木瓜凝乳蛋白酶作为直接不对称Aldol反应催化剂的应用

摘要

本发明涉及木瓜凝乳蛋白酶作为直接不对称Aldol反应催化剂的应用，特别涉及其作为芳香醛或杂芳醛与二烷基酮或环烷酮之间的直接不对称Aldol反应催化剂的应用；还涉及应用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的方法，将芳香醛或杂芳醛、二烷基酮或环烷酮、木瓜凝乳蛋白酶、水和有机溶剂在pH为4.9~7的条件下控温25~40℃搅拌反应，即生成直接不对称Aldol反应产物；有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、叔丁基甲醚、环己烷和二氯甲烷中的任一种或多种混合物；水和有机溶剂的体积比为0.09~0.15；本发明不仅拓宽了木瓜凝乳蛋白酶的应用范围，而且为直接不对称Aldol反应提供了一种优良的催化剂，在有机合成领域具有广阔的应用前景。

权利要求

1.木瓜凝乳蛋白酶作为芳香醛或杂芳醛与二烷基酮或环烷酮之间的直接不对称Aldol反应催化剂的应用，所述应用方法是向反应容器中加入芳香醛或杂芳醛、二烷基酮或环烷酮、木瓜凝乳蛋白酶、水和有机溶剂，在pH为4.9~7的条件下控温25~40℃搅拌反应，即生成直接不对称Aldol反应产物；所述芳香醛为苯甲醛或取代苯甲醛，所述取代苯甲醛为苯环被1~2个取代基取代的苯甲醛，这些取代基独立地选自氟、氯、溴、硝基、羟基、氰基、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基；所述杂芳醛为糠醛；所述二烷基酮为丙酮；所述环烷酮为环戊酮、环己酮或环庚酮；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、叔丁基甲醚、环己烷和二氯甲烷中的任一种或多种混合物；所述水和有机溶剂的体积比为0.09~0.15。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述有机溶剂为乙腈。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述水和有机溶剂的体积比为0.12。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述反应温度为30℃。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述pH为4.9。

说明书

木瓜凝乳蛋白酶作为直接不对称Aldol反应催化剂的应用

技术领域

[0001] 本发明属于化学领域，涉及木瓜凝乳蛋白酶在有机合成中的新应用，特别涉及木瓜凝乳蛋白酶作为直接不对称Aldol反应催化剂的应用，以及应用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的方法。

背景技术

[0002] 自20世纪80年代初期Klibanov报道了酶可以在无水有机溶剂中保持活性且溶剂对酶的选择性有较大影响以来，酶作为生物催化剂由于其内在的高选择性，温和的反应条件以及潜存的环境友好等优点而备受关注。然而，自然界中酶的种类是有限的，目前实际投入工业化生产的酶的种类更是有限的，因此，挖掘每一种酶潜存的催化多功能性非常必要。

[0003] C-C键形成的反应是有机合成中的基础反应。Aldol反应是形成C-C键的重要反应之一。除了醛缩酶对Aldol反应具有天然催化活性以外，关于其它酶催化Aldol反应的报道极少，仅见C. Branneby等报道突变的脂肪酶可以催化Aldol反应（J. Am. Chem. Soc.2003, 125, 874-875）；C. Li等报道脂肪酶和具有多功能性的胃蛋白酶可以催化Aldol反应（Green Chem. 2008, 10, 616-618；J. Biotechnol. 2010,150, 539-545）；X. Chen等报道酰基转移酶和含氮杂环化合物在有机溶剂中可以催化Aldol反应和脱水反应的串联反应（J. Mol. Catal. B-Enzym. 2011, 68, 71-76）；以及发明人在前期研究工作中发现，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶和核酸酶P1可以催化直接不对称Aldol反应（Catal. Commun.
2011, 12, 580-582；Green Chem. 2011, 13, 185-189）。

[0004] 木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）［EC 3. 4. 22. 6］是属于木瓜蛋白酶家族的一种胞外巯基蛋白酶，具有凝乳和蛋白质水解能力，主要来源于未成熟的木瓜乳中，目前除了用于奶酪的制造外，主要用于医药行业，如抗菌消炎、Rh血型的鉴定、肿瘤的辅助治疗、短肽的合成等，最主要用于治疗腰椎间盘突出症。迄今为止，国内外尚未见其可以作为直接不对称Aldol反应催化剂应用的研究报道。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于确认木瓜凝乳蛋白酶是否能够作为直接不对称Aldol反应催化剂应用。

[0006] 为达到此目的，本发明以对氰基苯甲醛和环己酮为底物，首先通过对照实验确认了木瓜凝乳蛋白酶可以催化对氰基苯甲醛和环己酮的直接不对称Aldol反应，其次对影响上述反应的主要因素如反应溶剂、溶剂含水量、反应温度、反应时间和溶剂pH值等进行了系统研究；再在优化的反应条件下，进一步考察了木瓜凝乳蛋白酶作为直接不对称Aldol反应催化剂的底物适用范围，结果发现，木瓜凝乳蛋白酶能够催化芳香醛或杂芳醛与二烷基酮或环烷酮之间的直接不对称Aldol反应并取得良好的效果。从而确认了木瓜凝乳蛋白酶可以作为直接不对称Aldol反应催化剂应用。

[0007] 进一步，木瓜凝乳蛋白酶可以作为芳香醛或杂芳醛与二烷基酮或环烷酮之间的直接不对称Aldol反应催化剂应用。

[0008] 进一步，所述芳香醛为苯甲醛或取代苯甲醛，所述杂芳醛为糠醛。

[0009] 进一步，所述取代苯甲醛为苯环被1~2个取代基取代的苯甲醛，这些取代基独立地选自氟、氯、溴、硝基、羟基、氰基、C1-C5烷基或C1-C5烷氧基。

[0010] 进一步，所述二烷基酮为丙酮，所述环烷酮为环戊酮、环己酮或环庚酮。

[0011] 本发明的目的之二在于提供一种应用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的优化方法。

[0012] 为达到此目的，本发明提供如下技术方案：

[0013] 应用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的方法，是向反应容器中加入芳香醛或杂芳醛、二烷基酮或环烷酮、木瓜凝乳蛋白酶、水和有机溶剂，在pH为4.9~7的条件下控温25~40℃搅拌反应，即生成直接不对称Aldol反应产物；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、叔丁基甲醚、环己烷和二氯甲烷中的任一种或多种混合物；所述水和有机溶剂的体积比为0.09~0.15。

[0014] 进一步，所述有机溶剂为乙腈。

[0015] 进一步，所述水和有机溶剂的体积比为0.12。

[0016] 进一步，所述反应温度为30℃。

[0017] 进一步，所述pH为4.9。

[0018] 本发明的有益效果在于：本发明首次发现木瓜凝乳蛋白酶能够作为直接不对称Aldol反应催化剂应用，特别是适用于芳香醛或杂芳醛与二烷基酮或环烷酮之间的直接不对称Aldol反应，具有催化活性好、对映选择性高、经济、环保等优点，不仅拓宽了木瓜凝乳蛋白酶的应用范围，而且为直接不对称Aldol反应提供了一种优良的催化剂，在有机合成领域中具有广阔的应用前景。

附图说明

[0019] 图1示出了有机溶剂含水量对木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的影响。

[0020] 图2示出了反应温度对木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的影响。

[0021] 图3示出了反应时间对木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的影响。

[0022] 图4示出了溶剂pH值对木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的影响。

具体实施方式

[0023] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

[0024] 实施例中使用的木瓜凝乳蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司，比活力为20U/mg。实施例中采用薄层色谱法（GF254硅胶板）监测反应进程，柱色谱法（100~200目硅胶加压柱，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合液）纯化粗产物。实施例中给出的产率为经柱色谱1
法纯化后的产物收率；产物的相对构型和绝对构型通过与已知化合物的核磁共振氢谱（H
13
NMR）、核磁共振碳谱（ C NMR）和手性高效液相色谱数据比较确定；d.r.(anti/syn)为反式产物（anti）与顺式产物（syn）的摩尔比，通过测定非对映异构体的高效液相色谱确定；产物的对映体过量值（ee）通过测定对映异构体的手性高效液相色谱测定。

[0025] 实施例1、木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的活性及构效关系确认[0026] 本实施例以对氰基苯甲醛和环己酮为底物，对木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的活性及其构效关系进行了确认。实验方法为：在反应瓶中加入对氰基苯甲醛（131mg，1.0 mmol）和环己酮（294mg，3.0mmol），不加入酶或分别加入以下物质（200mg）：木瓜凝乳蛋白酶、经尿素100℃预处理24小时使失去活性的木瓜凝乳蛋白酶、经苯甲基磺酰氟（PMSF）25℃预处理24小时使活性被抑制的木瓜凝乳蛋白酶、牛血清白蛋白、卵清白蛋白，再加入水（0.09mL）和乙腈（1.0mL），控温25℃搅拌反应。反应完毕后，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，合并滤液和洗液，加水（20mL）稀释后，用乙酸乙酯萃取3次（每次20mL），合并乙酸乙酯萃取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗产物，再经柱色谱法纯化获得目标产物。

[0027] 结果如表1所示，可见对氰基苯甲醛和环己酮在含水乙腈中25℃搅拌反应，（1）不加酶条件下，反应96小时未见产物生成；（2）加入木瓜凝乳蛋白酶，反应89小时获得Aldol反应产物且产物具有较好的对映选择性；（3）加入经尿素处理失去活性或经PMSF处理活性被抑制的木瓜凝乳蛋白酶，反应96小时仅有微量产物生成；（4）加入牛血清白蛋白或卵清白蛋白等非酶蛋白质，反应130小时获得Aldol反应产物但产物不具有对映选择性；从而确认木瓜凝乳蛋白酶可以催化直接不对称Aldol反应且其三维结构对催化活性来说是必须的，排除了其催化活性是由蛋白质或其所含氨基酸残基带来的可能性。

[0028] 表1 对氰基苯甲醛和环己酮在不同条件下的反应结果

[0029]

[0030]

[0031] 实施例2、应用木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的方法学研究

[0032] 本实施例以对氰基苯甲醛和环己酮为底物，对木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的主要影响因素如反应溶剂、溶剂含水量、反应温度、反应时间和溶剂pH值等进行了系统研究。

[0033] 一、反应溶剂的影响

[0034] 反应溶剂对酶的活性和稳定性尤其是酶的立体选择性具有很大影响。本实施例考察了木瓜凝乳蛋白酶在不同溶剂中催化直接不对称Aldol反应的情况。反应条件为：对氰基苯甲醛（131mg，1.0mmol）、环己酮（294mg，3.0mmol）、木瓜凝乳蛋白酶（200mg）、水（0.09 mL）和有机溶剂（1.0mL），控温25℃搅拌反应89小时。产物的分离纯化方法同实施例1。

[0035] 结果如表2所示，以二甲亚砜为溶剂，产率（50%）最高但d.r.值（55/45）和ee 值（40%）都最低；以四氢呋喃为溶剂，产率（30%）次高，d.r.值（65/35）和ee值（69%）中等；以乙腈为溶剂，产率中等（21%）但d.r.值（77/23）和ee 值（76%）都高；以叔丁基甲醚、环己烷或二氯甲烷为溶剂，产率较低（17%~19%），d.r.值（57/43~65/35）和ee 值中等（70%~79%）；以水为溶剂，产率（18%）和ee 值（57%）都较低，d.r.值（64/36）中等。因此，综合考虑两方面特别是ee 值，反应溶剂优选四氢呋喃、乙腈、叔丁基甲醚、环己烷和二氯甲烷中的任一种或多种混合物，更优选乙腈。

[0036] 表2 反应溶剂对木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的影响

[0037]

[0038] 二、溶剂含水量的影响

[0039] 溶剂含水量直接影响着酶的活性和稳定性以及酶构象的灵活性。本实施例考察了木瓜凝乳蛋白酶在不同溶剂含水量（V水/V乙腈）条件下催化直接不对称Aldol反应的情况。反应条件为：对氰基苯甲醛（131mg，1.0mmol）、环己酮（294mg，3.0mmol）、木瓜凝乳蛋白酶（200mg）、水（0~0.5mL）和乙腈（1.0mL），控温25℃搅拌反应98小时。产物的分离纯化方法同实施例1。

[0040] 结果如图2所示，当溶剂含水量为0.09时，ee 值（73%）和产率（27%）中等；当溶剂含水量增大至0.12时，ee 值达到最大（77%），产率略有上升（28%）；之后ee 值随着溶剂含水量增大而降低，当溶剂含水量增大至0.15时，ee值降至71%，但产率达到最大（32%）；之后再增大溶剂含水量，产率也逐渐降低。因此，综合考虑两方面特别是ee值，溶剂含水量优选为0.09~0.15，更优选为0.12。

[0041] 三、反应温度的影响

[0042] 温度是影响酶稳定性和选择性以及反应速率的重要因素之一。本实施例考察了木瓜凝乳蛋白酶在不同温度下催化直接不对称Aldol反应的情况。反应条件为：对氰基苯甲醛（131mg，1.0mmol）、环己酮（294mg，3.0mmol）、木瓜凝乳蛋白酶（200mg）、水（0.12mL）和乙腈（1.0mL），控温15~50℃搅拌反应94小时。产物的分离纯化方法同实施例1。

[0043] 结果如图3所示，当反应温度为25℃时，ee值较高（77%），产率中等（23%）；当反应温度升高至30℃时，ee值略有上升并达到最大（78%），产率提高（30%）；之后ee 值随着反应温度升高而降低，当反应温度升高至40℃时，ee值降至66%，但产率达到最大（38%）；之后再升高反应温度，产率也逐渐降低。因此，综合考虑两方面特别是ee 值，反应温度优选为25~40℃，更优选为30℃。

[0044] 四、反应时间的影响

[0045] 本实施例考察了木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称Aldol反应的时间进程。反应条件为：对氰基苯甲醛（131mg，1.0mmol）、环己酮（294mg，3.0mmol）、木瓜凝乳蛋白酶（200mg）、水（0.12mL）和乙腈（1.0mL），控温30℃搅拌反应125小时。产物的分离纯化方法同实施例1。

[0046] 结果如图3所示，在反应开始的前30小时反应速率较快，30小时后反应速率减慢，之后逐渐达到平衡，此时产率为26%，而ee 值在整个反应过程中基本保持在75%左右。

[0047] 五、溶剂pH值的影响

[0048] 溶剂pH值对酶的稳定性和活性起着非常重要的作用。本实施例考察了木瓜凝乳蛋白酶在不同溶剂pH值条件下催化直接不对称Aldol反应的情况。反应条件为：对氰基苯甲醛（131mg，1.0mmol）、环己酮（294mg，3.0mmol）、木瓜凝乳蛋白酶（200mg）、pH为4.60~7.84的磷酸盐缓冲液（0.12mL）和乙腈（1.0mL），控温30℃搅拌反应131小时。产物的分离纯化方法同实施例1。

[0049] 结果如图4所示，当溶剂pH为4.9时，产率和ee值均达到最大（分别为45%和78%）；当溶剂pH为4.9~7.0时，产率和ee值基本保持恒定；而当溶剂pH小于4.9或大于7.0时，产率和ee 值均明显降低。因此，综合考虑两方面特别是ee 值，溶剂pH值优选为4.9~7.0，更优选为4.9。

[0050] 实施例3、木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的底物适用范围考察[0051] 本实施例对木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的底物适用范围进行了考察。实验方法为：在反应瓶中加入醛（1.0mmol）、酮（3.0mmol）、木瓜凝乳蛋白酶（200mg）、pH为4.9的磷酸盐缓冲液（0.12mL）和乙腈（1.0mL），控温30℃搅拌反应。反应完毕后，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，合并滤液和洗液，加水（20mL）稀释后，用乙酸乙酯萃取3次（每次20mL），合并乙酸乙酯萃取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂得粗产物，再经柱色谱法纯化获得目标产物。

[0052] 结果如表3所示，芳香醛如取代苯甲醛等以及杂芳醛如糠醛等都可以作为木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的受体。其中，芳香环被吸电子基取代的芳香醛（编号2~11）比芳香环被给电子基取代的芳香醛（编号1）表现出更好的反应活性。芳香环上取代基的位阻效应对反应的非对映选择性也有较大影响。在与环己酮的反应中，2-位取代的芳香醛通常可以取得较高的d.r.值，但产率相对较低（编号4和10），如位阻最大的2,6-二氯苯甲醛与环己酮的反应取得最好的d.r.值（>99:1，编号7）。另一方面，二烷基酮如丙酮等以及环烷酮如环戊酮、环己酮、环庚酮等都可以作为木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的供体。其中，木瓜凝乳蛋白酶对环己酮的选择性通常高于环戊酮和环庚酮，对环烷酮的选择性又高于丙酮（编号9, 12-14）。取代苯甲醛与环己酮或环戊酮的反应主要获得反式产物，而与环庚酮或丙酮的反应几乎没有非对映选择性。此外，除编号13和14的反应外，其它反应的反式产物均获得中等至优秀的ee值，而顺式产物的ee值较低或没有获得ee值。

[0053] 表3 木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不对称Aldol反应的底物适用范围考察

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[0055]

[0056]

[0057] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。