一株小链霉菌及其应用

摘要

本发明公开了一株小链霉菌及其应用。本发明提供的小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168，其保藏号为CGMCC No.4570。本发明的实验证明，分离出一株来自土壤的具有抗病毒活性的小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168 CGMCC No.4570，对今后从微生物资源中筛选和开发抗病毒活性物质具有重要指导意义，也为Yn168小链霉菌抗病毒活性物质的分离和纯化研究奠定实验基础。

权利要求

1.小链霉菌（Streptomyces parvus）Yn168，其保藏号为CGMCC No.4570。

2.小链霉菌（Streptomyces parvus）Yn168 CGMCC No.4570在植物病毒病的生物防治中的应用；

或小链霉菌（Streptomyces parvus）Yn168 CGMCC No.4570在抑制植物病毒在植物体内或植物器官内增殖中的应用；

所述植物病毒病为烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、马铃薯Y病毒病或甜椒病毒病。

3.小链霉菌（Streptomyces parvus）Yn168 CGMCC No.4570在制备抗植物病毒病产品中的应用；

所述植物病毒病为烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、马铃薯Y病毒病或甜椒病毒病。

4.一种抗植物病毒病产品，其活性成分为小链霉菌（Streptomyces parvus）Yn168 CGMCC No.4570。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：

所述产品按照如下方法制备：发酵小链霉菌（Streptomyces parvus）Yn168CGMCC No.4570，收集发酵产物，即得到产品。

说明书

一株小链霉菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株小链霉菌及其应用。

背景技术

[0002] 放线菌作为最早发现的有生防效果的微生物，也是微生物中最具有潜力开发抗病毒活性物质的生物资源。随着放线菌生物多样性研究的进展，为发现新的生物活性物质提供了极大可能性。许多放线菌产生的抗生素和非抗生素对植物病毒都有一定程度的防治效果。

[0003] 链霉菌(Streptomyces)是产生抗生素最多的重要微生物类群，研究表明，抗生素主要由放线菌产生，而其中90％又由链霉菌产生，目前临床上应用的抗生素约三分之二来源于链霉菌属；作为一种具有丰富资源的微生物类群，链霉菌在生物防治中很有开发应用前景。尽管生物农药在一定时期内还不能取代化学农药，但随着对化学农药危害性的认识和使用条件的限制，放线菌中的链霉菌将成为一类有着广泛实际用途的微生物资源。

[0004] 链霉菌中不断有新的抗菌活性物质被分离出来。如，1997年El-Naggar报道了链霉菌Streptomyces nasri submutant H35产生的邻苯二甲酸二丁酯具有抗菌活性，2003年赵子翰等报道在黄灰链霉菌中分离到的一种多环酮类新抗生索，对革兰氏阳性菌显示了很强的抗菌活性；小链霉菌是Krainsky在1914年首先分离并命名的，之后有人发现了能产生抗细菌感染药物的小链霉菌菌株。总的来看，国内外有关小链霉菌的研究报道比较少。康银花、王旻等人在2008年报道了能有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗性菌株小链霉菌NIM521，并对其发酵工艺进行了优化研究；刘伟、徐涛等在2010年从厦门海域采集的海洋软体动物中分离得到一株具有广谱抗菌活性的小链霉菌DY2741，其发酵产物具有较强的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌均有较好的抑菌效果。但目前为止，能够产生抗植物病毒活性物质的该菌菌株尚未见报道。

[0005] 自抗生素问世以来，抗生素已广泛应用于许多细菌性感染的疾病上，但对于病毒性感染疾病的治疗，真正有效的抗生素非常少。尽管过去对产生抗生素的链霉菌的研究很广，但由于研究方法的制约，对这些抗生素的抗病毒活性了解甚少。现在所使用的有限的几种抗病毒药物，多数以核苷类药物为主，如加丰霉素、宁南霉素等，且大多都是偶然发现的。如除草霉素(Herbimycin)是在筛选除草剂过程中发现的安莎类抗生素，对烟草花叶病毒(TMV)有效，这是在安莎类抗生素中发现的第一个对TMV有效的真正的抗生素；还有一些有抗病毒活性的抗生素绝大多数是在抗癌物质筛选过程中发现的；日本和美国是农用抗生素研发的先进代表，自1980年以来平均每年申报一百多个新抗生素专利；我国从90年代以来，也先后筛选报道了一些具有自主知识产权的农用抗生素新品种，但目前我国实用化的农用抗病毒抗生素品种仅为宁南霉素一种，防治病毒病的高效、低毒的农用抗生素十分稀缺。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一株小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168。

[0007] 本发明提供小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168，其保藏号为CGMCC No.4570。

[0008] 小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168 CGMCC No.4570在植物病毒病的生物防治中的应用也是本发明保护的范围；

[0009] 小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168 CGMCC No.4570在抑制植物病毒在植物体内或植物器官内增殖中的应用也是本发明保护的范围。

[0010] 所述植物病毒为引发植物病毒病的病原菌，具体为烟草花叶病毒病的病原菌烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)、黄瓜花叶病毒病的病原菌黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)、马铃薯Y病毒病的病原菌马铃薯Y病毒(Potato virus Y)或甜椒病毒病的病原菌烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)。

[0011] 小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168 CGMCC No.4570在制备抗植物病毒病产品中的应用也是本发明保护的范围。

[0012] 上述应用中，所述植物病毒病为烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、马铃薯Y病毒病或甜椒病毒病。

[0013] 所述烟草花叶病毒病的病原菌为烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)；所述黄瓜花叶病毒病的病原菌为黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)；所述马铃薯Y病毒病的病原菌为马铃薯Y病毒(Potato virus Y)；所述甜椒病毒病的病原菌为烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)。

[0014] 本发明另一个目的是提供一种抗植物病毒病产品。

[0015] 本发明提供的产品，其活性成分为小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168CGMCC No.4570。

[0016] 所述产品按照如下方法制备：发酵小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168CGMCC No.4570，收集发酵产物，即得到产品。

[0017] 菌株Yn168的分类命名为小链霉菌(Streptomyces parvus)，已于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4570。

[0018] 本发明的实验证明，分离出一株来自土壤的具有抗病毒活性的小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168 CGMCC No.4570，该菌株的发酵产物能够抗烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)引起的烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)引起的黄瓜花叶病毒病；马铃薯Y病毒(Potato virus Y)引起的马铃薯Y病毒病，对今后从微生物资源中筛选和开发抗病毒活性物质具有重要指导意义，也为Yn168小链霉菌抗病毒活性物质的分离和纯化研究奠定实验基础。

附图说明

[0019] 图1为菌株Yn168的菌丝及孢子丝的显微形态(×1000)

[0020] 图2为半叶枯斑法检测Yn168发酵提取物对烟草花叶病毒的钝化作用具体实施方式

[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0022] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0023] 实施例1、菌株的分离、筛选及鉴定

[0024] 1、菌株的分离

[0025] 云南省丽江东巴谷山地草坡土壤中纯培养分离出一株菌株Yn168。将菌株Yn168接种在高氏1号斜面培养基(高氏1号斜面培养基：淀粉2.0g，琼脂1.2g，KNO30.1g，NaCl0.05g，K2HPO40.05g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，水100ml，PH 7.4～7.6，
121℃，30min灭菌。)上培养，培养条件为28℃培养箱，黑暗条件下培养15天。取出后置于
4℃保存。

[0026] 2、菌株鉴定

[0027] 对菌株Yn168进行形态特征、培养特性、生理生化特性、16SrDNA序列分析鉴定，具体如下：

[0028] 1)菌体的形态特征

[0029] 将菌株Yn168分别接种于GYM琼脂(配方：葡萄糖4.0g，酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，碳酸钙2.0g琼脂12.0g蒸馏水1000.0ml在加入琼脂前，用氢氧化钾将PH值调整到7.2)、酵母淀粉琼脂和燕麦粉琼脂(配方：燕麦粉浸液20g，琼脂18g，迹量盐溶液1ml，用蒸馏水补充至1000毫升，pH 7.2；迹量盐溶液：FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O，0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，蒸馏水100ml)上，28℃插片培养7天后，取片，用常规方法观察菌体的形态特征。

[0030] 结果如下：菌株Yn168革兰氏染色阳性；在GYM琼脂、酵母淀粉琼脂、燕麦粉琼脂等培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好、多分支；产生柔曲至松散螺旋的孢子丝，孢子球形至卵圆形、光滑。这些特征与链霉菌一致。拍照如图1所示。

[0031] 2)培养特性

[0032] 在高氏合成1号培养基、ISP4培养基(配方：可溶性淀粉10.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4·7H2O 0.001g，MnCl2·7H2O0.001g，PH7.2-7.4，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml)、GYM培养基、Bennett’s培养基(配方：酵母膏1.0g，牛肉膏1.0g，NZ Amine，type A 2.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.3)、酵母淀粉琼脂(购自中国普通微生物菌种管理保藏中心)和燕麦粉琼脂培养基这六种培养基上28℃培养7～14天后观察菌丝体的颜色及可溶性色素该菌株的培养特征，结果见表1：

[0033] 表1菌株的培养特征

[0034]培养基 气生菌丝 基内菌丝 可溶色素
高氏合成1号 白色 微黄色 无
ISP4 白色 淡黄色 无
GYM 白至微黄色 土黄色 无
Bennett’s 白色 淡黄色 无
酵母淀粉 白色 淡黄色 无
燕麦粉 白色 淡黄 无

[0035] 3)生理生化特性

[0036] 参照《放线菌的分类和鉴定》和《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.II的相关内容进行生理生化的鉴定。该菌株的生理生化特征见表2。

[0037] 表2菌株Q1的生理生化特征

[0038]

[0039] +，阳性；-，阴性

[0040] 4)16SrDNA序列分析

[0041] 用溶菌酶法从菌株Yn168的新鲜菌体提取基因组DNA，采用通用引物(引物A和引物B)进行16S rDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后直接用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit测序，电泳及数据收集用Applied Biosystems DNA Sequencer(model3730)自动进行。所测的16S rDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较，以确定该菌株分类地位。

[0042] 结果为该菌株的16S rDNA序列为序列表中的序列1。

[0043] 通用引物序列：引物A：5’-GCAAGTCGAACGATGAAACC-3’；

[0044] 引物B：5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’

[0045] 该菌株的16S rDNA序列与GenBank中相关序列Blast比较的结果表明，该菌株属于链霉菌属；与目前发表的相关菌株相比，该菌株的16S rDNA序列与小链霉菌(Streptomyces parvus)的序列一致，相似性为100％。

[0046] 从以上实验结果均可看出，菌株Yn168的分类命名为小链霉菌(Streptomyces parvus)，已于2011年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4570。

[0047] 实施例2、Yn168发酵提取物抗病毒活性检测

[0048] 1、Yn168发酵提取物的制备

[0049] 1)种子液的获得

[0050] 将小链霉菌(Streptomyces parvus)Yn168 CGMCC No.4570接种于种子培养基(种子培养基：葡萄糖2.0g，NaCl 1.0g，蛋白胨0.6g，酵母粉0.1g，水100ml，PH自然，121℃，30min灭菌)，在28℃，200r/min条件下恒温振荡培养24h，获得种子液。

[0051] 2)发酵

[0052] 按5％的接种量把上述1)得到的种子液接入发酵培养基中(发酵培养基：4.0g可溶性淀粉，4.0g葡萄糖，3.0g黄豆粉，1.5g蛋白胨，0.5g酵母粉，0.2g NaCl，0.5gCaCO3，用水补至100ml，PH自然，121℃，30min灭菌)，在28℃，200r/min(旋转半径为13mm)条件下恒温振荡培养6天，将以上获得的发酵产物5000rpm/min离心15min，沉降菌丝体及固形物，上清液用0.45微米的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液作为Yn168发酵提取物，放4℃保存备用。

[0053] 2、枯斑法检测Yn168发酵提取物在烟草上对TMV的防治效果

[0054] 1)枯斑法检测Yn168发酵提取物对TMV的钝化作用

[0055]

[0056] 选健康的8叶期三生烟(Nicotiana tabacum var samsun NN，田兆丰，于嘉林，刘伟成，裘季燕，刘德文，黄瓜花叶病毒(CMV)亚组I、II分离物生物学特性比较研究，华北农学报，2009，24(5)：1-5.，公众可从北京市农林科学院获得。)，剪取从上往下数第4至第6片真叶，选取大小一致，中脉左右匀称的叶片，按顺序放在铺有湿润纱布的白瓷盘中；

[0057] 取感染TMV(烟草花叶病毒Tobacco Mosaic Virus，引发烟草花叶病，田兆丰，裘季燕，刘伟成，魏荣，藜科植物S.L多糖抗病毒作用机理初步研究，华北农学报，2006，21(5)：108-112.公众可从北京市农林科学院获得。)的发病症状严重的普通烟叶片，与接种缓冲液(20mM磷酸缓冲液，pH 7.0)以0.1g/ml的比例研磨混匀，作为TMV病毒接种液；取上述得到的Yn168发酵提取物与病毒接种液1∶1混匀，半小时后蘸取接种液摩擦接种8叶期三生烟的左半边叶片；取接种缓冲液与病毒接种液1∶1混匀，半小时后摩擦接种右半边叶片作为对照；每个处理接种8个叶片，做3个重复处理；将放有接种叶片的铺有湿润纱布的白瓷盘盖上保鲜膜，置于25℃人工气候箱中培养。3d后记录处理和对照的枯斑数，计算钝化效果。

[0058] 2)、枯斑法检测Yn168发酵提取物对TMV的预防作用

[0059] 选健康的8叶期三生烟，打顶，留下3～4片真叶，在25℃左右，自然光照的日光温室内培养1周。喷施Yn168发酵提取物(喷施到叶面湿润为止)，以喷施蒸馏水为对照组。3天后，每叶摩擦接种浓度为0.1g/mLTMV病毒接种液(由发病症状严重的普通烟叶片，与接种缓冲液以0.1g/ml的比例研磨混匀即是病毒接种液)。每处理接种8株，重复3次。3d后记录处理和对照的枯斑数，计算预防效果。

[0060] 3)、枯斑法检测Yn168发酵提取物对TMV的治疗作用

[0061] 选健康的8叶期三生烟，打顶，留下3～4片真叶，在25℃左右，自然光照的日光温室内培养1周。每叶接种浓度为0.1g/mL的病毒接种液。3天后，喷施Yn168发酵提取物(喷施到叶面湿润为止)(以喷施清水为对照)，每处理接种8株，重复3次。3d后记录处理和对照的枯斑数，计算治疗效果。

[0062] 以上三个实验的结果如表1所示，

[0063] 表1小链霉菌Yn168发酵提取物对TMV的钝化、预防和治疗效果

[0064]

[0065] 注：抑制率(％)＝[(对照平均枯斑数-处理平均枯斑数)/对照平均枯斑数]×100。

[0066] 拍照观察如图2所示，叶片左半叶显示Yn168发酵提取物处理左半叶后病毒的侵染点，叶片右半叶显示对照右半叶病毒的侵染点。

[0067] 三生烟被TMV侵染后通过超敏感反应，使被侵染的细胞内发生复杂的生理生化反应，导致细胞膜和细胞结构的破坏，数小时后细胞开始破裂、解体，从而可见坏死斑的出现。细胞坏死限制了病毒由初侵染点向健康细胞的扩散，从而使健康细胞免受侵染。接种病毒的烟草叶片上的枯斑数代表了病毒建立的侵染点的数量。通过枯斑试验检测Yn168发酵提取物对TMV的钝化、预防和治疗作用，可以比较直接的观察药物对TMV的抑制作用。通过检测发现，此小链霉菌Yn168发酵提取物有抗病毒活性，对TMV有较好的钝化、预防和治疗效果(如表1)，其中钝化病毒的效果达84.2％，预防和治疗效果分别为68.7％、52.3％。

[0068] 3、叶圆片ELIAS法检测Yn168发酵提取物对CMV(Cucumber mosaic virus，黄瓜花叶病毒，引发黄瓜花叶病毒病)、PVY(Potato virus Y，马铃薯Y病毒，引发马铃薯Y病毒病)增殖的抑制作用

[0069] 本实验采用叶圆片ELIAS法检测Yn168发酵提取物对CMV增殖的抑制作用。所用试剂均为Sigma公司CMV、PVY ELISA试剂盒。

[0070] 选健康的8叶期普通烟(Nicotiana tabacum Linn.田兆丰，裘季燕，刘伟成，魏荣，藜科植物S.L多糖抗病毒作用机理初步研究，华北农学报，2006，21(5)：108-112.公众可从北京市农林科学院获得。)，打顶，留下3～4片真叶，在25℃左右，自然光照的日光温室内培养1周。分别接种浓度为0.1g/mL的CMV、PVY研磨液(黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)CMV，记载在田兆丰，裘季燕，刘伟成，魏蕾，刘德文，黄瓜花叶病毒番茄蕨叶分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析，华北农学报，2007，22(4)：203-206.中，公众可从北京市农林科学院获得；马铃薯Y病毒(Potato virus Y)PVY记载在王秀丽，李广存，高昌勇，张斌，陈利容，马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及全序列测定，中国马铃薯，2003，1：1-4.中，公众可从北京市农林科学院获得。)与上述的TMV病毒接种液的制备方法相同)，接种(蘸取适量进行摩擦接种)病毒6h后，用打孔器在叶脉两边对称打取直径12mm的叶圆片。对称叶片分别悬浮于上述Yn168发酵提取物(处理组)和蒸馏水(对照组)中，置于
25℃人工气候箱中培养(光照强度2000LX)，每组8个叶圆片，重复3次。为预防叶圆片腐烂，24h后将其取出放于润湿的滤纸上，继续在上述人工气候箱中培养(25℃，2000LX)48h，然后取出各组叶圆片与样品抽提缓冲液(试剂盒中自带)1∶10(g∶mL)研磨充分，作为ELISA待测样品。ELIAS按Sigma公司试剂盒实验步骤操作，通过显色反应检测OD405吸光值，计算病毒增殖抑制率。病毒增殖抑制率＝(对照OD405-处理OD405)/(对照OD405-阴性OD405)。

[0071] 阳性对照样品(是Sigma公司试剂盒中自带)。阴性对照样品取健康的普通烟叶片。

[0072] 结果如表2所示，

[0073] 表2小链霉菌Yn168发酵提取物对CMV和PVY增殖的抑制作用

[0074]

[0075] ELISA方法的检测结果可以间接反映病毒的含量水平，特异性强，灵敏度高。结合使用叶圆片法检测病毒增殖，比起使用整体植株可控性强，降低了植株个体差异带来的影响，结果更加可靠。本研究使用了叶圆片ELIAS方法检测发酵提取物对CMV和PVY的抑制作用，检测结果表明，Yn168发酵提取物对CMV、PVY在烟草寄主中的增殖抑制率分别为56.0％和46.4％。发酵活性物质对CMV的抑制作用明显强于对PVY的抑制作用。

[0076] 4、Yn168发酵提取物在甜椒盆栽试验中对TMV的防治效果

[0077] 1)盆栽甜椒药效实验检测Yn168发酵提取物对TMV的预防作用

[0078] 上海茄门甜椒(Capsicum annuum L.由北京京研益农科技发展中心出售)在25℃左右，自然光照的日光温室内培养至6叶期，处理组分别喷施Yn168发酵提取物的原液及其2倍和10倍稀释液(稀释液为水)(喷施至叶面湿润为止)，对照组喷清水(一般就用清水即可)；每处理喷施20株，共做4个重复；3d后接种浓度为0.1g/mL的TMV病毒接种液；接种后的幼苗置25℃左右，自然光照的日光温室内培养，20天后调查发病病级，计算病情指数及Yn168发酵提取物对病毒病的预防效果。

[0079] 甜椒病毒病分级标准：

[0080] 0级：不发病，无病症

[0081] 1级：新叶有明显明脉或轻微花叶，或约1/3叶片花叶，叶变小

[0082] 3级：1/3---1/2叶片花叶，叶片畸形，变小，病株比健株矮约1/3[0083] 5级：1/2---2/3叶片花叶，叶片畸形，变小，病株比健株矮约1/2[0084] 7级：全部叶片花叶、畸形、变小，病株比健株矮约1/2-3/4

[0085] 9级：植株枯死或接近枯死

[0086] 病情指数(Y)计算公式：

[0087] Y＝(各级病株数×该病级值)/调查总株数×最高级值×100

[0088] 2)盆栽甜椒药效实验检测Yn168发酵提取物对TMV的治疗作用

[0089] 上海茄门甜椒在25℃左右，自然光照的日光温室内培养至6叶期，处理组接种浓度为0.1g/mL的TMV病毒接种液，接种20株，共做4个重复；3d后分别喷施Yn168发酵提取物的原液及其2倍和10倍稀释液(喷施至叶面湿润为止)，对照组喷清水；接种后的幼苗置温室内常规管理(在25℃左右，自然光照的日光温室内培养)，20天后调查发病病级，计算病情指数及Yn168发酵提取物对病毒病的治疗效果。

[0090] 以上两个实验的结果如表3所示，

[0091] 表3小链霉菌Yn168发酵提取物对甜椒TMV病毒病预防和治疗作用的盆栽试验结果

[0092]

[0093] 根据表3结果可知，小链霉菌Yn168发酵提取物对TMV的预防效果显著高于治疗效果，Yn168发酵提取物的稀释倍数增大时，预防和治疗效果都随之降低。原Yn168发酵提取物处理的甜椒对TMV的预防和治疗效果分别为55.3％。、41.49％，而稀释10倍后的预防和治疗效果分别为31.85％。、26.04％，降低10％以上。所以，加强发酵工艺优化的研究，提高Yn168发酵提取物中活性物质的浓度将有助于获得更好的预防和治疗效果。这一结果同时也表明，目前对病毒病的防治还应以预防为主，治疗为辅。