初步的体外抗肿瘤活性测试。研究表明所合成的化合物对人体宫颈癌(HeLa)细胞、人卵巢癌(SKOV3)细胞细胞、人肝癌细胞(HepG2)和胃癌(BGC-823)细胞具有一定的抑制作用，化合物结构及体外试验结果如表1、表2、表3和表4所示。

[0057] 表1 目标化合物对HeLa细胞的体外抗肿瘤活性

[0058]

[0059]

[0060] 注：a.化合物浓度在10-5mol/L时测得的抑制率；b. IC50表示半数有效抑制浓度。

[0061] 表2 目标化合物对SKOV3细胞的体外抗肿瘤活性

[0062]

[0063]

[0064] 注：a.化合物浓度在10-5mol/L时测得的抑制率，b. IC50表示半数有效抑制浓度。

[0065] 表3 目标化合物对HepG2细胞的体外抗肿瘤活性

[0066]

[0067]

[0068] 注：a.化合物浓度在10-5mol/L时测得的抑制率，b. IC50表示半数有效抑制浓度。

[0069] 表4 目标化合物对BGC-823细胞的体外抗肿瘤活性

[0070]

[0071]

[0072] 注：a.化合物浓度在10-5mol/L时测得的抑制率，b. IC50表示半数有效抑制浓度。

[0073] 下面结合实施例对本发明做进一步说明：

[0074] 实施例1

[0075] N-[3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-酰]-氨基乙醇(化合物Ⅰ7)的制备。

[0076] 将熊果酸（0.100g，0.22mmol）溶解于1.5mL丙酮中，0℃时将Jones试剂（0.4mL）缓慢滴加，升至室温反应，TLC控制反应终点，然后冷却至0℃，加异丙醇（5mL）室温搅拌30min淬灭其氧化性，减压抽滤，收集滤液，蒸除反应溶剂，加入适量饱和的食盐水5mL后, 再加入10 mL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并有机相，浓缩，真空干燥，得白色固体3-氧代熊果酸90.4 mg。将其（50mg, 0.1099mmol）溶解在4mL二氯甲烷中，加入草酰氯（0.4396mmol），室温搅拌20小时，生成3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-酰氯，蒸除反应溶剂和未反应的草酰氯，残余物加入2mL环己烷，减压蒸除环己烷，反复操作2次。酰氯中加入2mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺调pH为9～10，搅拌5分钟后，加入乙醇胺（26.82mg, 0.4396mmol），室温下反应，以TLC检测反应终点。反应结束后，向反应液中加入
2mL水，以2mol/L盐酸调pH至3～4，静置分层，分离有机相，向水相再加入3mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相。减压蒸馏，得白色固体N-[3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-酰]-氨基乙醇。粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=2.5/1（V/V），得白色粉末
1
状固体28.60mg，产率52.3%。mp 160~162℃; H-NMR (300MHz, CDCl3): δ 6.38 (s,
1H, NH), 5.37(s, 1H, H-12), 3.71(t, 2H, CH2OH), 3.43(m, 1H, NHCHa), 3.32(m,
1H, NHCHb), 2.51 (m, 1H, H-2b), 2.42 (m, 1H, H-2a), 1.13 (s, 3H, CH3), 1.11(s,
3H, CH3), 1.07 (s, 3H, CH3), 1.02 (d, 3H, CH3), 0.88 (s, 3H, CH3); ESI-MS: +
498.6(M+H)。

[0077] 实施例2

[0078] N-[3,11-二氧代-乌苏烷型-12-烯-28-酰]-吗啉(化合物Ⅱ3)的合成。

[0079] 将熊果酸（UA）(228mg, 0.5mmol) 溶解在15mL 5%乙酸酐的乙酸溶液中加入CrO399.6mg，反应混合液搅拌4小时。加入20mL水和20mL二氯甲烷，分层后，水层以20mL 二氯甲烷萃取两次，合并有机相，以饱和NaHCO3洗涤溶液至微碱性，再水洗至中性，无水Na2SO4干燥，减压抽滤，滤液减压脱溶得到绿色胶状物。经柱层析(石油醚/乙酸乙酯=3/1(V/V))纯化得产物3,11-二氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸。将其溶解在5mL二氯甲烷中，加入草酰氯（0.2mmol），室温搅拌20小时，生成3,11-二氧代-乌苏烷型-12-烯-28-酰氯，蒸除反应溶剂和未反应的草酰氯，残余物加入5mL环己烷，减压蒸除环己烷，反复操作两次。酰氯中加入5mL二氯甲烷，加三乙胺调pH至9～10，搅拌5分钟后，加入吗啉（0.3mmol），室温下反应，以TLC检测反应终点。反应结束后，减压蒸除二氯甲烷，反应液中加入5mL食盐水，以2mol/L盐酸调pH至3～4，析出白色固体，减压抽滤，水洗滤饼至中性。室温干燥，粗品
1
经硅胶柱色谱纯化，得白色粉末状固体29.4mg。产率：51.6% 。mp: 246～248℃. H-NMR (300MHz, CDCl3): δ 5.60 (s, 1H, H-12), 3.66~3.68 (m, 8H, N-CH2×4), 3.00 (m,
1H, H-18),2.67 (m, 1H, H-2), 2.36 (m, 1H, H-9), 1.19 (s, 3H, CH3), , 0.98 (d, +
3H, CH3)0.87 (d, 3H, CH3) ; ESI-MS: 538.5 (M+H)。

[0080] 实施例3

[0081] N-[3β-乙酰氧基-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰]-亮氨酸甲酯盐酸盐(化合物Ⅲ5)的制备。

[0082] 向装有磁力搅拌和熊果酸（300mg, 0.66mmol）的茄形瓶中加入四氢呋喃10mL，待熊果酸溶解后于室温下加入吡啶1mL、乙酸酐（19.8 mmol）和少量DMAP，室温下搅拌，反应完毕，减压蒸除反应溶剂，以水分散固体，2mol/L盐酸调pH3～4，抽滤，滤饼水洗至中性，室温自然干燥，得白色固体310mg, 粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=10/1（V/V），得白色固体3-乙酰氧基熊果酸228.4mg，产率为86.6%。取上述产物 100mg (0.2mmol) 溶解在15mL 5%乙酸酐的乙酸溶液中加入CrO3 99.6mg，反应混合液搅拌4小时。加入20mL水和20mL二氯甲烷，分层后，水层以20mL 二氯甲烷萃取两次，合并有机相，以饱和NaHCO3洗涤溶液至微碱性，再水洗至中性，无水Na2SO4干燥，减压抽滤，滤液减压脱溶得到浅绿色物。经柱层析(石油醚/乙酸乙酯=3/1(V/V))纯化得产物3β-乙酰氧基-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸，取其（50mg， 0.1mmol）溶解在5mL二氯甲烷中，加入草酰氯（0.2mmol），室温搅拌20小时，生成3β-乙酰氧基-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰氯，蒸除反应溶剂和未反应的草酰氯，残余物加入5mL环己烷，减压蒸除环己烷，反复操作两次。酰氯中加入5mL二氯甲烷，加三乙胺调pH至9～10，搅拌5分钟后，加入亮氨酸甲酯盐酸盐（0.3mmol），室温下反应，以TLC检测反应终点。反应结束后，减压蒸除二氯甲烷，反应液中加入5mL食盐水，以2mol/L盐酸调pH至3～4，析出白色固体，减压抽滤，水洗滤饼至中性。室温干燥，粗品经硅胶柱色谱纯化，得白色粉末状固体N-[3β-乙酰氧基-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰]-亮氨酸甲酯盐酸盐30mg。产率：49.1%。mp: 135~138℃.1
H-NMR (300MHz, CDCl3):δ 6.38 (s, 1H, NH),5.67 (s,1H,H-12), 4.53 (m, 1H, H-3),
3.70 (m, H, NCH), 1.10 (s, 3H, CH3), 0.90 (d, 3H, CH3) , 0.81 (d, 3H, CH3), +
0.70~0.76 (d, 6H, CH3×2); ESI-MS: 626.4 (M+H)。

[0083] 实施例4

[0084] N-[3-肟基-乌苏烷型 -12-烯-28-酰]-环己胺(化合物Ⅳ3)的制备。

[0085] 将3-氧代熊果酸(50 mg，0.11 mmol)溶于适量吡啶中，加盐酸羟胺(100 mg，1.44 mmol)，115℃下回流1.5 小时，反应完毕，倒入冰水中，产生大量白色沉淀，抽滤，水洗滤饼，干燥得白色固体3-肟基熊果酸42.8 mg，产率为82.96%。mp 215.6～218℃；IR (KBr): -1 -3417, 2919, 2850, 1688, 1649,1277,1183cm ; ESI-MS: 468.2(M-H)

[0086] 将3-肟基熊果酸(50mg, 0.1066mmol)溶解在4mL二氯甲烷中，加入草酰氯(0.4264mmol)，室温搅拌20小时，生成3-肟基-乌苏烷型-12-烯-28-酰氯，蒸除反应溶剂和未反应的草酰氯，残余物加入2mL环己烷，减压蒸除环己烷，反复操作2次。酰氯中加入2mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺调pH为9～10，搅拌5分钟后，加入环己胺(42.21mg, 0.4264mmol)，室温下反应，TLC监测反应终点。反应结束后，减压蒸除二氯甲烷，向反应液中加入2mL水，以2mol/L盐酸调pH至3～4，析出白色固体，减压抽滤，水洗滤饼至中性。室温干燥粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=5/1(V/V)，得白色粉末状固体19.4mg，产率为33.05%。mp 96.6~98.9℃；IR (KBr): 3357, 2927, 2853, 1732, -1 11634,1454cm ; H-NMR (300MHz, CDCl3): δ 7.73(s, 1H, CONH), 5.37(s, 1H, H-12),
3.37~3.39 (m, 1H, NCH), 2.58(d, 1H, H-18), 2.29(s, 1H, OH), 1.645~1.665(m,
10H, CH2×5), 1.33~1.38 (m, 2H, H-2), 1.11 (s, 6H, CH3×2), 1.07 (s, 3H, CH3),
1.05 (s,3H, CH3), 0.98(s,3H,CH3), 0.89 (d, 3H, CH3), 0.85(s, 3H, CH3); ESI-MS: +
587.5 (M+Cl)。

[0087] 实施例5

[0088] N- [3-乙酰氧亚氨基-乌苏烷型-12-烯-28-酰]-吗啉 (化合物Ⅴ9)的制备。

[0089] 将3-肟基熊果酸(50mg, 0.1066mmol)溶解在4mL 四氢呋喃(THF)中，然后于室温下加入吡啶0.25mL、乙酸酐 (0.337g, 3.3mmol)和少量DMAP，室温下搅拌，以TLC检测反应终点，反应完毕，减压蒸除反应溶剂，以水分散固体，2mol/L盐酸调pH3～4，抽滤，滤饼水洗至中性，室温自然干燥， 粗品用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=10/1(V/V)，得3-乙酰氧亚氨基熊果酸Ⅴ1 40.2mg，产率为73.80%。mp 87.5～91.4℃；-1 1
IR (KBr): 3290, 2926, 2855, 1747, 1696, 1653, 1233cm ; H-NMR (300MHz, CDCl3): δ 11.0(s, 1H, COOH),5.29 (s, 1H,H-12), 2.55 (d,1H,H-18), 2.18(s,3H,CH3COON),
1.33~1.38 (m, 2H, H-2), 1.11 (s, 6H, CH3×2), 1.07 (s, 3H, CH3), 1.05 (s,
3H, CH3), 0.98 (s, 3H, CH3), 0.89 (d, 3H, CH3), 0.85(s, 3H, CH3); ESI-MS: -
510.5(M-H)。

[0090] 将3-乙酰氧亚氨基熊果酸(50mg, 0.0978mmol)溶解在4mL二氯甲烷中，加入草酰氯(0.3914mmol)，室温搅拌20小时，生成3-乙酰氧亚氨基-乌苏烷型-12-烯-28-酰氯，蒸除反应溶剂和未反应的草酰氯，残余物加入2mL环己烷，减压蒸除环己烷，反复操作2次。酰氯中加入2mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺调pH为9～10，搅拌5分钟后，加入吗啉(33.64, 0.3912mmol)，室温下反应，TLC监测反应终点。反应结束后，减压蒸除二氯