本发明公开了一种通过原生质体不对称融合技术创制抗霜霉病结球甘蓝新种质的途径，解决目前生产上基本没有对十字花科霜霉菌没有高抗甚至免疫的结球甘蓝品种，以及克服远源杂交不亲和和基因工程技术难度大、投资高等问题。一种原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于携带抗霜霉病基因的抱子甘蓝为供体，供体的原生质体经过UV射线处理；对霜霉病敏感且具有其它优良经济和农艺性状的结球甘蓝为受体，通过原生质体不对称融合途径创制抗霜霉病结球甘蓝新种质， 本发明将抱子甘蓝抗霜霉病基因转入结球甘蓝，建立了利用原生质体融合；技术进行快速抗病新种质的选育体系，建立了现代甘蓝种质资源创新及抗病育种高效技术平台。
1.一种原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于携带抗霜霉病基因的抱子甘蓝为供体，供体的原生质体经过UV射线处理；对霜霉病敏感且具有其它优良经济和农艺性状的结球甘蓝为受体，通过原生质体不对称融合途径创制抗霜霉病结球甘蓝新种质，该新种质是采用下述方法得到的：（1）首先通过苗期人工接种，筛选获得抗十字花科霜霉病的抱子甘蓝基因型，作为抗性基因供体材料； （2）易感霜霉病受体结球甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化易感霜霉病结球甘蓝的下胚轴原生质体，获得受体结球甘蓝原生质体；
（3）抗霜霉病供体抱子甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化霜霉病抗性抱子甘蓝的叶肉原生质体，获得供体抱子甘蓝原生质体；
（4）利用0.075 J·cm UV射线处理上述的供体抱子甘蓝原生质体；
（5）用预融合液分别调整供体抱子甘蓝原生质体、受体结球甘蓝原生质体的浓度至
2×10 个·ml ，按1:1 的比例均匀混合得到原生质体悬液，将原生质体悬液用40％聚乙二醇融合液融合得到融合产物，原生质体培养基培养，于25℃暗培养；
（6）融合后原生质体的培养及不定芽诱导，杂种植株再生，得到抗霜霉结球甘蓝新种质：植株开展度45 cm，外叶深绿，叶柄长，蜡粉中，外叶数12片，叶球圆，球色绿，球叶厚，中心柱短，单球重0.7 kg，高抗霜霉病，自交亲和，配合力好；
所述的预融合液为：0.15 M 山梨醇、 0.03 M CaCl2·2H2O、0.075 M KCl、0.05M三羟甲基氨基甲烷盐酸， pH 7.2，过滤灭菌；
所述的40％聚乙二醇融合液为：40％PEG1450、0.3M 葡萄糖、 50mM CaCl2·2H2O，pH7.0，过滤灭菌；
所述的原生质体培养基为：B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分及150 -1 -1 -1 -1mg·L 水解酪蛋白、 875 mg·L 二水合氯化钙、 45500 mg·L 山梨醇、 45500 mg·L-1 -1 -1甘露醇、 2500 mg·L 葡萄糖、125 mg·L 2-脱氧-核糖、 0.5 mg·L 2,4-二氯苯氧乙-1 -1酸、 0.2 mg·L 萘乙酸、 0.2 mg·L 6-苄氨基嘌呤，pH 5.8 - 6.0，过滤灭菌。
2.按照权利要求1所述原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于步骤（2）中所述的受体结球甘蓝原生质体的具体的制备方法为：取在暗培养箱发芽
5 ~ 6 d的易感霜霉病结球甘蓝的下胚轴，放入加有5 mL原生质体培养基的培养皿中切段后，再加入5 mL质壁分离液，25℃暗培养1 h，质壁分离后，去分离液加入5 mL酶解液V，黑暗条件下，25℃、30 rpm震荡12 ~ 16 h酶解细胞壁，将酶解后的混合物用孔径50 ~ 80 μm的尼龙网过滤、滤液中加入清洗液W5，离心后收集酶液与清洗液溶液界面之间的原生质体，再用清洗液W5清洗2次，洗涤后得到的结球甘蓝下胚轴原生质体用原生质体培养基调浓度
至 2×10 个·ml ，获得受体结球甘蓝原生质体；
所述的质壁分离液为：54.6 g·L 山梨醇、7.4 g·L CaCl2·2H2O，pH 5.6 - 5.8，
所述的酶解液V为：将1.0%纤维素酶和0.1%离析酶溶解在含585 mg·L 2-（N-吗-1 -1 -1啡）乙基磺酸、100 mg·L 磷酸二氢钠、1 g·L CaCl2·2H2O 、 63.7 g·L 甘露醇、63.7 -1g·L 山梨醇的溶液中，pH 6.0，过滤灭菌；
所述的清洗液W5为：18.4 g·L 二水合氯化钙、 9.0 g·L 氯化钠、 0.8 g·L 氯化-1钾、1.0 g·L 葡萄糖，pH 5.6 - 5.8，121℃高压灭菌20 min。
3.按照权利要求1所述原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于步骤（3）中所述的供体抱子甘蓝原生质体的制备方法为：取15 ~ 20 d继代一次的抗霜霉病抱子甘蓝无菌组培苗的完全伸展幼叶2 ~ 3片，将其放入加有5 mL原生质体培养基的培养皿中切细条后，黑暗条件下，25℃质壁分离5 h，加入2 ~ 3 mL酶解液I，黑暗条件下，25℃、30 rpm， 12 ~ 16 h酶解细胞壁，将酶解后的混合物用孔径为50 ~ 80 μm的尼龙网过滤、滤液离心后，用 0.6 M的蔗糖8 mL加清洗液W5 2 mL重新悬浮细胞，离心，收集两溶液界面间的原生质体，用清洗液W5 溶液洗涤2 次，收集获得供体抱子甘蓝原生质体；
所述的酶解液I为：将2%纤维素酶、0.5%崩溃酶、 0.5%半纤维素酶和1.0% 果胶酶溶-1 -1 -1 -1解在含585 mg·L MES、 100 mg·L NaH2PO4、1 g·L CaCl2·2H2O、 63.7 g·L 甘露醇、 -1
63.7 g·L 山梨醇的溶液中，pH 6.0，过滤灭菌；
所述的清洗液W5为：18.4 g·L 二水合氯化钙、 9.0 g·L 氯化钠、 0.8 g·L 氯化-1钾、1.0 g·L 葡萄糖，pH 5.6 - 5.8，121℃高压灭菌20 min。
4.按照权利要求1所述原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于步骤（6）的培养方法为：融合产物培养3 ~ 7 d后，经显微镜观察到大量的细胞进入一次分裂时，加入细胞培养基，此后每3 d加入1次该培养基，同时进行观察杂种细胞的生长状态，待有细胞团出现时，转移到愈伤组织培养基中促使愈伤组织形成，同时转为正常光照培养；当愈伤组织长到1 ~ 5 mm时，转移愈伤组织到分化培养基中，诱导不定芽形成；当幼苗的真叶形成时，转移到无激素的MS基本培养基中，使再生植株正常生长并生根；整个培养过程均在25℃条件下进行；
所述的细胞培养基为：B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分及150 mg·L-1 -1 -1水解酪蛋白、2500 mg·L 葡萄糖、125 mg·L 2-脱氧-核糖、20000 mg·L 蔗糖、0.5 -1 -1 -1mg·L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg·L 萘乙酸、0.2 mg·L 6-苄氨基嘌呤，pH 5.8 - 6.0，过滤灭菌；
所述的愈伤组织培养基为：B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分及150 -1 -1 -1 -1mg·L 水解酪蛋白、30000 mg·L 蔗糖、0.5 mg·L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg·L 萘乙-1 -1酸、0.2 mg·L 6-苄氨基嘌呤、10000 mg·L 琼脂，pH5.8 - 6.0，121℃高压灭菌20 min；
所述的分化培养基为：MS基本培养基的大量元素和微量元素、B5基本培养基的有机成-1 -1 -1 -1分、 150 mg·L 水解酪蛋白、30000 mg·L 蔗糖、0.2 mg·L 萘乙酸、2.0 mg·L 6-苄氨-1基嘌呤、1000 mg·L 琼脂，pH5.8 - 6.0，121℃高压灭菌20 min。
原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物技术工程，具体来说涉及一种原生质体不对称融合创制抗霜霉病结球甘蓝新种质的育种途径。
背景技术
[0002] 甘蓝类蔬菜包括结球甘蓝、花椰菜、绿菜花、球茎甘蓝、芥蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝等，是我国人民喜爱并广为栽培的主要蔬菜类群之一。甘蓝霜霉病是由专性寄生菌寄生霜霉引起的一种世界性病害，这种真菌性病害常引起幼苗和成株叶片枯黄，导致产量降低，品质下降，给甘蓝生产上带来极大的损失。而且，目前生产上基本没有对霜霉菌高抗甚至免疫的结球甘蓝品种，所以选育抗霜霉病的结球甘蓝品种迫在眉睫。
[0003] 在长期自然选择下，抱子甘蓝有许多对病虫害具备高度抗性以至免疫力，要利用这些抗性基因，一个方法是克隆基因，并通过基因工程手段导入目标材料中。但是许多抗病性是受多基因控制，仅分离、导入一个基因，转基因材料获得的抗病性常不理想。而且，对于抗性基因的分析、定位、克隆和转化存在着技术难度大，周期长，投资高，以及市场的准入和接受程度等问题。另一个方法可以通过有性杂交的手段，向栽培品种引入抗性基因，但是物种间的生殖隔离使常规的有性杂交非常困难甚至不可能。借助非对称体细胞融合技术可以克服通过基因工程手段获得抗病品种遇到的难题，而且也避免了常规育种方法中远缘杂交不亲和的问题，同时与对称融合相比，由于形成的杂种中一般只含有供体的部分染色体，因此在提高杂种的育性及缩短育种年限等方面具有一定的优势。非对称体细胞融合技术实现不同物种间的抗性基因转移，是进一步创造新的育种基础材料的有效途径。
[0004] 在芸薹属作物中，Kartha等（1974）首次培养油菜叶肉原生质体再生植株后，直到80年代中期才在甘蓝、芥菜、芥蓝、大白菜上取得突破，培养技术日趋完善。采用原生质体融合形成异源四倍体、创造新型胞质或核质组合、转移人们感兴趣的远缘物种染色体片段或基因等方面也取得了很大的成绩。如邓秀新研究组（1997）通过柑桔体细胞杂交获得抗寒、抗高温和抗病的杂种后代，夏光敏等（2006）利用不对称体细胞杂交技术将近源植物的染色体小片段导入小麦体细胞中，创制耐盐、抗旱、高产、优质小麦新种质及新品种。所以采用非对称体细胞融合创制抗霜霉病结球甘蓝新种质是一条可行的、科学的途径，对于获得新的抗病种质，以及利用这些种质培育新的抗病品种具有长远的意义。
发明内容
[0005] 解决的问题：
[0006] 本发明是针对上述情况，利用通过聚乙二醇（PEG）介导的非对称原生质体融合，将抱子甘蓝的抗寄生霜霉基因转入具有优良性状的感病结球甘蓝中，得到具有抗霜霉病的优良结球甘蓝新种质，用于结球甘蓝霜霉病抗性育种。
[0007] 技术方案：
[0008] 原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于所述携带抗霜霉病基因的抱子甘蓝为供体，供体原生质体经过UV射线处理；感霜霉病的具有其他优良经济和农艺性状的结球甘蓝为受体，通过原生质体融合途径创制抗霜霉病结球甘蓝新种种质，该新种质是采用下述方法得到的：
[0009] （1）首先将收集的结球甘蓝霜霉病菌通过苗期人工接种，筛选获得抗十字花科霜霉病的抱子甘蓝基因型，作为抗性基因供体材料，其中该霜霉病菌是十字花科霜霉菌；
[0010] （2）受体结球甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化易感霜霉病结球甘蓝的下胚轴原生质体，获得受体结球甘蓝原生质体；
[0011] （3）供体抱子甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化抗霜霉病抱子甘蓝的叶肉原生质体，获得供体抱子甘蓝原生质体；
[0012] （4）利用0.075 J·cm-2 UV射线处理上述的供体抱子甘蓝原生质体；
[0013] （5）用预融合液分别调整供体抱子甘蓝原生质体、受体结球甘蓝原生质体的浓度6 -1
至2×10 个·ml ，按1:1 的比例均匀混合得到原生质体悬液，将原生质体悬液用40％聚乙二醇融合液融合得到融合产物；
[0014] （6）融合后原生质体的培养及不定芽诱导，杂种植株再生，得到抗霜霉结球甘蓝新种质B1011：植株开展度45 cm左右，外叶深绿，叶柄长，蜡粉中，外叶数12片，叶球圆，球色绿，球叶厚，中心柱短，单球重0.7 kg，高抗霜霉病，自交亲和，配合力好 。
[0015] 其中步骤（2）中所述的受体结球甘蓝原生质体的具体的制备方法为：取在暗培养箱发芽5 ~ 6 d的易感霜霉病结球甘蓝基因型的下胚轴，放入加有5 mL原生质体培养基的培养皿中切段后，再加入5 mL质壁分离液，25℃暗培养1 h，质壁分离后，去分离液加入5 mL酶解液V，黑暗条件下，25℃、30 rpm震荡12 ~ 16 h酶解细胞壁，将酶解后的混合物用孔径50 ~ 80 μm的尼龙网过滤、滤液中加入清洗液W5，离心后收集酶液与清洗液溶液界面之间的原生质体，再用W5清洗2次，洗涤后得到的结球甘蓝下胚轴原生质体用原生质体培养基
6 -1
调浓度至 2×10 个·ml ，获得受体结球甘蓝原生质体；
[0016] 所述的步骤（3）中所述的供体抱子甘蓝原生质体的制备方法为：取15 ~ 20 d继代一次的抗霜霉病抱子甘蓝无菌组培苗的完全伸展幼叶2 ~ 3片，将其放入加有5 mL原生质体培养基的培养皿中切细条后，黑暗条件下，25℃质壁分离5 h，加入2 ~ 3 mL酶解液I，黑暗条件下，25℃、30 rpm， 12 ~ 16 h酶解细胞壁，将酶解后的混合物用孔径为50 ~ 80 μm的尼龙网过滤、滤液离心后，用 0.6 M的蔗糖8 mL+清洗液W5 2 mL重新悬浮细胞，离心，收集两溶液界面间的原生质体，用清洗液W5 溶液洗涤2 次，洗涤后收集获得抱子甘蓝叶肉原生质体。
[0017] 其中步骤（6）的培养方法为：融合产物培养3 ~ 7 d后，经显微镜观察到大量的细胞进入一次分裂时，加入细胞培养基，此后每3 d加入1次该培养基，同时观察杂种细胞的生长状态，待有细胞团出现时，转移到愈伤组织培养基中促使愈伤组织形成，同时转为正常光照培养；当愈伤组织长到1 ~ 5 mm时，转移愈伤组织到分化培养基中，诱导不定芽形成。分离愈伤组织上形成的不定芽，转移到无激素的MS基本培养基中，使再生成为完整植株。
整个培养过程均在25℃，16h/8h(光/暗) 光周期条件下进行。
[0018] 携霜霉病抗性基因供体抱子甘蓝和具有优良经济和农艺性状感病受体结球甘蓝种子，由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。
[0019] 根据江苏省南京（受体结球甘蓝）、宜兴、泰州和浙江杭州、海宁不同地方田间结球甘蓝的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确所得病原菌是十字花科霜霉菌（即寄生霜霉）。同时收集这些地方的病原菌并进行活体培养、纯化，在抱子甘蓝拉十字期时进行苗期抗性鉴定，经鉴定发现抱子甘蓝对江浙一带寄生霜霉菌高抗甚至免疫；
[0020] 有益效果：
[0021] 霜霉病是影响结球甘蓝生产的一种严重病害。本发明是利用原生质体非对称融合方法，结合UV射线处理，将抱子甘蓝抗霜霉病基因转入感病结球甘蓝中，得到抗霜霉病兼具有优良经济和农艺性状的结球甘蓝新种质。利用原生质体非对称融合，不仅克服了基因克隆技术难度大，成本高等问题，及常规育种远源杂交不亲和等问题，通过原生质体融合创制抗霜霉病结球甘蓝将在结球甘蓝在结球甘蓝育种实践很有价值。从而克服了抱子甘蓝抗病基因的分离、克隆及转化等基因工程的技术难度大，周期长，投资高等缺点，同时也克服了抱子甘蓝与结球甘蓝常规育种种间杂交不亲和的问题。由于本研究所用抱子甘蓝材料对江浙一带地区专性寄生霜霉高抗，说明该材料对寄生霜霉病菌具有广谱的抗性。因此，利用原生质体融合得到的抗霜霉病优质结球甘蓝推动了结球甘蓝抗病育种，同时为结球甘蓝抗病育种提供了新的途径。
附图说明
[0022] 图1：抱子甘蓝和结球甘蓝原生质体不对称融合方案图；
[0023] 图2：结球甘蓝霜霉病菌图，寄生霜霉（Hyaloperonospora）；
[0024] 图3：甘蓝苗期霜霉病抗性鉴定；
[0025] 图4：结球甘蓝下胚轴原生质体；
[0026] 图5：抱子甘蓝叶肉原生质体；
[0027] 图6：融合后的杂合原生质体；
[0028] 图7：细胞团的形成；
[0029] 图8：愈伤组织的形成；
[0030] 图9：再生芽的培养；
[0031] 图10：再生植株。
[0032] 具体实施方式（结合表和附图具体说明）
[0033] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明实施方式不限于此。
[0034] 本发明所需培养基和各种溶液如下：
[0035] 原生质体培养基：B5基本培养基（Gamborg et al., 1976）的大量元素、微量元素-1 -1和有机成分+ 150 mg·L 水解酪蛋白（casein hydrolysate）+ 875 mg·L 二水合氯化-1 -1
钙（CaCl2·2H2O）+ 45500 mg·L 山梨醇（sorbitol）+ 45500 mg·L 甘露醇（mannitol）-1 -1
+ 2500 mg·L 葡萄糖（Glucose）+125 mg·L 2-脱氧-核糖（2-Deoxy-D-ribose）+ 0.5 -1 -1 -1
mg·L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）+ 0.2 mg·L 萘乙酸（NAA）+ 0.2 mg·L 6-苄氨基嘌呤（6-BA），pH 5.8 - 6.0，过滤灭菌。
[0036] 质壁分离液：54.6 g·L-1山梨醇+ 7.4 g·L-1 CaCl2·2H2O，pH 5.6 - 5.8，121℃高压灭菌20 min。
[0037] 酶解液V：1.0%纤维素酶（Cellulase R-10）+ 0.1%离析酶（Macerozyme R-10）-1 -1溶解在含585 mg·L 2-（N-吗啡）乙基磺酸（MES）+ 100 mg·L 磷酸二氢钠（NaH2PO4）+ -1 -1 -1
1 g·L CaCl2·2H2O + 63.7 g·L 甘露醇+ 63.7 g·L 山梨醇的溶液中，pH 6.0，过滤灭菌。
[0038] 酶解液I：2%纤维素酶+ 0.5%崩溃酶（Driselase）+ 0.5%（半纤维素酶） -1 -1（Hemicellulase）+ 1.0% 果胶酶（Pectinase）溶解在含585 mg·L MES+ 100 mg·L -1 -1 -1
NaH2PO4+ 1 g·L CaCl2·2H2O+ 63.7 g·L 甘露醇+ 63.7 g·L 山梨醇的溶液中，pH
6.0，过滤灭菌。
[0039] 清洗液W5：18.4 g·L-1二水合氯化钙+ 9.0 g·L-1氯化钠（NaCl）+ 0.8 g·L-1-1氯化钾（KCl）+ 1.0 g·L 葡萄糖，pH 5.6 - 5.8，121℃高压灭菌20 min。
[0040] UV溶液：54.6 g·L-1 山梨醇+ 7.4 g·L-1 CaCl2·2H2O，pH 5.6 - 5.8，121℃高压灭菌20 min。
[0041] 预融合液：0.15 M 山梨醇+ 0.03 M CaCl2·2H2O+ 0.075 M KCl+ 0.05M三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）， pH 7.2，过滤灭菌。
[0042] 40％聚乙二醇（PEG1450）的融合液：40％PEG1450+ 0.3M 葡萄糖+ 50mM CaCl2·2H2O，pH7.0，过滤灭菌。
[0043] PEG清洗液Ⅰ：13％PEG1450+ 0.1 M 葡萄糖+ 0.067 M 山梨醇+ 0.067 M CaCl2·2H2O，pH 7.0，过滤灭菌。
[0044] PEG清洗液Ⅱ：6.7％的PEG1450+ 0.05 M葡萄糖+ 0.083 M山梨醇+ 0.083 M CaCl2·2H2O，pH 7.0，过滤灭菌。
[0045] 细胞培养基：B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分+ 150 mg·L-1水解-1 -1 -1酪蛋白+ 2500 mg·L 葡萄糖+ 125 mg·L 2-脱氧-核糖+ 20000 mg·L 蔗糖+ 0.5 -1 -1 -1
mg·L 2,4-D + 0.2 mg·L NAA + 0.2 mg·L 6-BA，pH 5.8 - 6.0，过滤灭菌。
[0046] 愈伤组织培养基：B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分+ 150 mg·L-1-1 -1 -1 -1水解酪蛋白+ 30000 mg·L 蔗糖+ 0.5 mg·L 2,4-D+ 0.2 mg·L NAA+ 0.2 mg·L 6-BA -1
+ 10000 mg·L 琼脂，pH5.8 - 6.0，121℃高压灭菌20 min。
[0047] 分化培养基：MS基本培养基的大量元素和微量元素+ B5基本培养基的有机成分+ -1 -1 -1 -1150 mg·L 水解酪蛋白+ 30000 mg·L 蔗糖+ 0.2 mg·L NAA+ 2.0 mg·L 6-BA+ 1000 -1
mg·L 琼脂，pH5.8 - 6.0，121℃高压灭菌20 min。
[0048] 实施例1：
[0049] 首先确定受体感病结球甘蓝霜霉病是由十字花科寄生霜霉引起，并收集江浙一带十字花科寄生霜霉菌进行鉴定。同时将收集到的不同霜霉菌接种到抗病抱子甘蓝材料上，进行抗性鉴定，其具体方法如下：
[0050] 根据江苏宜兴、泰州、南京和浙江杭州、海宁田间感病结球甘蓝自然发病材料的病害症状，并对新鲜病叶处理培养后，发现叶背产生大量的霉状霉层，镜检观察其表型特征鉴定病原物：孢囊梗单生或丛生，无色，无隔，主枝基部稍膨大，重复的二叉分枝，顶部二叉状锐角分枝4 ~ 8次，顶端的小梗尖锐、向内弯曲稍作钳状；每端长1个孢子囊，孢子囊无色，单孢，卵形、椭圆形和圆形，无乳突；孢子囊一般是产生在特殊分化的孢囊梗上，孢子囊较易从孢囊梗上脱落。通过孢囊梗和孢子囊的特征，明确该病原菌是十字花科霜霉菌（即寄生霜霉）（如图2）。
[0051] 在抱子甘蓝拉十字期时，将所收集的不同地方的结球甘蓝十字花科霜霉菌活体培5 -1
养后，以1 × 10 孢子·mL 的孢子悬浮液（也可用在100倍显微镜下观察，其浓度为每视野平均孢子囊数50 ~ 100个）用于接种。接种材料置黑暗条件下培养24 h以便孢子萌发和穿透，温度保持10 ~ 20 ℃，相对湿度则控制在75 ~ 100％，随后在温度12 ~ 25 ℃，弱光照下培养。病情调查前，在20 ℃条件下，再次置黑暗条件下保湿培养24 h。采用五点法进行三次病情调查（调查标准主要参考李树德等编著《中国主要蔬菜抗病育种进展》，1995。）结果表明抱子甘蓝高抗十字花科霜霉菌（如图3，表1）。
[0052] 实施例2
[0053] 本发明涉及到原生质体非对称融合。首先得到受体感霜霉病结球甘蓝下胚轴原生质体和供体抗霜霉病抱子甘蓝叶肉原生质体，按照本实验室建立的芸苔属植物下胚轴及叶肉原生质体的分离纯化方法获得纯净原生质体。然后利用UV射线处理供体叶肉原生质体，具体步骤如下：
[0054] 1、结球甘蓝下胚轴原生质体的分离和纯化：以江苏省农业科学院选育的具有优良经济和农艺性状结球甘蓝为受体，将该品种种子经70%乙醇表面消毒30 s，然后用0.1%HgCI2溶液灭菌处理15 min，用无菌水冲洗3 ~ 5次，滤纸吸干后接种到无激素MS基本培养基上萌发，24 ℃暗培养5 ~ 6 d 后，取50 ~ 80个下胚轴，放入加有5 mL原生质体培养基的直径9 cm培养皿中，横切成0.1 ~ 0.5 mm小段后，将培养基吸出，再加入5 mL质壁分离液，用封口膜将培养皿封住，放入25℃暗培养箱中静置1 h，然后去掉质壁分离液，加入5 mL酶解液V，置摇床中25℃、30 rpm，黑暗条件下酶解12 ~ 16 h。然后用孔径50 ~
80 μm的尼龙网将酶解液过滤至无菌离心管中，沿管壁缓慢加入2 ~ 4 mL清洗液W5至10 mL，1100 rpm 离心10 min。收集酶液与清洗液W5溶液界面之间的原生质体于一个新的离心管中，用W5洗涤液洗涤两次，每次1000 rpm离心5 min。原生质体洗涤完毕后，用原生质
6 -1
体培养基调浓度至 2×10 个·mL ，用于原生质体融合（如图4）。
[0055] 2、供体抱子甘蓝叶肉原生质体的分离和纯化：以实施例1中筛选出的霜霉病抗性抱子甘蓝基因型为供体，种子消毒灭菌同结球甘蓝，无菌苗培养在MS基本培养基中，每15 ~ 20 d天继代一次，实验中取无菌组培苗完全伸展的幼叶2 ~ 3片，将其放入加有5 mL原生质体培养基的培养皿中，切成0.5 ~ 1 mm宽的细条，培养皿用封口膜封住，放入暗培养箱中，25℃质壁分离5 h。然后加入2 ~ 3 mL的酶解液I，置摇床中25℃、30 rpm，黑暗条件下酶解12 ~ 16 h。然后用孔径为50 ~ 80 μm的尼龙网将滤液过滤至无菌的离心管中，1000 rpm离心5 min。倒掉上清液，用 0.6 M的蔗糖8 mL重新悬浮细胞，再缓慢加入清洗液W52 mL，形成梯度液层，1100 rpm 离心10 min。收集两溶液界面间的原生质体于一个新的离心管中，再用清洗液W5 溶液洗涤2 次，每次1000 rpm离心5 min。原生质体洗涤完毕后，可继续进行UV处理（如图5）。
[0056] 3、UV射线处理供体抱子甘蓝叶肉原生质体：用UV溶液调整实施例2得到的抱6 -1
子甘蓝叶肉原生质体浓度为1×10 个·mL ，放入培养皿，在皿底形成一薄层，以保证原生质体的厚度为1 ~ 2层细胞，放入紫外交联仪（CEX-800 Electronic UV Crosslinker, -2
ULTRALUM, Inc.），紫外线辐照剂量为0.075 J·cm 进行UV处理，处理后将原生质体移入一个新的离心管中，1000 rpm离心5 min。倒掉上清液，收集叶肉原生质体以用于原生质体融合。
[0057] 实施例3
[0058] 本发明所涉及的不对称原生质体融合，是采用聚乙二醇（PEG） 融合法，步骤如下：6 -1
用预融合液分别调整供体抱子甘蓝、受体结球甘蓝原生质体浓度至2×10·mL ，按1:1 的比例均匀混合得到原生质体悬液。在直径为6 cm的无菌培养皿中均匀分布7 滴混合原生质体溶液，每滴40 μL，静止放置10 min，使原生质体沉积在培养皿底部，然后在每滴两侧加60 μL含 40％聚乙二醇（PEG1450）的融合液，静止5 min，促进原生质体融合，稍微倾斜培养皿，沿原生质体悬液边缘吸去培养皿中的混合液，随即小心加入2 mL PEG清洗液Ⅰ，静止5 min 后吸去，再小心加入2 mL PEG清洗液Ⅱ，静止5 min 后去掉。用原生质体培养基
5 6
洗涤培养皿两次，再加入2 mL原生质体液体培养基，混匀，调整原生质体密度为10 ~ 10-1
个·mL ，于25℃暗培养。
[0059] 实施例4
[0060] 本发明所涉及的杂种细胞培养及再生植株诱导，也是获得抗霜霉病结球甘蓝新种质的重要环节，具体步骤如下：
[0061] 1、杂种细胞培养及再生植株诱导：将上述融合的原生质体在原生质体培养基中培养3 ~ 7 d左右，当观察到较多量的细胞进入一次分裂时，向每培养皿中加入400μL细胞培养基，此后每3 d加入1次细胞培养基，大约15 d以后有细胞团出现时，转移到愈伤组织培养基中促使愈伤组织形成，同时转为正常光照培养。当愈伤组织长到约5 mm时, 转移愈伤组织到分化培养基中,诱导不定芽形成。当幼苗的真叶形成时, 转移到无激素的MS基本培养基中使再生植株正常生长并生根。上述培养过程的培养温度均为25℃。
[0062] 2、原生质体杂合细胞鉴定：由于叶肉原生质体具有绿色的叶绿体，而来源于暗培养的下胚轴原生质体为近白色，因此融合的细胞中有明显的叶绿体及白色细胞质存在（如图6）。此特征可以作为早期鉴别杂种细胞的标志。据此计算，本融合处理条件下，融合原生质体培养1 d后，随机选择3个培养皿进行观察（显微镜视野下杂种细胞个数/视野里总的细胞数，5个视野取其平均值），计算原生质体的异源融合率为12.32%（如表2）。培养3 ~5 d后，观察到细胞进入１~ 2次分裂，12 d后看到大的细胞团（如图7），18 d左右有星状细胞团出现，此时转入愈伤组织培养基。40 ~ 50 d后愈伤组织约1 ~ 5 mm大小（如图8），将它们转入分化培养基上，诱导不定芽的形成（如图9）。在幼苗的真叶形成后，及时转到无激素的MS基本培养基中可获得生长正常的植株（如图10）。
[0063] 3、杂合体结球甘蓝基本特征和抗性鉴定：将获得在幼苗的真叶形成后，及时转到无激素的MS基本培养基中可获得生长正常的植株，选择植株开展度45 cm左右，外叶深绿，叶柄长，蜡粉中，外叶数12片左右，叶球圆，球色绿，球叶厚，单球重0.7 kg，自交亲和，配合力好。 将所得到的B1011株系进行苗期十字花科霜霉菌抗性鉴定，鉴定病源菌和方法同携抗病基因供体抱子甘蓝抗霜霉病鉴定（图3），鉴定结果发现B1011在不同地方高抗霜霉菌（表1）。
[0064] 表1 供体抱子甘蓝和杂合体结球甘蓝对不同地方十字花科霜霉菌种抗性鉴定[0065]
[0066] 表2 抱子甘蓝和结球甘蓝原生质体异融合率（%）
[0067]
