桦木酮酸衍生物及其制备和应用

摘要

本发明涉及一种桦木酮酸衍生物及其制备和应用。以桦木酮酸或氢化桦木酮酸为原料，氮气保护、碱存在下与甲酸乙酯，草酸二乙酯，碳酸二乙酯或三氟乙酸乙酯缩合，25～66℃反应5～7小时，再与盐酸肼，盐酸羟胺或盐酸苯肼关环，78℃，反应1小时，所得产物经纯化得桦木酮酸衍生物，收率63％～85％。本发明通过在天然产物桦木酮酸C2，C3位引入并杂环，高效合成了系列新结构衍生物，工艺简便，且通过结构改造，显著增强了其抑制破骨细胞分化活性。

权利要求

1.一种桦木酮酸衍生物，其特征在于，该桦木酮酸衍生物具有如下结构：式中，R代表2-丙烯基或2-丙基，

当R为2-丙烯基取代时，杂环取代基Het分别为如下结构式当R为2-丙基取代时，杂环取代基Het的结构式为

2.一种制备权利要求1的桦木酮酸衍生物方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：式 中，R 代 表 2- 丙 烯 基 或 2- 丙 基；R’ 为 H、EtO2C，EtO 或 CF3；

当R为 2-丙 烯 基 取 代 时，杂 环 取 代 基Het分 别 为 如 下 结 构 式当R为2-丙基取代时，杂环取代基Het的结构式为第一步，将桦木酮酸或氢化桦木酮酸作为原料i，氮气保护和碱存在下，原料i与酰化试剂缩合反应，缩合反应温度控制在25°C~66°C之间，反应时间5~7小时，得到化合物ii，化合物ii无需纯化，直接用于下一步反应；

第二步，在氮气保护下，将1份质量盐酸肼，盐酸羟胺，或盐酸苯肼以及20-30份质量溶剂加入到1份质量化合物ii中，反应温度78°C，反应时间1小时，化合物ii与盐酸肼，盐酸羟胺，或盐酸苯肼关环，最后将所得产物经硅胶柱层析纯化得桦木酮酸衍生物I，收率

63%~85%；

上述第一步所用的碱是甲醇钠，或叔丁醇钾；

上述第一步的酰化试剂为甲酸乙酯，草酸二乙酯，碳酸二乙酯或三氟乙酸乙酯；

上述第二步的溶剂采用醇类和水，醇类为乙醇，两者的剂量为乙醇：水=10:0.76-0.8体积比。

3.根据权利要求2所述的制备桦木酮酸衍生物方法，其特征在于，所述的第一步中原料i与酰化试剂缩合反应是先将1份质量桦木酮酸i溶解于40份质量的无水四氢呋喃中，然后在氮气保护下加入0.5份质量的碱和0.7份质量的酰化试剂进行缩合反应。

4.一种如权利要求1所述的桦木酮酸衍生物在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

说明书

桦木酮酸衍生物及其制备和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种桦木酮酸衍生物及其制备和应用，应用是指作为破骨细胞分化抑制剂用于制备抗骨质疏松药物，属于药物及其制备和应用技术领域。

背景技术

[0002] 骨质疏松(Osteoporosis，OP)是一种与年龄相关的健康问题，以骨量减少和骨微结构退化为特征，致使骨的脆性增加而易于发生骨折的一种多因素所致的慢性系统性骨病(Sambrook P.et al.Lancet，2006，367，2010)。随着人类社会的老龄化，骨质疏松症发病率不断增加，据统计，我国1999年骨质疏松患者为1900万，预计到2050年将超过2亿。该病女性多于男性，尤其是绝经后妇女，骨质疏松症和骨折并发症发病率更高，男女比率约1∶8，严重影响老年人，尤其是老年妇女的生活质量。

[0003] 骨的新陈代谢由破骨细胞(Osteoclast)介导的骨吸收与成骨细胞(Osteoblast)介导的骨形成之间巧妙平衡来维持，这种平衡一旦破坏，就会发生骨代谢异常。当破骨细胞的活性远超过成骨细胞的活性时，骨量减少，从而导致骨质疏松症的发生；反之，如果成骨细胞活性过高则会导致骨骼石化症(Boyle W.J.et al.Nature，2003，423，337；Teitebaum S.L.et al.Science，2000，289，1504)。骨的新陈代谢分为三个步骤：即骨的吸收，骨的形成和骨基质的矿化。骨质疏松症实际上就是骨的新陈代谢失衡的结果，因此，治疗骨质疏松症的药物按照其作用也可分为三类：即抑制骨吸收，促进骨形成和促骨矿化。抑制骨吸收的药物包括雌激素、降钙素、双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂等，主要通过抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞的活性来抑制骨吸收和减缓骨钙丢失。促骨形成的药物包括甲状旁腺素、氟化物、他汀类药物、细胞控制因子等，此类药物能刺激成骨细胞活性，使新生骨组织及时矿化成骨，减低骨脆性，增加骨密度及骨量。促骨矿化药物主要为钙剂和活性维生素D(VD、阿法骨化醇、骨化二醇、骨化三醇、双氢速甾醇)，是防治骨质疏松症的基础用药。以上这些药物的使用均有一些局限性及副作用，如：雌激素的使用会增加乳腺癌、中风、血栓等危险性，因此不能长期使用；双膦酸盐不利于吸收，经常会产生胃肠道不适；甲状旁腺素不能口服，长期使用可能会产生骨肉瘤，一般最长推荐使用时间不超过2年。因此迫切需要人们开发新的，更有效、更安全的预防和治疗抗骨质疏松的新药。

[0004] 迄今，骨质疏松的治疗多以破骨细胞为靶点，可通过抑制破骨细胞前体分化成多核成熟的破骨细胞来降低骨降解速率、改善骨吸收。因此，抑制破骨细胞分化的骨吸收抑制剂是治疗骨质疏松的热点，正逐渐成为制药公司和各大药厂关注的焦点，这一类药物有望在未来几年成为治疗骨质疏松的一线药物而替代现有的临床用药。如欧洲人用药委员会(CHMP)于2009年12月份批准的安进公司(Amgen)的狄诺塞麦(Denosumab)是破骨细胞分化因子RANKL的单克隆抗体，能够与RANKL作用，中和成骨细胞分泌的RANKL，抑制破骨细胞的分化、成熟及活性，进而治疗骨质疏松(McClung MR.et al.N Engl J Med，2006，354，821)，该药品被认为有成为重磅炸弹药物的潜力。

[0005] 与人工合成的小分子化合物相比，天然产物在成药性方面具有先天的优越性，因此从天然产物、特别是从高安全性天然产物的有效成分入手，寻找新颖的母核结构并进行构效关系研究，是发现成药性好、安全性高的抗骨质疏松药物的重要途径。近年来，一些天然三萜类化合物被报道具有抑制破骨细胞分化的作用，如黑升麻醇的糖苷ACCX能够抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化、成熟(Qiu S.X.et al.Chem Biol，2007，14，860)；五环三萜类乳香酸衍生物AKBA同样可以抑制破骨细胞的分化、成熟(Takada Y.et al.J Immun，2006，176，3127)；白桦脂酸(Betulinic acid)及其衍生物在抗肿瘤、抗艾滋、抗炎(Takada Y.et al.J Immun，2003，171，3278；Saleem M.et al.Oncogene，2004，23，5203)等方面具有良好的生物活性，同时具有一定促进成骨细胞分化活性的功能(Lo Y.-C.et al，J.Agric.Food Chem.2010，58，6643)，也是我国民间用草药接骨木中的主要成分之一(CN200410051613.4)。

发明内容

[0006] 本发明的目的是通过对天然五环三萜类化合物桦木酮酸进行结构优化，得到活性更强的候选化合物桦木酮酸衍生物，为该类化合物进入临床研究奠定基础，为抗骨质疏松治疗药物研究提供条件。

[0007] 本发明提供的桦木酮酸衍生物具有如下结构通式：

[0008]

[0009] 式中，R 代表 2-丙 烯基 或2-丙 基，当R为2- 丙烯 基 时，Het分 别 为对 应 的 桦木酮酸衍生物依次用自行设计的代号XJ-479；XJ-551；XJ-495；XJ-552；XJ-496；XJ-547；
XJ-555表示。当R为2-丙基取代时，杂环取代基Het以及对应的桦木酮酸衍生物为和XJ-481。

[0010] 本发明的另一目的在于提供该类衍生物的制备方法。上述化合物I可通过以下步骤制得：

[0011]

[0012] 式中，R代表2-丙烯基或2-丙基；R’＝H、EtO2C，EtO或CF3；根据上述反应式，以桦木酮酸(R代表CH(CH3)＝CH2)或氢化桦木酮酸(R代表CH(CH3)2)i为原料，氮气保护、碱存在下分别与甲酸乙酯，草酸二乙酯，碳酸二乙酯，或三氟乙酸乙酯缩合得到化合物ii，溶剂为无水四氢呋喃，所用的碱包括甲醇钠，或叔丁醇钾，反应温度控制在25℃～66℃之间，反应时间5～7小时，所得化合物ii无需纯化，直接用于下一步反应，即化合物ii在氮气保护下，分别与盐酸肼，盐酸羟胺，或盐酸苯肼关环，溶剂采用醇类和水，醇主要为乙醇，反应温度78℃，反应时间1小时，所得产物经硅胶柱层析纯化得桦木酮酸衍生物I，收率63％～85％。

[0013] 本发明还有一个目的是该类桦木酮酸衍生物在治疗骨质疏松药物中的应用，通过对破骨细胞分化抑制活性筛选，发现上述方法得到的该类桦木酮酸衍生物具有显著抑制破骨细胞分化的活性。这类衍生物抑制破骨细胞分化的活性多数IC50＜5μM，高于五环三萜类天然产物白桦脂酸(IC50＝25μM)。

[0014] 本发明的优点在于通过对天然产物桦木酮酸进行结构改造，在C2，C3位引入系列并杂环，高效合成了系列新型的桦木酮酸衍生物，合成方法简便，且通过该部位的结构改造，显著增强了该类化合物抑制破骨细胞分化的活性。

具体实施方式

[0015] 实施例1：桦木酮酸衍生物XJ-479的制备

[0016] 0.5g桦木酮酸i溶解于20mL无水四氢呋喃中，氮气保护下加入0.24g甲醇钠、0.34mL甲酸乙酯，室温反应5小时，反应液浓缩，加入30mL水，乙酸乙酯(50mL×3)萃取，分出有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂乙酸乙酯后得0.4g化合物ii，无需提纯直接用于下一步。

[0017] 0.4g ii与0.56g盐酸肼加入10mL乙醇与0.76mL水的混合溶液中，氮气保护下回流1小时。反应液加入50mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂乙酸乙酯后所得粗产物用硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)得0.35g桦木酮酸衍生物I，用XJ-479代表，产率85％；

[0018] 1H-NMR(CDCl3)：7.22(1H，s)，4.76(1H，s)，4.62(1H，s，)，2.97(1H，m)2.63(1H，d，+J＝15Hz)；ESI-HRMS(m/z)[M+H] ＝479.3632。

[0019] 实施例2：桦木酮酸衍生物XJ-551的制备

[0020] 0.5g桦木酮酸i溶解于20mL无水四氢呋喃中，氮气保护下加入0.55g叔丁醇钾、1mL草酸二乙酯，室温反应5小时，蒸去溶剂四氢呋喃后，加入30mL水，乙酸乙酯(60mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水20mL洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得化合物0.5g化合物ii，无需提纯直接用于下一步。

[0021] 0.5g ii、0.56g盐酸肼及0.8mL水加入10mL乙醇中，氮气保护下加热，回流1小时，反应液冷却后加入50mL水，乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后所得粗产物用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝
1
3∶1)纯化得0.4g桦木酮酸衍生物XJ-551，产率72％；H-NMR(DMSO-d6)：13.2(1H，brs)，
12.2(1H，brs)，4.72(1H，s)，4.58(1H，s)，4.22(2H，q，J＝6.7Hz)，2.96(1H，m)，2.88(1H，+
d，J＝15.3Hz)，2.2(1H，m)，2.12(1H，d，J＝9.9Hz)，1.95(2H，m)；ESI-HRMS(m/z)[M+H] ＝
551.3843。

[0022] 实施例3：桦木酮酸衍生物XJ-552的制备

[0023] 采用类似于实施例2的方法制备XJ-552，不同之处在于以盐酸羟胺代替盐酸肼，1
得0.34g桦木酮酸衍生物XJ-552，产率71％；H-NMR(CDCl3)：4.68(1H，s)，4.56(1H，s)，
4.33(2H，q，J＝ 7.1Hz)，2.96(1H，m)2.72(1H，d，J＝ 16Hz)，2.21(2H，m)，1.91(3H，m)；
+
ESI-HRMS(m/z)[M+Na] ＝574.3503。

[0024] 实施例4：桦木酮酸衍生物XJ-495的制备

[0025] 0.5g桦木酮酸i与0.55g叔丁醇钾加入20ml无水THF与20ml碳酸二乙酯混合溶液中，氮气保护下加热回流反应7小时，反应液冷却后加入30mL水，乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得0.45g化合物ii，产物无需提纯直接用于下一步。

[0026] 0.45g ii，0.56g盐酸肼与0.76mL水加入10mL乙醇中，氮气保护下回流1小时，反应液冷却后加入50mL水，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后粗产品用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得0.39g1
桦木酮酸衍生物XJ-495，产率80％；H-NMR(DMSO-d6)：4.76(1H，s)，4.62(1H，s)，2.97(1H，+
m)，2.31(2H，m)，2.12(1H，d，J＝9.9Hz)；ESI-HRMS(m/z)[M+H] ＝495.3602。

[0027] 实施例5：桦木酮酸衍生物XJ-496的制备

[0028] 采用类似于实施例4的方法制备XJ-496，不同之处在于以盐酸羟胺代替盐酸肼，1
得0.40g桦木酮酸衍生物XJ-496，产率80％；H-NMR(DMSO-d6)：4.76(1H，s)，4.62(1H，s)，+
2.97(1H，m)2.23(2H，m)；ESI-HRMS(m/z)[M+Na] ＝518.3724。

[0029] 实施例6：桦木酮酸衍生物XJ-547的制备

[0030] 采用类似于实施例2的方法制备XJ-547，不同之处在于第一步以三氟乙酸乙酯代替草酸二乙酯为酰化试剂，0.45g桦木酮酸得0.37g桦木酮酸衍生物XJ-547，产率1
71％；H-NMR(DMSO-d6)：13.1(1H，s)，4.72(1H，s)，4.65(1H，s)，2.55(1H，d，J＝15.2Hz)，+
2.26(1H，m)，2.12(2H，m)；ESI-HRMS(m/z)[M+Na] ＝569.3325。

[0031] 实施例7：桦木酮酸衍生物XJ-555的制备

[0032] 采用类似于实施例1的方法制备XJ-555，不同之处在于第二步以盐酸苯肼代1
替盐酸肼，0.45g桦木酮酸得0.42g桦木酮酸衍生物XJ-555，产率78％；H-NMR(CDCl3)：
8.23-7.32(6H，s)，4.72(1H，s)，4.65(1H，s)，2.97(1H，m)2.63(1H，d，J＝15Hz)。

[0033] 实施例8：桦木酮酸衍生物XJ-481的制备

[0034] 采用类似于实施例1的方法制备XJ-481，不同之处在于第一步以0.45g自制氢化1
桦木酮酸为原料，得0.37g桦木酮酸衍生物XJ-481，产率63％。H-NMR(CDCl3)：7.22(1H，+
s)，2.97(1H，m)2.63(1H，d，J＝15Hz)；ESI-HRMS(m/z)[M+H] ＝481.3608。

[0035] 实施例1-8所用原料桦木酮酸或氢化桦木酮酸为市售分析纯。其他试剂均为市售分析纯。

[0036] 实施例9：桦木酮酸衍生物抑制破骨前体细胞分化测试

[0037] 原理：单核的破骨前体细胞系在分化细胞因子RANKL的诱导下，能够逐渐融合分化为多核的成熟破骨细胞。破骨前体细胞不具备溶解骨质的能力，只有分化成熟的破骨细胞才具有溶解骨质的能力，因此，破骨细胞的分化水平能够反应其溶骨能力。

[0038] 方法：将RAW264.7接种到96孔培养板中，3000细胞/孔。待细胞贴壁过夜后，设置对照组(加50ngl/mlRANKL)和实验组(加50ng/mlRANKL和5-20μM剂量桦木酮酸衍生物)组，隔天换液，培养3-5天。等对照组细胞融合完全后，用37℃预热的蒸馏水洗细胞一次，加入丙酮固定30秒，37℃预热的蒸馏水洗细胞三次，然后进行TRAP染色，在显微镜下计数TRAP阳性的多核细胞数(核多余3个)，得到破骨细胞形成百分数。首先选择5μM，10μM，20μM浓度的桦木酮酸衍生物进行抑制活性测试，如化合物在20μM浓度没有表现出明显的抑制活性，则不作进一步分析，如化合物在5μM浓度仍表现出较好的抑制活性，则进一步测试2.5μM，1μM，0.5μM及0.1μM的抑制活性。测试结果：筛选结果是当化合物为各种浓度时对破骨细胞分化的百分抑制率，百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数。

[0039] 桦木酮酸衍生物抑制破骨细胞前体RAW264.7分化的测试结果，见表1：

[0040] 表1

[0041]a

[0042] 百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数

[0043] 表1结果显示，化合物XJ-479，XJ-481在5μM浓度仍表现出很高的抑制活性，进一步测试其浓度为1μM，0.5μM及0.1μM的抑制活性，结果见表2。表2中的百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数。

[0044] 表2

[0045]

[0046] a百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数