水稻细条病抗性相关基因NRRB及其编码蛋白与应用

摘要

水稻细条病抗性相关基因NRRB及其编码蛋白与应用。涉及水稻基因，提供水稻细条病抗性相关基因NRRB及其编码蛋白与应用。水稻细条病抗性相关基因NRRB可用于提高水稻对细菌条斑病的抗性，培育细菌条斑病抗性增强的水稻。水稻细条病相关基因NRRB的RNA干扰转基因植株株系的细菌条斑病病斑平均长度在T0和T1代均显著小于对照，表明该基因的RNA干扰转基因植株能够显著提高水稻对细菌条斑病的抗性。为培育细菌条斑病抗性增强的水稻提供了一条重要途径。生产上栽培细菌条斑病抗性增强的水稻，对减少农药使用、增加粮食产量等具有重要意义。

权利要求

1.水稻细条病抗性相关基因NRRB在培育细菌条斑病抗性增强的水稻中的应用，所述水稻细条病抗性相关基因NRRB的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：1；所述水稻细条病抗性相关基因NRRB编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：2。

2.如权利要求1所述水稻细条病抗性相关基因NRRB在培育细菌条斑病抗性增强的水稻中的应用，其特征在于采用如下方法：构建所述水稻细条病相关基因NRRB的RNA干扰表达载体，并将其转化到水稻，筛选获得所述细菌条斑病抗性增强的水稻；所述构建所述水稻细条病相关基因NRRB的RNA干扰表达载体的方法是选择NRRB基因cDNA的5’端346bp核酸序列，合成一对引物NRRB-f和NRRB-r：NRRB-f：caccttagtt aatcagttgggaac；

NRRB-r：atgctcatcg gaatcatctg；

其中正向引物NRRB-f中引入TOPO克隆识别位点，用上述引物，并以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得NRRB基因cDNA的5’端346bp核酸序列，用TOPO克隆方法将基因DNA片断克隆于pENTR/D-TOPO载体上；再通过Gateway LR重组反应将NRRB基因cDNA的5’端346bpDNA片段连接到RNA干扰表达盒pH7GWIWG2(II)中；

所述表达载体为Ti类质粒载体；

所述转化采用农杆菌介导转化法或基因枪介导转化法。

说明书

水稻细条病抗性相关基因NRRB及其编码蛋白与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及水稻基因，特别涉及水稻细条病抗性相关基因NRRB及其编码蛋白与应用。

背景技术

[0002] 水稻细菌条斑病(Bacterial Leaf Streak，简称为细条病)是水稻生产中的一个重要病害，属于全国农业植物检疫性对象。该病害于1918年在菲律宾首次报道，而在中国最早于1953年发现于珠江三角洲。细条病在国内主要分布于华南稻区，近年来在长江流域杂交晚稻上亦有大面积发生。杂交稻对水稻细条病极为敏感，随着杂交稻的大面积推广，水稻细条病已上升为华南、中南稻区的主要细菌病害，其危害程度已超过水稻白叶枯病，减产可达5％～25％。此外，水稻细菌条斑病在东南亚各国和非洲中部也有发生。由此可见，水稻细条病具有分布广、危害严重的特点。水稻细条病的病原菌为稻生黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola)，属薄壁菌门黄单胞杆菌科黄单胞杆菌属。通过加强检疫，杜绝病菌传播，选用抗病品种，培育无病壮秧，加强肥水管理和及时进行用药控制等措施在一定程度上可以预防和控制细菌性条斑病发生和为害。现有的抗细条病水稻资源仅限于一些地方古老品种且性状较差，这限制了它们在生产上的应用。而使用化学药剂进行防治，具有效果不够理想，病原菌容易产生抗药性和污染环境等缺点。利用生物技术挖掘细条病抗性相关基因，并将其用于水稻品种改良，培育抗细条病水稻品种，为控制水稻细条病，提高水稻产量，开辟了一条新的道路。

[0003] 在植物中，通过增强或者干扰某个或某些相关基因(尤其抗性相关基因)的表达可以提高植物对病害的抗性。其中干扰基因表达的方法有超量表达正义基因、基因反义表达、双链RNA介导的RNA干扰和人工微小RNA干扰等多种，而RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，即双链RNA介导的特异性基因沉默是较为有效而易行的干扰基因表达方法之一。一些研究表明，表达发夹式双链RNA(hairpin RNAi)比表达一般双链RNA(非发夹式)具有更好的干扰效果。这种表达发夹式双链RNA的RNAi技术显著特征是在正义DNA序列和反义序列之间加入一个内含子，而使经过转录加工和拼接后产生的双链RNA呈发夹结构，这样更能有效引起靶标基因mRNA的降解(1、Smith，N.A.，S.P.Singh，et al.Total silencing by intron-splicedhairpin RNAs[J].Nature.2000.407(6802)：319-320；2、Wesley，S.V.，C.A.Helliwell，et al.Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants[J].PlantJ.2001.27(6)：581-590)。

[0004] RNAi技术在植物性状改良应用方面的报道很多，有研究报道，通过RNAi技术干扰棉花中脂肪酸脱饱和酶基因的表达可改良棉籽油成分(3、Liu，Q.，S.P.Singh，et al.High-stearic andHigh-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional genesilencing[J].Plant Physiol.2002.129(4)：1732-1743.)；另有研究表明，用RNAi技术抑制黄苷甲基转移酶基因CaMXMT1的表达可以降低转基因植株中可可碱和咖啡因的含量，从而有望获得脱咖啡因的可可品种(4、Ogita，S.，H.Uefuji，et al.Application of RNAi to confirmtheobromine as the major intermediate for caffeine biosynthesis in coffee plants with potential forconstruction of decaffeinated varieties[J].Plant Mol Biol.2004.54(6)：931-941.)。在植物抗病虫害方面的应用，有研究报道用RNAi干扰烟草中根结线虫基因Mi Tis11(转录因子)可导致根结线虫大量减少(5、Fairbairn，D.J.，A.S.Cavallaro，et al.Host-delivered RNAi：an effective strategyto silence genes in plant parasitic nematodes[J].Planta.2007.226(6)：1525-1533.)。用RNAi技术在玉米中表达玉米根虫双链RNA，可以降低玉米根虫取食造成的损害(6、Baum，J.A.，T.Bogaert，et al..Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].NatureBiotechnology.2007.25(11)：
1322-1326)。在水稻中，许多研究报道(7、Yuan，B.，X.Shen，et al.Mitogen-activated protein kinase OsMPK6negatively regulates rice disease resistance to bacterialpathogens[J]Planta.2007.226(4)：953-960；8、Tao，Z.，H.Liu，et al.A pair of allelic WRKY genesplay opposite roles in rice-bacteria interactions.Plant Physiol.2009.151(2)：936-948；9、Jiang，C.J.，M.Shimono，et al.Suppression ofthe rice fatty-acid desaturase gene OsSSI2enhances resistance toblast and leaf blight diseases in rice.Mol Plant Microbe Interact.2009.22(7)：820-829；10、Yamaguchi，T.，M.Kuroda，et al.Suppression of a phospholipase D gene，OsPLDbetal，activatesdefense responses and increases disease resistance in rice.Plant Physiol.2009.150(1)：308-319.)，通过RNAi干扰一些重要病害防御基因提高水稻病害抗性，抑制MPK6、OsWRKY45-1、OsSSI2和OsPLDβ1表达能够相应增强病害的抗性。

发明内容

[0005] 本发明的第一目的在于提供水稻细条病抗性相关基因NRRB。

[0006] 本发明的第二目的在于提供水稻细条病抗性相关基因NRRB编码的蛋白。

[0007] 本发明的第三目的在于提供水稻细条病抗性相关基因NRRB在培育细菌条斑病抗性增强的水稻中的应用。

[0008] 所述水稻细条病抗性相关基因NRRB的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No：1所示。

[0009] 所述水稻细条病抗性相关基因NRRB编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示。

[0010] 所述水稻细条病抗性相关基因NRRB可用于提高水稻对细菌条斑病的抗性，培育细菌条斑病抗性增强的水稻。

[0011] 所述培育细菌条斑病抗性增强的水稻可采用如下方法：

[0012] 构建水稻细条病相关基因NRRB的RNA干扰表达载体，并将其转化到水稻，筛选获得细菌条斑病抗性增强的水稻。

[0013] 所述表达载体可为Ti类质粒载体；所述转化可采用农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法，优选农杆菌介导转化方法。

[0014] 本发明中的水稻细条病相关基因NRRB的RNA干扰转基因植株株系的细菌条斑病病斑平均长度在T0和T1代显著小于对照，表明该基因的RNA干扰转基因植株能够显著提高水稻对细菌条斑病的抗性。本发明为培育细菌条斑病抗性增强的水稻提供了一条重要途径。而生产上栽培细菌条斑病抗性增强的水稻，对减少农药使用、增加粮食产量等具有重要意义。

附图说明

[0015] 图1为本发明实施例中NRRB基因干扰表达转基因水稻植株的PCR扩增电泳图。在图1中，M为DL 5000DNAMarker，1为野生型水稻植株，2为阳性质粒DNA，3～13为阳性转基因水稻植株。

[0016] 图2为NRRB基因在T0和T1代RNA干扰表达转基因水稻植株中的相对表达水平对比图。在图2中，WT为野生型水稻植株，R1～R11和Ra1～Ra7分别为11株T0代和7株T1代NRRB基因干扰表达转基因水稻植株；柱形图代表NRRB基因相对表达水平，其上竖线代表3个技术重复的标准误差。

[0017] 图3为T0和T1代NRRB基因干扰表达转基因水稻植株和相应野生型水稻植株的细菌条斑病病斑的平均长度对比图。在图3中，WT为野生型水稻植株，R1～R11和Ra1～Ra7分别为11株T0代和7株T1代NRRB基因干扰表达转基因水稻植株，柱形图代表病斑平均长度，其上竖线代表标准误差，“**”表示NRRB基因干扰表达转基因水稻植株与野生型植株之间的病斑平均长度存在极显著差异(P＜0.01)。

[0018] 图4为接菌14天后全部11株T0代和全部7株T1代干扰表达转基因水稻植株与相应野生型植株的病斑长度对比图。在图4中，WT为野生型水稻植株，RNAi为NRRB基因干扰表达转基因植株，柱形图代表病斑平均长度，其上竖线代表标准误；“**”表示NRRB基因干扰表达转基因植株与野生型植株之间的病斑平均长度存在极显著差异(P＜0.01)。

[0019] 图5分别为NRRB基因在T0和T1代RNA干扰表达转基因水稻植株中的相对表达水平对比图。在图5中，WT为野生型水稻植株，R1～R11和Ra1～Ra7分别为11株T0代和7株T1代NRRB基因干扰表达转基因水稻植株；柱形图代表NRRB基因相对表达水平，其上竖线代表3个技术重复的标准误差。

[0020] 图6为T0和T1代NRRB基因干扰表达转基因水稻植株和相应野生型水稻植株的细菌条斑病病斑的平均长度对比图。在图6中，WT为野生型水稻植株，R1～R11和Ra1～Ra7分别为11株T0代和7株T1代NRRB基因干扰表达转基因水稻植株，柱形图代表病斑平均长度，其上竖线代表标准误差，“**”表示NRRB基因干扰表达转基因水稻植株与野生型植株之间的病斑平均长度存在极显著差异(P＜0.01)。

[0021] 图7为接菌14天后全部11株T0代和全部7株T1代干扰表达转基因水稻植株与相应野生型植株的病斑长度对比图。在图7中，WT为野生型水稻植株，RNAi为NRRB基因干扰表达转基因植株，柱形图代表病斑平均长度，其上竖线代表标准误；“**”表示NRRB基因干扰表达转基因植株与野生型植株之间的病斑平均长度存在极显著差异(P＜0.01)。

具体实施方式

[0022] 以下实施例将对本发明作进一步的说明：

[0023] 实施例1水稻细条病抗性相关基因NRRB的获得

[0024] 水稻细条病抗性相关基因NRRB是一个在细菌条斑病菌侵染的水稻中差异表达的蛋白质编码基因。具体获得方法是，采用蛋白双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry)的技术从细菌条斑病菌侵染的水稻蛋白质组中找出差异表达的蛋白质，然后根据这些差异表达蛋白质的肽指纹搜索相关水稻蛋白数据库，获得包含这些肽指纹的蛋白质信息。再通过搜索GenBank核酸序列数据库，找到日本晴水稻基因组中编码该差异表达蛋白的核酸序列及其基因编号。

[0025] 实施例2水稻细条病抗性相关基因NRRB基因RNA干扰表达载体的构建[0026] 选择NRRB基因cDNA的5’端346bp核酸序列，合成一对引物NRRB-f和NRRB-r：

[0027] NRRB-f：caccttagtt aatcagttgg gaac；

[0028] NRRB-r：atgctcatcg gaatcatctg；

[0029] 其中正向引物NRRB-f中引入TOPO克隆识别位点，以便用TOPO克隆方法将基因DNA片断克隆于pENTR/D-TOPO载体上。

[0030] 用上述引物，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩曾，以获得NRRB基因cDNA的5’端346bp DNA片断。

[0031] PCR的扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。

[0032] 回 收 目 标 346bp DNA 片 断，按 照 pENTRTM Directional TOPO Cloning Kits(Invitrogen，USA)试剂盒的操作说明将此DNA片断克隆于pENTR/D-TOPO载体上，挑选阳性重组克隆进行测序，将测序结果正确的阳性克隆命名为pENTR34RNAi；提取pENTR34RNAi和RNA干扰表达载体pH7GWIWG2(II)质粒DNA，取50ng的pENTR34RNAi和100ng的pH7GWIWG2(II)质粒DNA，参考Gateway LR clonase II Enzyme Mix(Invitrogen，USA)操作说明书配制反应体系，通过Gateway LR重组反应将NRRB基因cDNA的5’端346bp DNA片断连接于RNA干扰表达盒中。重组的RNA干扰表达盒包含了一个NRRB基因cDNA的
5’端346bp正义DNA片断和一个该基因cDNA的5’端346bp反义DNA片断。pH7GWIWG2(II)表达 载 体 资 料 参 见 文 献(Kafimi，M.，Inzé，D.，Depicker，A.，Gateway vectors forAgrobacterium-mediated plant transformation.Trends Plant Sci.2002May；7(5)：
193-195.)。

[0033] 用NRRB-f和NRRB-r引物进行菌落PCR鉴定筛选阳性重组克隆，并将阳性重组克隆命名为pH34i；取1μg pH34i质粒DNA转化农杆菌EHA105；菌落PCR鉴定抗性平板上的农杆菌克隆，可得到阳性农杆菌克隆，向其菌液中加入20％甘油，保存于-80℃备用。

[0034] 实施例3水稻细条病抗性相关基因NRRB基因RNA干扰表达构建转化水稻及PCR检测鉴定

[0035] 农杆菌悬浮液的配制：取20μL含pH34i质粒的农杆菌甘油保存液，接种于10mL LB(含50mg/L卡那霉素)中，28℃振荡培养过夜，离心收集菌体，用适当体积AAM培养液重悬，使农杆菌悬浮液OD600值在0.3～1之间，最后加入乙酰丁香酮使之最终浓度达到50mg/L。

[0036] 取日本晴或中花11号成熟种子，脱壳后，用体积比例为1/3的次氯酸钠溶液(活性氯约为3％)，表面消毒30min，用无菌水清洗2～5遍；在无菌滤纸上晾干后，接种于N6D的诱导培养基中，在28℃黑暗的条件下诱导愈伤组织，2周后将愈伤组织在新鲜诱导培养基上继代培养。

[0037] 取新鲜生长旺盛的愈伤组织，浸泡在农杆菌悬浮液中，静置30min，倒去农杆菌悬浮液，将愈伤组织置于无菌滤纸上晾干，然后转移到2N6-AS共培养培养基上(加50mg/L乙酰丁香酮并预先在共培养培养基上垫一张无菌滤纸)接着置于19～23℃黑暗条件下共培养3天。3天后，将共培养愈伤组织取出，用无菌水洗净农杆菌，并置于无菌滤纸上晾干，然后转移到N6D-S筛选培养基(加50mg/L潮霉素和400mg/L羧卞青霉素)上，于28℃黑暗条件下培养若干周，期间大部分愈伤组织逐渐褐化，少部分愈伤组织可以长出淡黄色、松散的生长较旺盛的新鲜抗性愈伤组织。将此抗性愈伤组织在筛选培养基上继代培养1周后，转移至MS-NK分化培养基上，进行分化培养，抗性愈伤组织在2周左右可以开始分化出绿色的再生苗，分化的再生苗继续在MS-HF生根培养基上培养，待根基本长成，可移栽到营养土中，随后移栽至田间。其中所述AAM培养液、2N6-AS共培养培养基、N6D-S筛选培养基、MS-NK分化培养基和MS-HF生根培养基配方可参考文献(Nishimura，A.，I.Aichi，et al.(2006).″A protocolforAgrobacterium-mediated transformation in rice.″Nature Protocols 1(6)：2796-2802)。

[0038] 分别取上述转化苗的叶片，提取基因组DNA，并以基因组DNA为模板，用以下1对特异引物P35s-f和NRRB-idr进行PCR检测：

[0039] P35s-f：gacgtaaggg atgacgcaca a；

[0040] NRRB-idr：atgctcatcg gaacactg。

[0041] 由于引物P35s-f靶向花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子DNA，而NRRB-idr靶向NRRB基因DNA，因而可以用于检测阳性转基因植株，而在检测野生型植株时预期结果呈阴性。在对11株转基因植株进行PCR检测鉴定后，琼脂糖凝胶电泳结果显示，编号3～13的转基因植株检测结果为阳性，即能特异扩增到大约420bp的目标DNA条带，而以野生型植株(编号1)基因组DNA为模板的PCR的检测结果均为阴性，即不能特异扩增到大约420bp的目标DNA条带(参见图1)。

[0042] 实施例4T0代和T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因水稻植株中的NRRB基因表达及其对细菌条斑病的抗性分析

[0043] 分别对11株同处于孕穗期的T0代RNA干扰表达转基因植株和相应野生型植株的NRRB基因表达进行定量分析和细菌条斑病抗性鉴定。在获得T0代转基因种子后，取T0代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株的种子和相应野生型水稻种子，分别播种后，按常规栽培方法进行栽培，待植株长到孕穗期，对野生型植株和T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株的NRRB基因表达进行定量分析，并测试这些转基因植株对细菌性条斑病的抗性。具体操作方法如下：

[0044] 在水稻叶片接种水稻细条病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Xoc)RS105菌株之前，分别从野生型植株和NRRB基因RNA干扰表达转基因植株各取3段长约5cm叶片，并从中提取总RNA，然后用反转录试剂将其反转录成cDNA。分别以这些cDNA为模板，用基因特异引物对Actin-rqF/Actin-rqR和34real-f/34real-r分别对样品中Actin基因和NRRB基因进行定量分析。分析基因表达水平时，以Actin基因为内标基因，用相对表达量计算方法(Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Res.2001，29(9)：2002-2007.)分析NRRB基因在不同转基因植株中的相对表达水平。在基因表达的定量分析中，每个基因至少重复2次荧光定量PCR实验，每次实验设置3个技术重复。

[0045] 通过上述方法分析NRRB基因在11株T0代和7株T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株和相应野生型植株中的相对表达水平，结果显示，NRRB基因在11株T0代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株中的相对表达水平约为野生型植株的0.18～0.90倍(参见图2)。NRRB基因在7株T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株中的相对表达水平约为野生型植株的0.21～1.20倍(参见图5)。由此可见，在11株T0代和7株T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株中，NRRB基因的表达被不同程度抑制。

[0046] 所用引物序列为：

[0047] 34real-F：cttattttgc tgcatggggt；

[0048] 34real-R：ctgttttgga cttgggcaat；

[0049] Actin-rqF：tgtatgccag tggtcgtacc a；

[0050] Actin-rqR：ccagcaaggt cgagacgaa。

[0051] 在进行水稻细菌条斑病的抗性测试实验之前，先将细菌性条斑病菌X.oryzae pv.oryzicola(Xoc)RS105强毒菌株在营养琼脂培养基即NA培养基(+100mg/L利福平)上划线培养2～3天，用无菌水洗下菌体，配制病菌悬浮液，使之OD600值达到1.0左右，最后往悬浮液中加入Tween-20使之终浓度达到0.1％。用别针针尖蘸菌液，在完全展开叶片上扎针接菌，具体接菌方法是在叶片叶脉两侧且靠叶鞘端、中间端和叶末端处扎针接菌，每片叶片共接菌6～8处，每株共接菌处理3～5片叶片。同时用无菌水(含0.1％Tween-20)代替菌液进行模拟处理，以进行发病症状比较。在接菌14天后，用直尺测量接菌叶片的病斑长度。病斑以能见的水渍边缘为界，对所有接菌叶片的病斑进行测量并记录病斑长度数据。

[0052] 病斑长度数据的统计分析用origin 8.0软件附带的统计程序进行平均值差异显著性或极显著分析。对11株T0代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株和相应野生型植株的病斑长度数据进行统计分析，结果显示，11株T0代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株病斑平均长度为4.8～7.0mm，而野生型植株病斑平均长度约为7.6mm，其中4株(编号为R5、R6、R7和R9)T0代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株的病斑平均长度显著(“*”，P＜0.05)或者极显著(“**”，P＜0.01)短于野生型植株的病斑平均长度(参见图3)。而全部11株NRRB基因RNA干扰表达转基因植株的病斑平均长度约为6.3 mm，极显著(“**”，P＜0.01)短于野生型植株病斑的平均长度7.6mm(参见图4)。结果表明，与野生型水稻植株相比，T0代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株对细菌条斑病的抗性显著增强。

[0053] 同样方法统计分析野生型植株和7株T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株的病斑长度，7株T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株病斑平均长度为5.1～8.9mm，而野生型植株病斑平均长度约为8.2mm，其中5株(编号为Ra1-Ra5)NRRB基因RNA干扰表达转基因植株的病斑平均长度显著(“*”，P＜0.05)或者极显著(“**”，P＜0.01)短于野生型植株的病斑平均长度(参见图6)。而全部7株T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株的病斑平均长度约为6.2mm，极显著(“**”，P＜0.01)短于野生型植株病斑的平均长度8.2mm(参见图7)。结果表明，与野生型水稻植株相比，7株T1代NRRB基因RNA干扰表达转基因植株对细菌条斑病的抗性显著增强。