一种棉花种子纯度检验的方法转让专利
申请号 : CN201110079445.X
文献号 : CN102181540B
文献日 : 2013-01-23
发明人 : 程国旺 , 彭家成 , 陈先锋 , 马惠应 , 王兆贤 , 周桂林 , 吴晓亮
申请人 : 合肥丰乐种业股份有限公司
摘要 :
本发明公开了一种棉花种子纯度检验的方法，特别是一种利用SSR分子标记对抗虫杂交棉国丰棉198棉花种子进行纯度检验的方法。其利用一对SSR引物P1和P2对棉花杂交品种国丰棉198的父母本和杂交一代的基因组DNA进行扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对国丰棉198杂一代种子样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致。适用于对国丰棉198及其亲本真实性和种子纯度的检验。
权利要求 :
1.一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于其具体步骤是：
1）DNA提取：
将种子置于营养钵中发芽出苗至幼苗有2-3片真叶时，取4cm左右的叶片于研钵中，加入1.5×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入离心管65℃水浴半小时；加入与提取缓冲液等体积的氯仿/异戊醇混合液，手摇10分钟，10000rpm离心10分钟；取其上清，加入冰冻95%乙醇，-20℃冰柜内放置30分钟沉淀DNA；10000rpm离心10分钟，弃上清，加75%乙醇，静置4分钟去盐；弃乙醇，离心管倒置于吸水纸上风干；加200ul灭菌双蒸水溶解DNA待用；
所述1.5×CTAB提取缓冲液由1.5%(w/v)的十六烷基三甲溴化铵,1.4M的氯化钠，
100mM的 Tris-Cl缓冲液，20mM 的乙二胺四乙酸，0.2%（v/v）的α-巯基乙醇构成；
2）PCR反应：
在PCR管中分别加入DNA模板、10×PCR含氯化镁缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷、引物P1和P2、Taq酶及双蒸水；先94℃预变性4分钟；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，32个循环；72℃延伸7分钟，95℃水浴4分钟变性后置冰上；
所 述 引 物 P1 序 列 为 5’-CGGTCAGATTCCAACAGA-3’, 引 物 P2 序 列 为
5’-GCCATCTCAGAGAGGACA-3’
3）注胶电泳检测：
将分离胶缓慢注入两玻璃板之间，静置凝固半小时以上；将玻璃板装上电泳槽，2000V，
90W预热半小时；插梳子，点样；2000V，85W电泳约3小时；下胶后，将胶板放在10%冰醋酸的盒子里，轻摇20分钟至胶全部脱色；用清水漂洗两次，每次5分钟；放入染色盆染色液中,轻轻摇动染色15-20分钟；取出胶板，用清水漂洗10秒；放入显影液中显影至DNA带清晰；
水洗1分钟；
4）受检种子纯度计算：
用上述方法分别获取国丰棉198杂交一代和亲本种子电泳谱带，计数受检样品中有清晰的两条带型的种子数，并用下式计算受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100。
2.根据权利要求1所述的一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特 征在于：所述氯仿/异戊醇混合液由氯仿和异戊醇混合而成，其混合体积比为24︰1。
3.根据权利要求1所述的一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于：所述分离胶由4%的聚丙烯酰胺、10%的过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺混合而成，其混合体积比为65:0.4:0.04。
说明书 :
一种棉花种子纯度检验的方法
技术领域
[0001] 本发明属于种子质量检验技术领域，涉及杂交棉花种子纯度检验的方法，[0002] 特别是一种利用SSR分子标记对抗虫杂交棉国丰棉198棉花种子进行纯度检验的方法。
背景技术
[0003] 国丰棉198是合肥丰乐种业股份有限公司培育的高产优质杂交棉花新品种，具有我国自主知识产权的抗虫基因专利。该品种在杂交制种过程当中, 需要通过母本人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，母本去雄不彻底或漏去雄，将会极大地影响制种纯度。传统的杂交种纯度检测方法为种植鉴定, 依赖于品种表型差异，通过成株外观形状比较鉴定，鉴定时间长、费用高、难度较大和准确性差。
[0004] SSR(Simple Sequence Repeat)是在PCR(Polymerase Chain Reaction)基础上发展起来的一种新的分子标记技术，具有高度多态性、共显性、保守性、且仅需少量的DNA、操作简便、重复性好、稳定可靠等优点，在动物、植物、微生物等研究领域中得到了广泛应用，并已开始应用于棉花的遗传多样性分析及杂交种纯度的鉴定研究。朱美霞等利用15 对SSR 引物对8621号、中棉19 等5 个棉花品种进行单株和引物组合法检测的结果说明SSR 引物组合法在检测品种纯度上具有高效性和可靠性。秦利等用2 对SSR引物对当前新疆主栽品种进行的指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定的结果表明SSR标记可将3 个杂交种与它们的亲本加以区分。本研究利用国丰棉198杂交种与双亲在一些SSR 位点上的差异, 寻找合适的引物扩增出杂交种与双亲差异明显的稳定条带，用于国丰棉198的室内纯度检测。为国丰棉198纯度鉴定提供一个准确、稳定、快捷、实用的检测方法。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够对国丰棉198棉花种子进行准确、稳定、快捷、实用检测的方法。
[0006] 其技术方案是：一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于其具体步骤是：
[0007] 1）DNA提取：
[0008] 将种子置于营养钵中发芽出苗至幼苗有2-3片真叶时，取4cm左右的叶片于研钵中，加入1.5×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入离心管65℃水浴半小时；加入与提取缓冲液等体积的氯仿/异戊醇混合液，手摇10分钟，10000rpm离心10分钟；取其上清，加入冰冻95%乙醇，-20℃冰柜内放置30分钟沉淀DNA；10000rpm离心10分钟，弃上清，加75%乙醇，静置4分钟去盐；弃75%乙醇，离心管倒置于吸水纸上风干；加200ul灭菌双蒸水溶解DNA待用；
[0009] 2）PCR反应：
[0010] 在PCR管中分别加入DNA模板、10×PCR 缓冲液（含 MgCl2氯化镁）、dNTP三磷酸脱氧核糖核苷(2.0mM)、引物P1和P2、Taq酶及ddH2O双蒸水；先94℃预变性4′；再94℃变性30″，55℃退火30″，72℃延伸1′，32个循环；72℃延伸7′，95℃水浴4′变性后置冰上；
[0011] 3）注胶电泳检测：
[0012] 将分离胶缓慢注入两玻璃板之间，静置凝固半小时以上；将玻璃板装上电泳槽，2000V，90W预热半小时；插梳子，点样；2000V，85W电泳约3小时；下胶后，将胶板放在10%冰醋酸的盒子里，轻摇20分钟至胶全部脱色；用清水漂洗两次，每次5分钟；放入染色盆染色液中,轻轻摇动染色15-20分钟；取出胶板，用清水漂洗10秒；放入显影液中显影至DNA带清晰；水洗1分钟。
[0013] 4）受检种子纯度计算：
[0014] 用上述方法分别获取国丰棉198杂交一代和亲本种子电泳谱带，计数受检样品中有清晰的两条带型的种子数，并用下式计算受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100。
[0015] 其技术效果是：本发明利用一对SSR引物P1和P2对棉花杂交品种国丰棉198的父母本和杂交一代的基因组DNA进行扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对国丰棉198杂一代种子样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致（详见附表1）。
[0016] 附表1：应用SSR分子标记室内检测纯度与田间种植鉴定纯度对照表 [0017]样品编号 田间鉴定结果（%） 室内鉴定结果（%）
1 97.6 98.0
2 98.5 98.0
3 97.1 98.3
4 97.8 97.0
5 96.9 96.5
6 98.3 98.0
7 98.3 97.5
8 98.7 98.0
9 98.1 97.0
10 99.8 99.0
11 98.7 97.5
12 97.4 97.5
13 98.7 97.5
14 98.8 97.0
15 97.9 97.5
16 98.4 97.0
17 99.1 97.0
18 98.3 97.5
19 98.9 96.5
20 99.3 98.5
21 98.5 98.0
22 97.2 98.4
23 99.5 97.5
24 99.1 96.5
25 99.4 96.5
26 99.4 97.0
27 99.5 98.5
28 98.7 97.0
29 98.1 98.0
30 98.6 98.5
平均 98.5 97.6
1 97.6 98.0
2 98.5 98.0
3 97.1 98.3
4 97.8 97.0
5 96.9 96.5
6 98.3 98.0
7 98.3 97.5
8 98.7 98.0
9 98.1 97.0
10 99.8 99.0
11 98.7 97.5
12 97.4 97.5
13 98.7 97.5
14 98.8 97.0
15 97.9 97.5
16 98.4 97.0
17 99.1 97.0
18 98.3 97.5
19 98.9 96.5
20 99.3 98.5
21 98.5 98.0
22 97.2 98.4
23 99.5 97.5
24 99.1 96.5
25 99.4 96.5
26 99.4 97.0
27 99.5 98.5
28 98.7 97.0
29 98.1 98.0
30 98.6 98.5
平均 98.5 97.6
[0018] 由上表分析，两种方法检测纯度的平均值分别为98.5和97.6，t测验二者差异不显著，说明了不同方法检测纯度结果的一致性。因而SSR分子标记技术适用于国丰棉198品种及其亲本真实性和种子纯度的检验。
附图说明
[0019] 图1是以国丰棉198亲本及其F1的特征谱带。图中1,27为国丰棉198父本带型（400bp）；2,28为国丰棉198母本带型（620bp）；3-26为国丰棉198杂种一代种子带型（包括父本400bp和母本620bp的带型）。
具体实施方式
[0020] 一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其具体步骤如下：
[0021] 1）DNA提取：
[0022] 将种子置于营养钵中发芽出苗，等到幼苗有2-3片真叶时，取4cm左右的叶片于小研钵中，加入700ul的 1.5×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入1.5ml离心管。1.5×CTAB提取缓冲液由1.5%(w/v)的十六烷基三甲溴化铵CTAB,1.4M的氯化钠NaCl，100mM的 Tris-Cl缓冲液（pH8.0），20mM 的乙二胺四乙酸EDTA和 0.2%（v/v）的α-巯基乙醇构成。
[0023] a)65℃水浴半小时；加入与提取缓冲液等体积的的氯仿/异戊醇混合液。氯仿/异戊醇混合液由氯仿和异戊醇混合而成，其混合体积比为24︰1;
[0024] b)10000rpm离心10分钟；
[0025] c)吸上清300ul于另一离心管，加入600ul 的冰冻95%乙醇，-20℃冰柜内放置30分钟沉淀DNA；
[0026] d)10000rpm离心10分钟，弃上清；
[0027] e)加400ul 75%乙醇，静置4分钟去盐；
[0028] f)弃75%乙醇，离心管倒置于吸水纸上风干；
[0029] g)加200ul灭菌双蒸水溶解DNA待用；
[0030] 1%琼脂糖凝胶检测DNA产物。
[0031] 2）PCR反应：
[0032] ⑴反应体系（20ul）：在PCR管中分别加入2ul DNA模板、10×PCR 缓冲液（含氯化镁MgCl2）、1.8ul 的三磷酸脱氧核糖核苷dNTP (2.0mM)、1.0ul的引物P1和P2、0.2ul 的Taq酶及13ul的双蒸水ddH2O。
[0033] 引物P1序列为5’-CGGTCAGATTCCAACAGA-3’,
[0034] 引物P2序列为5’-GCCATCTCAGAGAGGACA-3’；
[0035] ⑵反应程序：先94℃预变性4′；
[0036] 再94℃变性30″，55℃退火30″，72℃延伸1′，32个循环；
[0037] 72℃延伸7′，95℃水浴4′变性后置冰上。
[0038] 3）注胶电泳检测
[0039] ①清洗玻璃板：用95%酒精用力擦洗涂剥离硅烷和亲和硅烷的那两面板。
[0040] ②涂亲和硅烷：将1ml亲和液（由995ul 95%乙醇和5ul冰乙酸混合而成）和15ul亲和硅烷均匀地涂抹到没有凹槽的玻璃板上。
[0041] ③涂剥离硅烷：有凹槽的玻璃板上均匀地涂抹1ml剥离硅烷。
[0042] ④加边条、装板：将一块玻璃板涂有亲和硅烷的一面朝上平放于实验台上，两侧对齐放置边条，将另一块玻璃板涂有剥离硅烷的一面朝下盖于其上，两侧对称夹上夹子。
[0043] ⑤灌分离胶：将分离胶缓慢注入两玻璃板之间，静置凝固半小时以上。分离胶由65ml 4%的聚丙烯酰胺、400ul10%的过硫酸铵APS和40ul 的N,N,N',N'-四甲基乙二胺TEMED混合而成。
[0044] ⑥电泳：将玻璃板装上电泳槽，2000V，90W预热半小时；插梳子，点样；2000V，85W电泳约3小时。
[0045] ⑦银染：
[0046] a下胶后，将胶板放在1升新配制的10%冰醋酸的盒子里，轻摇20分钟至胶全部脱色。b用清水漂洗两次，每次5分钟。c放入染色盆染色液中,轻轻摇动染色15-20分钟。染色液由1L去离子水、1.5ml 的37%甲醛和1g的硝酸银AgNO3混合而成。d取出胶板，用清水漂洗10秒。e放入显影液（在1L去离子水中加入30g无水醋酸钠，1.5ml的37%甲醛和200ul硫代硫酸钠（10mg/ml））中显影至DNA带清晰（约5分钟）；f水洗1分钟。
[0047] ⑧观察：胶板晾干后于读X光片的灯箱下观察记录结果。
[0048] 4）受检种子纯度计算：用上述方法分别获取国丰棉198杂交一代和亲本种子电泳谱带（见图2。杂交种有清晰的两条带型，为620bp和400bp；母本有一条620bp的带型；父本有一条400bp的带型），将受检样品中有清晰的两条带型的进行计数，受检样品的种子纯度可用下式计算：
[0049] 受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100