一种米尔顿姬小蜂分子检测引物、检测方法及其应用转让专利
申请号 : CN201110087084.3
文献号 : CN102181542B
文献日 : 2013-03-13
发明人 : 黄蓬英 , 廖富荣 , 林石明
申请人 : 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心
摘要 :
本发明公开了一种米尔顿姬小蜂分子检测引物、检测方法及其应用，所述米尔顿姬小蜂分子检测引物的DNA序列为：上游引物（MITS2F）：5′-TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3′；下游引物（MITS2R）：5′-TCCATCTCGCATTACCCTC-3′。本发明方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，可用于米尔顿姬小蜂高灵敏度快速分子检测，为进出口安全提供了保证。
权利要求 :
1.一种米尔顿姬小蜂分子检测引物，其特征在于由上游引物MITS2F和下游引物MITS2R组成，所述米尔顿姬小蜂分子检测引物的DNA序列为：MITS2F： 5′-TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3′；
MITS2R： 5′-TCCATCTCGCATTACCCTC-3′。
2.一种米尔顿姬小蜂分子检测方法，其特征在于包括如下步骤：以提取的昆虫总DNA为模板，利用权利要求1所述的米尔顿姬小蜂分子检测引物进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的位置判定结果，米尔顿姬小蜂能检出317 bp的DNA片段。
3.如权利要求2所述的一种米尔顿姬小蜂分子检测方法，其特征在于：PCR扩增步骤为：95℃预变性3 min；然后94℃变性45s，58 ℃退火1min，72℃延伸1 min，运行35个循环；最后72℃延伸7min。
4.一种如权利要求1所述的米尔顿姬小蜂分子检测引物的应用，其特征在于：所述米尔顿姬小蜂分子检测引物用于制备米尔顿姬小蜂分子检测用引物的试剂盒。
说明书 :
一种米尔顿姬小蜂分子检测引物、检测方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种米尔顿姬小蜂分子检测引物、检测方法及其应用。属于农作物害虫检测、鉴定及防治技术的领域。
背景技术
[0002] 米尔顿姬小蜂Anselmella miltoni Girault隶属于昆虫目，小蜂总科Chalcidoidea，姬小蜂科Eulophidae，Anselmella属。
[0003] 米尔顿姬小蜂幼虫是植食性的，以取食蒲桃属类的种子发育。该类型水果是无核的，遭受危害后，形成一个看起来像核桃模样的虫瘿，不仅影响水果的产量，而且使其失去食用价值。该虫繁殖速度快、量大、危害严重。当前，我国的海南、广东、广西、福建等地都有种植莲雾，因此，受米尔顿姬小蜂危害的影响显然易见。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对昆虫进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多(窦向梅,2005)。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对昆虫的分子检测开展研究（Gallego, 2001，刘玉娣, 2009）。rDNA中的ITS区段以中性的方式进化，速度大约与物种形成的进程相仿（李正西， 2001）。rDNA-ITS2在种内相当保守，而在种间表现出一定的变异，是区分种或种下阶元的理想分子标记。由于小蜂类昆虫的个体小，约2 mm，利用传统形态分类特征难以进行准确鉴定，而且也需要鉴定者具有良好的经验和专业背景知识，而基于PCR方法的分子鉴定只要求工作者有简单的分子操作技能。目前，还没有米尔顿姬小蜂的分子检测鉴定方法。本申请发明人在国际上首次测定了米尔顿姬小蜂ITS序列，设计特异性引物，通过聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction, PCR）建立了米尔顿姬小蜂的PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供了一种米尔顿姬小蜂分子检测引物、检测方法及其应用。本发明针对米尔顿姬小蜂个体小（大小约2 mm），利用传统形态分类特征难以与其它小蜂区分，为米尔顿姬小蜂提供一种特异分子检测引物，方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，可用于米尔顿姬小蜂的快速检测。
[0006] 为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
[0007] 一种米尔顿姬小蜂分子检测引物，所述米尔顿姬小蜂分子检测引物的DNA序列为：
[0008] 上游引物（MITS2F）： 5′-TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3′；
[0009] 下游引物（MITS2R）： 5′-TCCATCTCGCATTACCCTC-3′。
[0010] 一种米尔顿姬小蜂分子的检测方法，包括如下步骤：提取昆虫基因组DNA ；以该总DNA为模板用上述的一对引物MITS2F和MITS2R进行PCR扩增；反应结束后用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，当能特异性地扩增出317 bp的产物，即可判断该昆虫为米尔顿姬小蜂。
[0011] 所述的PCR反应体系为25μl，其中2.5 µL 10×Dream TaqTM 缓冲液(含 20 mmol∕L MgCl2)（立陶宛Fermentas公司），dNTP 混合物(2.5 mmol∕L) 2 µL（立陶宛Fermentas 公司），10 µmol∕L的上游引物MITS2F 1.5 µL，10 µmol∕L的下游引物MITS2R TM1.5µL，5 U/µL的Dream Taq DNA 聚合酶 0.2 µL（立陶宛Fermentas公司），模板DNA 4µL，加灭菌双蒸水至25μl。PCR反应程序如下：95 ℃预变性3min；94 ℃变性45s，58℃退火
1min，72℃延伸1min，运行35个循环；最后72℃延伸7min。
1min，72℃延伸1min，运行35个循环；最后72℃延伸7min。
[0012] 一种米尔顿姬小蜂分子检测引物的应用，所述米尔顿姬小蜂分子检测引物能应用于米尔顿姬小蜂检测用引物的试剂盒。
[0013] 本发明的有益效果为：本发明根据米尔顿姬小蜂ITS序列设计引物，该引物可用于米尔顿姬小蜂的PCR检测。而且本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，以方便使用。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否为米尔顿姬小蜂，为进出口安全提供了保证。
附图说明
[0014] 图1是米尔顿姬小蜂PCR方法的特异性试验结果。M为100 bp的DNA Marker，1为桉树枝瘿姬小蜂的检测结果，2为刺桐姬小蜂的检测结果，3为米尔顿姬小蜂的检测结果。
[0015] 图2 是单只米尔顿姬小蜂PCR方法的试验结果。
具体实施方式
[0016] 实施例1
[0017] 1）总DNA的提取
[0018] 方法一：多只昆虫总DNA的提取
[0019] 采用TaKaRa公司生产的通用基因组DNA提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 3.0）提取基因组DNA，包括如下步骤：
[0020] （1）将30只昆虫放入研钵中，加入500µL的Solution A (TaKaRa公司的试剂盒提供)和1.0µL的RNase A1(TaKaRa公司的试剂盒提供)碾磨，将匀浆收集至Collection Tube(TaKaRa公司的试剂盒提供)中；
[0021] （2）用200 µL的Solution A冲洗研钵并转移至Collection Tube中，65 ℃保温5-10 min；
[0022] （3）向Collection Tube中加入400 µL的Solution B(TaKaRa公司的试剂盒提供)，振荡混合；再加入1 mL的4℃预冷的Solution C(TaKaRa公司的试剂盒提供)，充分混匀后，12000 rpm离心2 min；
[0023] （4）弃去上层的有机相，再加入1 mL的4 ℃预冷的Solution C，充分混匀后，12000rpm离心2 min；
[0024] （5） 弃去上层的有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移到置于Collection Tube上的Filter Cup(TaKaRa公司的试剂盒提供)中，12000 rpm离心1 min；
[0025] （6）弃Filter Cup，在滤液中加入400µL的DB Buffer(TaKaRa公司的试剂盒提供)，混合均匀；
[0026] （7）将试剂盒中的Spin Column(TaKaRa公司的试剂盒提供)安置于Collection Tube上，将上述步骤6得到的混合溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，弃滤液；
[0027] （8）将500 µL的Rinse A(TaKaRa公司的试剂盒提供)加入至Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液；
[0028] （9）将700 µL的Rinse B(TaKaRa公司的试剂盒提供)加入至Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液；
[0029] （10）重复操作步骤（9）；
[0030] （11）将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50 µL的65 ℃灭菌蒸馏水，室温静置1 min；
[0031] （12）12000 rpm离心1 min洗脱后得到DNA；
[0032] （13）将提取好的总DNA放于-20 ℃保存，备用。
[0033] 方法二：单只昆虫总DNA的提取
[0034] 将单只昆虫用研钵捣碎，用100 µL 10 × TE缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0)冲洗至1.5 mL离心管中；浸泡1h，盖紧离心管盖并用封口膜密封，振荡，置于微波炉中700 W加热2 min；重复3次，立即将离心管转入冰浴2 min, 12000 r/min离心1 min，吸取10 µL上清液作为 PCR 模板。
[0035] 2）引物设计和合成
[0036] 通过测定米尔顿姬小蜂的ITS序列的基础上，应用Primer premier 5软件比对设计特异引物，获得米尔顿姬小蜂分子检测特异引物序列。所述米尔顿姬小蜂分子检测引物的DNA序列为：
[0037] 上游引物（MITS2F）： 5′-TCGGAAGTGTCAATAGGCG-3′；
[0038] 下游引物（MITS2R）： 5′-TCCATCTCGCATTACCCTC-3′
[0039] 3）PCR扩增方法的建立
[0040] 以上述提取的总DNA为模板，用引物MITS2F和MITS2R进行PCR扩增。PCR反应TM体系为25μl，其中2.5 µL 10×Dream Taq 缓冲液(含 20 mmol∕L MgCl2)（立陶宛Fermentas公司），dNTP 混合物(2.5 mmol∕L) 2µL（立陶宛Fermentas公司），10µmol∕LTM
的上游引物MITS2F 1.5µL，10µmol∕L的下游引物MITS2R 1.5 µL，5U/µL的Dream Taq DNA Polymerase 0.2 µL（立陶宛Fermentas公司），多只昆虫总DNA 4 µL（单只昆虫总DNA
10 µL），加灭菌双蒸水至终体积。PCR反应程序如下：95℃预变性3 min；94℃变性45s，58 ℃退火1min，72℃延伸1 min，运行35个循环；最后72℃延伸7min。
的上游引物MITS2F 1.5µL，10µmol∕L的下游引物MITS2R 1.5 µL，5U/µL的Dream Taq DNA Polymerase 0.2 µL（立陶宛Fermentas公司），多只昆虫总DNA 4 µL（单只昆虫总DNA
10 µL），加灭菌双蒸水至终体积。PCR反应程序如下：95℃预变性3 min；94℃变性45s，58 ℃退火1min，72℃延伸1 min，运行35个循环；最后72℃延伸7min。
[0041] PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据是否扩增到317 bp的DNA片段判定昆虫样品是否为米尔顿姬小蜂。本实施例检测方法能够快速准确地判断昆虫样品是否为米尔顿姬小蜂，为进出口安全提供了保证。
[0042] 实施例2
[0043] 米尔顿姬小蜂PCR方法的特异性检测
[0044] 分别取30只的米尔顿姬小蜂、桉树枝瘿姬小蜂、刺桐姬小蜂，按实施例1方法分别提取总DNA，再进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果在米尔顿姬小蜂中检出317 bp的DNA片段，而桉树枝瘿姬小蜂、刺桐姬小蜂中均未检出317 bp的DNA片段。检测结果如图1所示。表明建立的PCR方法具有良好的特异性，可用于米尔顿姬小蜂的快速检测。
[0045] 实施例3
[0046] 单只米尔顿姬小蜂的PCR检测
[0047] 取单只米尔顿姬小蜂，按实施例1方法提取总DNA，再进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果在单只米尔顿姬小蜂中检出317 bp的DNA片段。检测结果如图2所示。表明建立的PCR方法具有良好的灵敏性，可用于单只米尔顿姬小蜂的快速检测。