一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法

摘要

本发明公开了一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，具体涉及从人血浆分离的组分IV-1中纯化α1-抗胰蛋白酶。本发明包括以下步骤：采用低温乙醇法制得血浆沉淀IV-1；将沉淀IV-1溶解于缓冲液中，加入冷乙醇沉淀，过滤，取上清A；上清A进行S/D病毒灭活；然后加入PEG沉淀，得到上清B，过滤，分别进行DEAE Sepharose fast flow离子交换层析，DEAE Sepharose CL 6B层析，洗涤，洗脱，收集洗脱液，超滤透析，巴氏灭活，除菌过滤，分装，冻干，得到α1-抗胰蛋白酶粉末。本发明所生产的人α1-抗胰蛋白酶不仅产率高、纯度高，制品的比活也比较高，而且还可以进行工业化、规模化生产。

权利要求

1.一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：

(a)采用低温乙醇法制得血浆沉淀IV-1；

(b)沉淀IV-1用缓冲液溶解；

(c)加入冷乙醇沉淀，所加的冷乙醇至乙醇浓度为8％～12％，调整pH5.2～5.6，搅拌，离心，离心液用滤器过滤，取上清A； (d)上清A溶液进行S/D病毒灭活，然后用PEG沉淀，取上清B；

(e)上清B用滤器过滤，过滤液用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析； (f)收集的蛋白液再经DEAE Sepharose CL 6B离子交换层析； (g)收集洗脱液，超滤，透析，巴氏灭活，除菌过滤，分装，冻干，得到α1-抗胰蛋白酶粉末。

2.根据权利要求1所述的一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤(a)中，所述的沉淀IV-1是通过以下步骤得来的：血浆加入生理盐水进行稀释，调整pH 7.0～7.4，加入乙醇至乙醇浓度为8％～10％，维持温度-3～-1℃，离子强度0.12～

0.14，搅拌，离心，得到上清I和沉淀I；上清I调整pH6.5～6.9，加入乙醇至乙醇浓度为

20％～25％，维持温度为-5～-3℃，离子强度0.08～0.10，搅拌，离心，得到上清II+III和沉淀II+III；上清II+III调整pH5.0～5.4，调整乙醇浓度为16％～19％，维持温度为-5～-3℃，离子强度0.07～0.09，搅拌，离心，得到上清IV-1和沉淀IV-1。

3.根据权利要求1或2所述的一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤(b)中所述的缓冲液是pH值为8.0～8.6的Tris缓冲液。

4.根据权利要求3所述的一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的滤器，其孔径大小为0.45μm。

5.根据权利要求3所述的一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤(d)中所述的PEG分子量为4000，浓度为10％～15％(g/ml)。

6.根据权利要求3所述的一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤(d)中所述的PEG沉淀是在溶液中加入PEG浓度至10％～15％(g/ml)，溶液的pH值为

5.0～5.5，温度为-1～1℃进行沉淀。

7.根据权利要求1所述的一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤(d)中所述的S/D病毒灭活是在上清A中按10∶1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐温-80溶 液，使磷酸三丁酯的最终浓度为0.3％(g/ml)，吐温-80的最终浓度为1％(g/ml)，在24～26℃条件下，孵育6小时。

8.根据权利要求1所述的一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤(g)中所述的巴氏灭活时，在洗脱液中加入3％～5％甘氨酸和3％～5％葡萄糖做保护剂。

说明书

一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法。

背景技术

[0002] 人α1-抗胰蛋白酶是一种大约分子量为52000-55000道尔顿(Da)的糖蛋白。此蛋白是由几个寡核苷酸共价连接的单链蛋白，它是一种内源性蛋白酶抑制剂，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰弹性蛋白酶、血管紧张肽原酶、皮肤胶原蛋白酶、脲激酶和分叶核淋巴细胞蛋白酶。

[0003] 与α1-抗胰蛋白酶缺乏直接相关的疾病主要是肺和肝脏疾病，慢性阻塞性肺病(COPD)是一种常见的慢性呼吸系统疾病，患病人数多，病死率高。其主要特征是慢性气流阻塞，并呈进行性发展，严重影响患者的劳动能力及生活质量。

[0004] 近来开始应用人α1-抗胰蛋白酶治疗由于α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的遗传性疾病和后天获得性α1-抗胰蛋白酶缺陷性疾病，获得了较好的治疗效果。给予α1-抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴细胞弹性蛋白酶。淋巴细胞弹性蛋白酶能破坏肺的外源蛋白。当α1-抗胰蛋白酶缺失时，不能很好地调节弹性蛋白酶的活性，使弹性蛋白酶就破坏肺组织导致肺组织损伤引起肺气肿，α1-抗胰蛋白酶能成功的用于治疗肺气肿、慢性气管炎和气管炎等。

[0005] 由于用于治疗的α1-抗胰蛋白酶基本上是来源人血浆，原料来源有限，为了满足临床病人的需求，应最大可能地提高血浆来源的α1-抗胰蛋白酶收获率，同时也要严格控制其纯度。现已公开的人α1-抗胰蛋白酶的生产方法，均提出收率高，但未公开其每吨血浆的回收率，因此无法获知规模化生产后制品的产量，而且实施例显示均为实验室规模生产，无法验证其能否实施规模化生产。我公司经过研究发明了一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，该方法以血液制品生产中的废料组分IV-1沉淀为原料，用酒精和PEG先沉淀大部分杂蛋白，使α1-抗胰蛋白酶的纯度达到60％～70％，再采用两步层析工艺，生产出高纯度的α1-抗胰蛋白酶，该生产工艺操作相对简单，生产成本较低，制品的回收率高，纯度高，比活也比较高，适合工业化规模化生产。而且制品的病毒灭活采用S/D灭活和巴氏灭活，对脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有效，保证了产品的病毒安全性。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，产品的回收率高、纯度高、比活高，可以工业化、规模化生产。

[0007] 本发明所提供的生产α1-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：

[0008] 血浆加入生理盐水进行稀释，调整溶液的pH值为7.0～7.4，加入乙醇至乙醇浓度为8％～10％，维持温度-3～-1℃，离子强度0.12～0.14，搅拌，离心，得到上清I和沉淀I；

[0009] 上清I调整pH值为6.5～6.9，加入乙醇至乙醇浓度为20％～25％，维持温度为-5～-3℃，离子强度0.08～0.10，搅拌，离心，得到上清II+III和沉淀II+III；

[0010] 上清II+III调整pH值为5.0～5.4，调整乙醇浓度为16％～19％，维持温度为-5～-3℃，离子强度0.07～0.09，搅拌，离心，得到上清IV-1和沉淀IV-1；

[0011] 沉淀IV-1用5～8倍缓冲液溶解，温度-3～-1℃，加入冷乙醇至乙醇浓度为8％～12％，pH5.2～5.6，搅拌，离心，离心液用0.45μm的滤器过滤，取上清A；

[0012] 上清A按10∶1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐温-80溶液(磷酸三丁酯的浓度为3.3％和吐温-80的浓度为11％)，使磷酸三丁酯的最终浓度为0.3％(g/ml)，吐温-80的最终浓度为1％(g/ml)，在24～26℃条件下，孵育6小时；然后加入PEG4000至其浓度为10％～15％(g/ml)，调整溶液的pH值为5.0～5.5，温度为-1～1℃，离心，取上清B；

[0013] 上清B用0.45μm的滤器过滤，过滤液用DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析，层析柱先用pH为6.8～7.2的磷酸盐缓冲液平衡，上样，收集流出蛋白峰；层析柱再生用0.5M的NaCl溶液冲洗。

[0014] 收集的蛋白液再经DEAE Sepharose CL 6B层析，先用0.01M pH6.2～6.8磷酸盐缓冲液平衡层析柱，用0.01M～0.03M pH6.2～6.8磷酸盐缓冲液洗涤，再用0.04M～0.06MpH6.2～6.8磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液用截留分子量为10KD的超滤器超滤，透析，加入3％～5％(g/ml)甘氨酸和3％～5％(g/ml)葡萄糖做保护剂，巴氏灭活，除菌过滤，分装，冻干，得到人α1-抗胰蛋白酶粉末。

[0015] 本发明一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其中：所述缓冲液是pH值为8.0～8.6的Tris缓冲液。

[0016] 本发明一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，每1000L血浆可回收人α1-抗胰蛋白酶300～400克，制品的纯度达到96％～99％，制品的比活达到0.7～1.0PEU/mg蛋白。

附图说明

[0017] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0018] 图1是本发明的工艺流程方框示意图。

具体实施方式

[0019] 实施例1、

[0020] 血浆1000L，加入1倍生理盐水进行稀释，用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH7.2，搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为8％，维持温度为-1℃，离子强度0.14，持续搅拌2小时，离心，得到上清I和沉淀I；

[0021] 上清I用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH6.7，搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为25％维持温度为-5℃，离子强度0.09，持续搅拌2小时，离心，得到上清II+III和沉淀II+III；

[0022] 上清II+III用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH5.2，搅拌条件下加入生理盐水调整乙醇浓度为18％，维持温度为-4℃，离子强度0.09，持续搅拌2小时，离心，得到上清IV-1和沉淀IV-1；

[0023] 沉淀IV-1用6倍pH值为8.0的Tris缓冲液溶解，温度-2℃，调节溶液的pH值为5.4，加入冷乙醇至乙醇浓度为12％，离心，离心液用0.45μm的滤器过滤，取上清A；

[0024] 上清A按10∶1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐温-80溶液(磷酸三丁酯的浓度为3.3％和吐温-80的浓度为11％)，使磷酸三丁酯的最终浓度为0.3％(g/ml)，吐温-80的最终浓度为1％(g/ml)，在24～26℃条件下，孵育6小时；然后加入PEG4000至其浓度为12％(g/ml)，调整溶液的pH值为5.1，温度为0℃，离心，取上清B；

[0025] 上清B用0.45μm的滤器过滤，过滤液用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析，收集流出蛋白峰。

[0026] 收集的蛋白液再经DEAE Sepharose CL 6B层析，用0.02M pH值为6.4的磷酸盐缓冲液洗涤，再用0.05M pH值为6.4的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液用截留分子量为10KD的超滤器超滤，透析，加入4％(g/ml)甘氨酸和4％(g/ml)葡萄糖做保护剂，进行巴氏灭活，灭活后除菌过滤，分装，冻干，得到人α1-抗胰蛋白酶粉末。检测结果见表1.[0027] 表1：结果分析

[0028]

[0029] 实施例2、

[0030] 血浆1000L，加入1倍生理盐水进行稀释，用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整溶液的pH值为7.0，搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为9％，维持温度为-2℃，离子强度0.14，持续搅拌2小时，离心，得到上清I和沉淀I；

[0031] 上清I用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH值为6.5，搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为21％维持温度为-3℃，离子强度0.08，持续搅拌2小时，离心，得到上清II+III和沉淀II+III；

[0032] 上清II+III用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH值为5.0，搅拌条件下加入生理盐水调整乙醇浓度为16％，维持温度为-3℃，离子强度0.08，持续搅拌2小时，离心，得到上清IV-1和沉淀IV-1；

[0033] 沉淀IV-1用5倍pH值为8.2的Tris缓冲液溶解，温度-1℃，调节溶液的pH值为5.2，加入冷乙醇至乙醇浓度为10％，离心，离心液用0.45μm的滤器过滤，取上清A；

[0034] 上清A按10∶1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐温-80溶液(磷酸三丁酯的浓度为3.3％和吐温-80的浓度为11％)，使磷酸三丁酯的最终浓度为0.3％(g/ml)，吐温-80的最终浓度为1％(g/ml)，在24～26℃条件下，孵育6小时；然后加入PEG4000至其浓度为10％(g/ml)，调整溶液的pH值为5.3，温度为-1℃，离心，取上清B；

[0035] 上清B用0.45μm的滤器过滤，过滤液用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析，收集流出蛋白峰。

[0036] 收集的蛋白液再经DEAE Sepharose CL 6B层析，用0.01M pH值为6.2的磷酸盐缓冲液洗涤，再用0.04M pH值为6.2的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液用截留分子量为10KD的超滤器超滤，透析，加入3％(g/ml)甘氨酸和3％(g/ml)葡萄糖做保护剂，进行巴氏灭活，灭活后除菌过滤，分装，冻干，得到人α1-抗胰蛋白酶粉末。检测结果见表2.[0037] 表2：结果分析

[0038]

[0039] 实施例3、

[0040] 血浆1000L加入1倍生理盐水进行稀释，用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整溶液的pH值为7.4，搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为10％，维持温度为-3℃，离子强度0.12，持续搅拌2小时，离心，得到上清I和沉淀I；

[0041] 上清I用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整溶液的pH值为6.9，搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为20％维持温度为-4℃，离子强度0.10，持续搅拌2小时，离心，得到上清II+III和沉淀II+III；

[0042] 上清II+III用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整溶液的pH值为5.4，搅拌条件下加入生理盐水调整乙醇浓度为19％，维持温度为-5℃，离子强度0.07，持续搅拌2小时，离心，得到上清IV-1和沉淀IV-1；

[0043] 沉淀IV-1用8倍pH值为8.4的Tris缓冲液溶解，温度0℃，调节溶液的pH值为5.6，加入冷乙醇至乙醇浓度为8％，离心，离心液用0.45μm的滤器过滤，取上清A；

[0044] 上清A按10∶1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐温-80溶液(磷酸三丁酯的浓度为3.3％和吐温-80的浓度为11％)，使磷酸三丁酯的最终浓度为0.3％(g/ml)，吐温-80的最终浓度为1％(g/ml)，在24～26℃条件下，孵育6小时；然后加入PEG4000至其浓度为15％(g/ml)，调整溶液的pH值为5.3，温度为1℃，离心，取上清B；

[0045] 上清B用0.45μm的滤器过滤，过滤液用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析，收集流出蛋白峰。

[0046] 收集的蛋白液再经DEAE Sepharose CL 6B层析，用0.03M pH值为6.8的磷酸盐缓冲液洗涤，再用0.06M pH值为6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液用截留分子量为10KD的超滤器超滤，透析，加入5％(g/ml)甘氨酸和5％(g/ml)葡萄糖做保护剂，进行巴氏灭活，灭活后除菌过滤，分装，冻干，得到人α1-抗胰蛋白酶粉末。检测结果见表3[0047] 表3：结果分析

[0048]

[0049] 以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。