一种骨肽组合物及其制剂、制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种骨肽组合物，该骨肽组合物包括：骨多肽化合物A 8～10重量份、骨多肽化合物B 5～8重量份、骨多肽化合物C 5～8重量份、骨多肽化合物D 4.5～7.5重量份、骨多肽化合物E 3～6重量份、游离氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游离脂肪酸0～0.01重量份；其中对骨多肽化合物A、B、C、D、E的氨基酸序列进行了测定；本发明还涉及该骨肽组合物的制备方法及用途，该骨肽组合物的制备方法简便、易于操作、收率高，所制备的骨肽组合物的生物活性高。

权利要求

1.一种骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物包括：骨多肽化合物A 8～10重量份、骨多肽化合物B 5～8重量份、骨多肽化合物C 5～8重量份、骨多肽化合物D 4.5～

7.5重量份、骨多肽化合物E 3～6重量份、游离氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游离脂肪酸0～0.01重量份；

其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

2.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物包括：骨多肽化合物A 8.5～10重量份、骨多肽化合物B 5.5～8重量份、骨多肽化合物C 5.5～8重量份、骨多肽化合物D 5～7.5重量份、骨多肽化合物E 3.2～6重量份、游离氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游离脂肪酸0～0.005重量份。

3.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和酪氨酸。

4.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。

5.根据权利要求1所述的骨肽组合物，其特征在于，将所述的骨肽组合物制备成注射剂，所述的注射剂包括水针、粉针和输液。

6.根据权利要求5所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的注射剂中还添加赋形剂、稳定剂、pH值调节剂。

7.根据权利要求1～4任一权利要求所述的骨肽组合物，其特征在于，所述骨肽组合物的制备方法包括以下步骤：（1）取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨，洗净，压碎；

（2）压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，放入提取罐中，加3～6倍量水，80～100℃保温搅拌1～2小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入2～4倍量水，80～100℃保温搅拌

1～2小时，取上清液；合并二次得到的上清液浓缩至原料重；

（3）将步骤（2）中得到的溶液于-5～0℃条件下，放置12～24小时，除去上层脂肪；

（4）溶液用盐酸调pH值4.5～5.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，去除上层脂肪，低温离心；

（5）酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值7.5～9.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，去除上层脂肪，低温离心；

（6）溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液浓缩至规定体积；

（7）溶液用盐酸调pH值4.5～5.0，按溶液量的0.1%加入药用活性炭，加热至100℃搅拌吸附30min，冷却降温至30～35℃，用0.22μm微孔滤膜过滤得精滤液；

（8）精滤液用氢氧化钠溶液调pH6.5～7.5，用6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；

（9）超滤液减压干燥，即得本发明的骨肽组合物。

8.根据权利要求7所述的骨肽组合物，其特征在于，在步骤（2）中，将所述的骨泥采用微波作用，微波功率为450W，作用时间为5～30分钟；然后再放入提取罐中提取。

9.根据权利要求8所述的骨肽组合物，其特征在于，作用时间为5～15分钟。

10.根据权利要求7所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物制备方法中的浓缩均采用减压浓缩，温度为50~80℃。

11.根据权利要求10所述的骨肽组合物，其特征在于，温度为60～70℃。

12.根据权利要求7所述的骨肽组合物，其特征在于，在步骤中的（3）、（4）、（5）中，在

0℃条件下放置12～18h，去除上层脂肪；在步骤中的（4）和（5）中，所述的离心的条件为

2000～4000转/分钟，离心10～30分钟。

13.根据权利要求12所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的离心的条件为2000～

3000转/分钟。

14.根据权利要求12所述的骨肽组合物，其特征在于，所述的离心时间为10～20分钟。

15.权利要求1所述的骨肽组合物在制备抗炎，镇痛，促进骨折愈合药物中的应用。

说明书

一种骨肽组合物及其制剂、制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种药物组合物，具体讲，涉及一种骨肽组合物及其制剂、制备方法和应用。

背景技术

[0002] 从动物骨中提取的提取物，其主要成分为小分子多肽类物质，是由胶原蛋白分解而来的小分子肽类混合物，具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，以及调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松的作用，临床上主要用于促进骨折愈合。其中，多肽提取物可通过补充和增加各种成骨因子，直接作用于成骨软骨及破骨细胞，促进骨与软骨基质的合成，加速损伤愈合与修复；同时，动物骨中的多肽提取物还可以促进体内生长激素、促甲状腺激素、甲状腺激素的分泌，同时全面促进人体代谢、间接调节骨与软骨的生长代谢，最终促进骨质形成，提高骨愈合质量。

[0003] 现有技术中公开了很多关于骨肽、骨肽注射剂的报道和研究。针对骨肽提取的工艺做了一系列深入的研究。例如在专利申请200510076912.8，骨肽注射液及其制备方法，该专利中公开了一种新的骨肽注射液制备方法及由该方法得到的产品，其制备方法如下：1).将哺乳动物骨用盐水热压煮提一次或多次，离心过滤，合并煮提液，在低温下放置1～
40小时，将提取液温热后离心过滤，收集滤液备用；2)将滤液真空浓缩后加入乙醇，静置沉淀，吸出上层醇液，定容回收乙醇，得水提液；3)将水提液加等体积蒸馏水，依次通过弱酸性阳离子树脂柱、弱碱性阴离子树脂柱、珠状壳聚糖柱和壳聚糖改性活性炭柱，去杂纯化，得纯净稀药液；4)将纯净稀药液浓缩后，加压过微孔滤膜，将滤液灌装、熔封、热压灭菌，或将所得药液通过冷冻干燥，得到冻干粉针剂。该方法制备工艺复杂，需要采用多种提取柱子，成本高，不适用于大规模的工业化生产。

[0004] 专利申请03111084.3骨肽氯化钠注射液及其制备工艺，公开了一种骨肽氯化钠注射剂，该产品由骨肽溶液、氯化钠和注射用水构成，其制备工艺包括以下过程：取胎牛四肢骨，加纯水于100～120℃热压提取两次，每次0.5～2小时，提取液过滤，用HCI调pH值3.0～5.5静置15～24小时，离心，取上清液用NaOH调pH值8.0～10.0，在-10℃～-25℃冷冻24小时以上，取出融化，离心，取上清液，用HCI调pH值至6.5～7.5，加热至70～
100℃，离心，取上清液，用分子量5000～10000膜超滤，收集超滤液，制得骨肽溶液；在浓度为3％的氯化钠溶液中加入0.05～2％g/ml的活性炭，煮沸5～30分钟，过滤脱炭，冷却至室温，0.45um微孔滤膜过滤，加入处方量的所述的超滤液，调pH值6.5～7.5，用0.22um微孔滤膜除菌，于100～115C℃灭菌30分钟。该专利的提取方法中采用了高压提取，并且提取工艺的时程很长，会对提取物的生物活性产生影响。

[0005] 已有技术中未对所提取的骨肽提取物的成分进行分析，并且已有技术中的提取方法还有一系列缺陷，例如大分子物质含量高、游离脂肪酸含量高等，本发明对提取技术进行了近一步的改进，大幅度的提高了产率，大大降低了大分子物质、游离脂肪酸的含量；并且本发明还对所制备得到的骨肽提取物做了进一步的研究，研究了其组成成分，测定了其中含有的多肽物质的序列及其含量，通过测定可知，本发明的骨肽提取物中多肽物质的含量较现有技术有大幅度的提高。并且通过药理实验证明，本发明的骨肽提取物具有更好的治疗效果。

发明内容

[0006] 本发明的首要发明目的在于提出一种骨肽组合物。

[0007] 本发明的第二发明目的在于提出该骨肽组合物的制剂。

[0008] 本发明的第三发明目的在于提出该骨肽组合物的制备方法。

[0009] 本发明的第四发明目的在于提出该骨肽组合物的用途。

[0010] 为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：

[0011] 本发明涉及一种骨肽组合物，其特征在于，所述的骨肽组合物包括：骨多肽化合物A 8～10重量份、骨多肽化合物B 5～8重量份、骨多肽化合物C 5～8重量份、骨多肽化合物D 4.5～7.5重量份、骨多肽化合物E 3～6重量份、游离氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游离脂肪酸0～0.01重量份；

[0012] 其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。

[0013] 其中：

[0014] SEQ ID NO：1的氨基酸序列为：Arg-Glu-Asp-Arg-Val-Ala-Tyr-Phe-Phe-Glu-Pro-Arg；

[0015] SEQ ID NO：2的氨基酸序列为：Thr-Pro-Leu-Val-Gly-Lys-Thr-Thr-Trp-Pro-Leu-Lys；

[0016] SEQ ID NO：3的氨基酸序列为：

[0017] Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Gly-Leu；

[0018] SEQ ID NO：4的氨基酸序列为：

[0019] Lys-Leu-Leu-Gly-Val-Ala-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Arg；

[0020] SEQ ID NO：5的氨基酸序列为：Arg-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Gln-Pro-Pro-Arg。

[0021] 本发明的第一优选技术方案为：所述的骨肽组合物包括：骨多肽化合物A 8.5～10重量份、骨多肽化合物B 5.5～8重量份、骨多肽化合物C 5.5～8重量份、骨多肽化合物D 5～7.5重量份、骨多肽化合物E 3.2～6重量份、游离氨基酸16～22重量份、核糖
0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游离脂肪酸0～0.005重量份。

[0022] 本发明的第二优选技术方案为：所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸。

[0023] 本发明的第三优选技术方案为：所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。

[0024] 本发明还涉及利用本发明的骨肽组合物制备的注射剂，包括粉针、水针和输液。其中，所述的制剂采用公知的方法制备，可制备出不同剂量的制剂以适应患者的需要。

[0025] 本发明还涉及该骨肽组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0026] 1.取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨，洗净，压碎；

[0027] 2.压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，放入提取罐中，加3～6倍量水，80～100℃保温搅拌1～2小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入2～4倍量水，80～100℃保温搅拌1～2小时，取上清液；合并二次得到的上清液浓缩至原料重；

[0028] 3.将步骤(2)中得到的溶液于-5～0℃条件下，放置12～24小时，除去上层脂肪；

[0029] 4.溶液用盐酸调pH值4.5～5.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，去除上层脂肪，低温离心；

[0030] 5.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值7.5～9.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，去除上层脂肪，低温离心；

[0031] 6.溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液浓缩至规定体积；

[0032] 7.溶液用盐酸调pH值4.5～5.0，按溶液量的0.1％加入药用活性炭，加热至100℃搅拌吸附30min，冷却降温至30～35℃，用0.22μm微孔滤膜过滤得精滤液；

[0033] 8.精滤液用氢氧化钠溶液调pH6.5～7.5，用6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；

[0034] 9.超滤液减压干燥，即得本发明的骨肽组合物。

[0035] 本发明制备方法的第一优选技术方案为：在步骤(2)中，将所述的骨泥采用微波作用，微波功率为450W，作用时间为5～30分钟，优选5～15分钟。

[0036] 本发明制备方法的第二优选技术方案为：所述的骨肽组合物制备方法中的浓缩均采用减压浓缩，温度为50～80℃，优选60～70℃。

[0037] 本发明制备方法的第三优选技术方案为：在步骤中的(3)、(4)、(5)中，在0℃条件下放置12～18h，去除上层脂肪，低温离心去除沉淀。

[0038] 本发明制备方法的第四优选技术方案为：在步骤中的(4)和(5)中，所述的离心的条件为2000～4000转/分钟，优选2000～3000转/分钟；离心10～30分钟，优选10～20分钟。

[0039] 本发明制备方法的第五优选技术方案为：在步骤(9)中还可以添加赋形剂、稳定剂、pH值调节剂。

[0040] 将本发明制备得到的骨肽组合物通过高效液相色谱法进行分析，测得5种含量较高的多肽化合物，分别将其命名为骨多肽化合物A、骨多肽化合物B、骨多肽化合物C、骨多肽化合物D和骨多肽化合物E，并采用质谱法进行分析、测序，测得其氨基酸序列。同时采用高效液相色谱法测定了骨肽组合物中氨基酸的种类，采用比色法测定了其核糖的含量，采用原子吸收分光光度法测定了其微量元素的含量，采用滴定法测定了其游离脂肪酸的含量。

[0041] 下面对本发明的内容进行进一步的解释和说明：

[0042] 本发明提出了一种成分确切的骨肽组合物，经过检测，本发明的骨肽组合物中含有多肽化合物的总重量份为25.5～39.5，其中含量丰富的有5种多肽，本发明对含量相对丰富的多肽化合物采用高效液相色谱进行了分离，其中包括：多肽化合物A 8～10重量份、多肽化合物B 5～8重量份、多肽化合物C 5～8重量份、多肽化合物D 4.5～7.5重量份、多肽化合物E3～6重量份；并且采用质谱法对5种多肽化合物的氨基酸序列进行了分析。

[0043] 其中，高效液相色谱分离的条件为：C18色谱柱，250mm×50.0mm，5u；流动相A：含0.05％甲酸的水溶液；流动相B：乙腈；流速：1ml/min；柱温：40℃；

[0044] 梯度洗脱：

[0045]

[0046]

[0047] 洗脱时间依次为化合物A 13～14分钟，化合物B 15.5～16.5分钟，化合物C18～19分钟，化合物D 28～29分钟，化合物E 36～37分钟。其液相色谱图如图1所示。

[0048] 同时，本发明中还包括游离氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份和游离脂肪酸0～0.01重量份；本发明的骨肽组合物中游离脂肪酸的含量很低，这样增加了用药的安全性；本发明的骨肽组合物中的多肽含量高，使得本发明骨肽组合物的生物活性大大增强。

[0049] 本发明还提出了利用本发明的骨肽组合物制备的注射剂，其中包括粉针、水针和输液。可采用已知的方法，添加共知的辅料制备而成。

[0050] 本发明还提出了一种骨肽组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0051] 1.取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨，洗净，压碎；

[0052] 2.压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，放入提取罐中，加3～6倍量水，80～100℃保温搅拌1～2小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入2～4倍量水，80～100℃保温搅拌1～2小时，取上清液；合并二次得到的上清液50～60℃减压浓缩至原料重；

[0053] 在此步骤中，本发明将压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，再进行提取；现有技术中通常都将动物四肢骨压碎后直接进行提取，然后仅仅压碎的动物骨由于压碎后的形状大小不一，提取不完全；本发明将动物骨制备成骨泥，这样不仅可大大的提高产率，而且可使后续的提取步骤采用较温和的提取工艺即可达到很好的提取效果，因而本发明的后续步骤采用了温和的条件，从而缩短了反应时间，降低了反应强度，还可以提高本发明骨肽组合物的活性。进一步的，本发明还增加了对骨泥采用微波作用的步骤，微波可以增加蛋白质分子、脂肪分子等的运动，实验验证，可进一步提高提取效率。

[0054] 3.将步骤2中得到的溶液于-5～0℃条件下，放置12～24小时，优选0℃；除去上层脂肪；

[0055] 4.溶液用盐酸调pH值4.5～5.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，优选0℃；去除上层脂肪后低温离心；

[0056] 5.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值7.5～9.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，优选0℃；去除上层脂肪后低温离心；

[0057] 其中，本发明共采用了3次去除脂肪的步骤，第一次先将水提的溶液置于0℃条件下，去除上层脂肪，第二次在酸水解后，第三次在碱水解后；而现有技术中往往只在第一步水提后去除脂肪，而本发明通过实验和研究发现，在酸水解后和碱水解后，均会再产生和释放出一部分的脂肪酸，这些脂肪酸若不及时去除，会影响后续工艺步骤，增加超滤器的负担，并使最终产品中的游离脂肪酸的含量增加，从而降低产品的纯度，并为用药安全带来隐患。在酸水解步骤中产生的脂肪及时除去后，可提高碱水解的效率，避免脂肪酸在碱性条件下发生反应；除去碱水解后的产生的脂肪酸后，产品中脂肪酸的含量极低，减少超滤步骤需要过滤础去的杂质的量，减少超滤器负担，减少超滤这一步骤的时间，提高超滤的效率。

[0058] 6.溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液50～60℃减压浓缩至规定体积；优选减压浓缩；

[0059] 7.溶液用盐酸调pH值4.5～5.0，按溶液量的0.1％加入药用活性炭，加热至100℃搅拌吸附30min，冷却降温至30～35℃，用0.22μm微孔滤膜过滤得精滤液；

[0060] 8.精滤液用氢氧化钠溶液调pH6.5～7.5，用6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；

[0061] 9.超滤液50～60℃减压干燥，即得本发明的骨肽组合物。

[0062] 其中，本发明的水提步骤中采用了常压水解，在浓缩步骤中采用了减压浓缩，离心采用了低温、较低转速、较短时间离心；并且由于本发明的原料经过骨泥机处理，整体反应体系选用了温和的反应条件，水提、酸解、碱解步骤中的加热时间都较短。从而大大提高了所提取的骨肽组合物的生物活性。

[0063] 本发明中采用了微波处理骨泥原料，微波常常用于辅助合成，其优越性主要体现在反应的速度快，产率的提高，副产物的减少等方面。微波的主要作用分为热效应和非热效应。微波是一种电磁波，其频率范围约为300MHz～300GHz(波长为0.1～100cm)，介于无线电波和红外线之间。微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热。微波加热与传统加热不同之处在于，微波加热是从物质内部开始，瞬时达到需要的温度。同时，微波的非热效应会使生物体细胞在微波电磁场的作用下，使一些分子产生变形和振动，使细胞膜功能受到影响，使细胞膜内外液体的电状况发生变化，经试验证实，经过微波短时间处理后的骨泥，再经同样的条件进行水提减压浓缩，提取物的收率可增加1.8％左右。

[0064] 本发明的制备方法具有工艺简单、易于操作，并且收率高，可达到0.7～1.3％，工艺的时程短，大大提高了生产效率，为企业增加了效益。并且本发明制备得到的骨肽组合物的生物活性高，经动物实验和临床试验验证，具有更强的促进骨骼生长、抗炎、镇痛等的作用。

[0065] 在利用本发明的骨肽组合物制备注射剂的过程中，可添加赋形剂、稳定剂、pH值调节剂。其中，所述的赋形剂选自葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、木糖醇、蔗糖、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖醛酸及盐、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、琥珀酸钠、枸橼酸钠、烟酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇1000-4000、环糊精或其衍生物，但并不限于此；所述的抗氧化剂和稳定剂选自亚硫酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、硫代硫酸盐、谷胱甘肽、二硫基丙醇、硫代山梨醇、硫代水杨酸、EDTA、EDTA一钠、EDTA二钠、EDTA四钠等。

[0066] 本发明的注射剂包括成水针、粉针或输液等剂型，该剂型的制备方法为本领域技术人员所共知的方法。

[0067] 本发明的骨肽组合物可单独使用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的组合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

[0068] 其中本发明还涉及所述的骨肽组合物在制备抗炎，镇痛，促进骨折愈合药物中的应用，本发明的骨肽组合物可用于治疗骨折、股骨头坏死、骨愈合不良、骨质疏松、风湿、类风湿性关节炎、颈椎病、腰椎病、跟痛症、骨不连等疾病，及其辅助治疗。附图说明：

[0069] 图1为骨肽组合物的液相色谱图；

[0070] 图2为骨多肽化合物A的质谱分析图谱；

[0071] 图3为骨多肽化合物B的质谱分析图谱；

[0072] 图4为骨多肽化合物C的质谱分析图谱；

[0073] 图5为骨多肽化合物D的质谱分析图谱；

[0074] 图6为骨多肽化合物E的质谱分析图谱。

具体实施方式

[0075] 本发明的具体实施方式仅限于对本发明的内容进行进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。

[0076] 具体实施方式

[0077] 实施例1

[0078] 一种骨肽组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0079] 1.取健康新鲜冷冻的猪四肢骨，洗净，压碎；

[0080] 2.压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，放入提取罐中，加3倍量水，80℃保温搅拌2小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入2倍量水，80℃保温搅拌1小时，取上清液；合并二次得到的上清液60℃减压浓缩至原料重；

[0081] 3.将步骤2中得到的溶液于0℃条件下，放置12小时，除去上层脂肪；

[0082] 4.溶液用盐酸调pH值4.5，加热煮沸15min，过滤，冷却后，于0℃条件下放置12h，去除上层脂肪后离心；离心的条件为2000转/分钟，时间为30分钟；

[0083] 5.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值9.5，加热煮沸15min，过滤，冷却后，于0℃条件下放置12h；去除上层脂肪后离心；离心的条件为2000转/分钟，时间为30分钟；

[0084] 6.溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液60℃减压浓缩至规定体积；

[0085] 7.溶液用盐酸调pH值5.0，按溶液量的0.1％加入药用活性炭，加热至100℃搅拌吸附30min，冷却降温至35℃，用0.22μm微孔滤膜过滤得精滤液；

[0086] 8.精滤液用氢氧化钠溶液调pH6.5，用3000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；

[0087] 9.超滤液60℃减压干燥，即得本发明的骨肽组合物，其中，骨肽组合物的收率为：0.73％。

[0088] 10.再按照常规方法制备成粉针、水针或输液。

[0089] 通过高效液相色谱法得到图谱如附图1所示，通过质谱法、高效液相色谱法、比色法、原子吸收分光光度法检测制备所得的骨肽组合物，该骨肽组合物的组成为骨多肽化合物A8.05重量份、骨多肽化合物B 5.15重量份、骨多肽化合物C 5.08重量份、骨多肽化合物D 4.55重量份、骨多肽化合物E 3.10重量份、游离氨基酸20.5重量份、核糖3.4重量份、微量元素0.05重量份、游离脂肪酸0.0005重量份。其中5种骨多肽化合物的质谱图如附图2～6所示。

[0090] 实施例2

[0091] 一种骨肽组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0092] 1.取健康新鲜冷冻的猪的四肢骨，洗净，压碎；

[0093] 2.压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，将骨泥采用微波作用，微波功率为450W，作用时间为5分钟，后放入提取罐中，加6倍量水，100℃保温搅拌1小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入4倍量水，100℃保温搅拌1小时，取上清液；合并二次得到的上清液60℃减压浓缩至原料重；

[0094] 3.将步骤2中得到的溶液于0℃条件下，放置12小时，除去上层脂肪；

[0095] 4.溶液用盐酸调pH值4.5，加热煮沸20min，过滤，冷却后，于0℃条件下放置12～24h；去除上层脂肪后离心；离心的条件为3000转/分钟，时间为20分钟；

[0096] 5.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值7.5，加热煮沸15min，过滤，冷却后，于0℃条件下放置24h；去除上层脂肪后离心；离心的条件为3000转/分钟，时间为20分钟；

[0097] 6.溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液60℃减压浓缩至规定体积；

[0098] 7.溶液用盐酸调pH值5.0，按溶液量的0.1％加入药用活性炭，加热至100℃搅拌吸附30min，冷却降温至35℃，用0.22μm微孔滤膜过滤得精滤液；

[0099] 8.精滤液用氢氧化钠溶液调pH7.5，用6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；

[0100] 9.超滤液60℃减压干燥，即得本发明的骨肽组合物，其中，收率为0.92％。

[0101] 10.再按照常规方法制备成粉针、水针或输液。

[0102] 通过高效液相色谱法得到图谱如附图1所示，通过质谱法、高效液相色谱法、比色法、原子吸收分光光度法检测制备所得的骨肽组合物，该骨肽组合物的组成为：骨多肽化合物A9.5重量份、骨多肽化合物B 7.8重量份、骨多肽化合物C 7.5重量份、骨多肽化合物D7.2重量份、骨多肽化合物E 5.6重量份、游离氨基酸18重量份、核糖2.4重量份、微量元素
0.11重量份、游离脂肪酸未检出。

[0103] 实施例3

[0104] 一种骨肽组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0105] 1.取健康新鲜冷冻的胎牛的四肢骨，洗净，压碎；

[0106] 2.压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，将骨泥采用微波作用，微波功率为450W，作用时间为15分钟，后放入提取罐中，加4倍量水，90℃保温搅拌1.5小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入3倍量水，90℃保温搅拌1.5小时，取上清液；合并二次得到的上清液60℃减压浓缩至原料重；

[0107] 3.将步骤2中得到的溶液于0℃条件下，放置18小时，除去上层脂肪；

[0108] 4.溶液用盐酸调pH值5.0，加热煮沸20min，过滤，冷却后，于-5℃条件下放置18h，去除上层脂肪，低温解冻后离心；离心的条件为3000转/分钟，时间为10分钟；

[0109] 5.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值9.0，加热煮沸20min，过滤，冷却后，于-5℃条件下放置18h；去除上层脂肪，低温解冻后离心；离心的条件为3000转/分钟，时间为10分钟；

[0110] 6.溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液60℃减压浓缩至规定体积；

[0111] 7.溶液用盐酸调pH值4.5，按溶液量的0.1％加入药用活性炭，加热至100℃搅拌吸附30min，冷却降温至32℃，用0.22μm微孔滤膜过滤得精滤液；

[0112] 8.精滤液用氢氧化钠溶液调pH7.0，用4000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；

[0113] 9.超滤液60℃减压浓缩干燥，即得本发明的骨肽组合物，其中，收率为1.21％。

[0114] 10.再按照常规方法制备成粉针、水针或输液。

[0115] 通过高效液相色谱法得到图谱如附图1所示，通过质谱法、高效液相色谱法、比色法、原子吸收分光光度法检测制备所得的骨肽组合物，该骨肽组合物的组成为：骨多肽化合物A9.8重量份、骨多肽化合物B 7.6重量份、骨多肽化合物C 7.7重量份、骨多肽化合物D7.3重量份、骨多肽化合物E 5.7重量份、游离氨基酸18重量份、核糖22重量份、微量元素
0.10重量份、游离脂肪酸未检出。

[0116] 实施例4

[0117] 一种骨肽组合物的粉针，其组成为：

[0118] 骨多肽化合物A10重量份、骨多肽化合物B 8重量份、骨多肽化合物C 8重量份、骨多肽化合物D 7.5重量份、骨多肽化合物E6重量份、游离氨基酸16重量份、核糖0.3重量份、微量元素0.04重量份、游离脂肪酸未检出；

[0119] 将上述的骨肽组合物25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨肽组合物的冻干粉针；

[0120] 其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸；所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。

[0121] 实施例5

[0122] 一种骨肽组合物的粉针，其组成为：

[0123] 骨多肽化合物A 8重量份、骨多肽化合物B 5重量份、骨多肽化合物C 8重量份、骨多肽化合物D 4.5重量份、骨多肽化合物E 6重量份、游离氨基酸22重量份、核糖5.4重量份、微量元素0.12重量份、游离脂肪酸未检出；

[0124] 将上述的骨肽组合物25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨肽组合物的冻干粉针；

[0125] 其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；

[0126] 所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸；所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。

[0127] 实施例6

[0128] 一种骨肽组合物的输液，其组成为：

[0129] 骨多肽化合物A 8.5重量份、骨多肽化合物B 5.5重量份、骨多肽化合物C 5.5重量份、骨多肽化合物D 5重量份、骨多肽化合物E 32重量份、游离氨基酸22重量份、核糖0.3重量份、微量元素0.1重量份、游离脂肪酸0.005重量份；

[0130] 将上述的骨肽组合物100克，加入渗透压调节剂900克，加注射用水100L溶解后，分装成1000瓶，制备成上述的骨肽组合物的氯化钠输液；

[0131] 其中，骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸；所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。

[0132] 实施例7

[0133] 一种骨肽组合物的水针，其组成为：骨多肽化合物A 9重量份、骨多肽化合物B 8重量份、骨多肽化合物C 7.5重量份、骨多肽化合物D 7.2重量份、骨多肽化合物E 6重量份、游离氨基酸17重量份、核糖0.4重量份、微量元素0.08重量份、游离脂肪酸未检出。

[0134] 将上述的骨肽组合物25克，加注射用水5000ml溶解后，分装成1000支，制备成骨肽组合物的水针；

[0135] 其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸；所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。

[0136] 实施例8

[0137] 一种骨肽组合物的粉针，其组成为：

[0138] 骨多肽化合物A 9.5重量份、骨多肽化合物B 7.6重量份、骨多肽化合物C 7.6重量份、骨多肽化合物D 72重量份、骨多肽化合物E 5.8重量份、游离氨基酸18重量份、核糖2.4重量份、微量元素0.06重量份、游离脂肪酸未检出；

[0139] 将上述的骨肽组合物25克，加入赋形剂100克，加注射用水溶解后，冻干制备成骨肽组合物的冻干粉针；

[0140] 其中所述的骨多肽化合物A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；骨多肽化合物B的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；骨多肽化合物C的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；骨多肽化合物D的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；骨多肽化合物E的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；所述的氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸；所述的微量元素包括钙、锂、钠、镁、硅、磷、钾、硫、锰、铁和锶。

[0141] 比较例1：对比微波处理骨泥的效果

[0142] D1组采用实施例2中的制备方法处理猪四猪骨100kg，D2组采用实施例2中的方法处理猪四猪骨100kg，唯一不同之处在于在步骤(2)中不采用微波作用，按照生产工艺，采用相同的条件减压浓缩干燥，其中D1组得到骨肽组合物920g，D2组得到骨肽组合物730g。

[0143] 比较例2：除去脂肪的效果

[0144] D1组采用实施例2中的制备方法处理猪四猪骨100kg，D3组采用实施例2中的方法处理猪四猪骨100kg，唯一不同之处在于在步骤(4)和(5)中没有冷冻去除上层脂肪的步骤，经减压干燥得到骨肽组合物。其中采用相同的方法对其游离脂肪酸含量进行测定，其中D1中游离脂肪酸未检出，而D3中的游离脂肪酸含量为：3.35％。

[0145] 实验例1药理作用：抗炎活性试验：

[0146] 1.实验材料：

[0147] 实验动物：体重200～230g雄性大白鼠30只，随机分成3组，每组10只：

[0148] 供试药品：实施例8的骨肽组合物的冻干粉针，以及对比药物1；

[0149] 对比药物1的制备：取新鲜冷冻的健康猪四肢骨，用纯化水清洗三遍后，置液压机上压碎，将压碎的四肢骨，置夹层锅中，按原料重量1∶1加入5％NaOH溶液，加热30℃水解12小时后取上清液。上清液置夹层锅中用6M HCl调pH值3.0，加热至70℃40min，冷却降温至30℃，静置12小时后用滤布过滤，取过滤液置夹层锅中用5M NaOH溶液调pH值8.0，加热至70℃40min，冷却降温至30℃，静置12小时后用滤布过滤，得粗滤液，粗滤液置夹层锅中用6M HCl调pH值4.0，按药液量加入0.01％药用活性炭加热至80℃搅拌吸附30min后，冷却降温至30℃，0.45um微孔滤膜过滤除炭，再用0.22um微孔滤膜过滤得精滤液，精滤液用5MNaOH调pH值6.0，药液温度15℃，分别用10000和6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液。超滤液浓缩干燥，按照实施例4的配方制备成冻干粉针；

[0150] 2.实验分组

[0151] 共3个给药组

[0152] 对照组1给等量的生理盐水溶液；

[0153] 对照组2给等量的对比药物110mg/kg；

[0154] 实验组给予实施例8的骨肽组合物的冻干粉针10mg/kg。

[0155] 3.实验过程：给药后1小时向大鼠右后足掌皮内注入新鲜蛋清0.1ml，注射后立即测量左侧踝关节周长。在注入蛋清后1、2、3、4、5和6小时各测量一次肿胀的右踝关节周长，左右周长之差为肿胀程度，在各时间内进行统计学比较。

[0156] 4.实验结果：

[0157] 数据见表1，结果表明在注射蛋清1/2、1、2、4小时后，给药组与对照组比较差异非常显著(p＜0.01)，给药组肿胀程度较对照组显著减轻。通过统计学分析，实验组较对照组1相比具有显著性差异，并且实验组较对照组2相比也具有显著性差异，说明本发明的骨肽组合物具有明显的抗炎活性，并且其活性要高于对比药物1，差异显著。证实本发明的骨肽组合物的生物活性高于对比药物。

[0158] 表1骨肽组合物对大鼠蛋清性关节肿的作用

[0159]

[0160] 其中，化合物A组VS对照组1：**P＜0.01；化合物A组VS对照组2：ΔP＜0.05。

[0161] 采用本发明其他实施例的制剂进行试验，取得了相同的效果。

[0162] 实验例2镇痛试验：

[0163] 采用本领域技术人员公知的热板法对本发明骨肽组合物的镇痛作用进行试验。

[0164] 1.实验材料：

[0165] 实验动物：体重雌性小白鼠30只，随机分成3组，每组10只：

[0166] 供试药品：实施例5的骨肽组合物粉针以及对比药物2；

[0167] 对比药物2的制备：取胎牛四肢骨，加纯水于100～120℃热压提取两次，每次0.5～2小时，提取液过滤，用HCI调pH值3.0～5.5静置15～24小时，离心，取上清液用NaOH调pH值8.0～10.0，在-10℃～-25℃冷冻24小时以上，取出融化，离心，取上清液，用HCI调pH值至6.5～7.5，加热至70～100℃，离心，取上清液，用分子量5000～10000膜超滤，收集超滤液。干燥后按实施例4的配方制备成粉针。

[0168] 2.实验分组

[0169] 共4个给药组

[0170] 实验组：腹腔注射实施例5的骨肽组合物粉针10mg/kg；

[0171] 阳性药组：腹腔注射吗啡10mg/kg；

[0172] 对照组1给等量的生理盐水溶液；

[0173] 对照组2给等量的对比药物2：10mg/kg。

[0174] 3.实验过程：开启超级恒温器，调节超级恒温器温度恒定于55±0.1℃。取雌性小白鼠，于实验前预先挑选合格者。

[0175] 3.1.将筛选合格的小白鼠分组，测每只小白鼠的正常痛阈值一次，作为该鼠给药前痛阈值。

[0176] 3.2.分组给药后15min、30min各测小白鼠痛阈一次，如果用药后放入瓷罐内60秒钟仍无反应，即将小白鼠取出，以免时间太长把脚烫伤，其痛阈可按60秒计算。

[0177] 3.3.实验完毕，计算各给药组的用药前后各次的小鼠热痛反应时间(即痛阈值)的平均值，并按下列公式计算痛阈提高百分率。

[0178]

[0179] 4.实验结果：

[0180] 表2：骨肽组合物对热板法致痛小鼠痛阈的影响

[0181]** * Δ

[0182] 注：与生理盐水组比较，p＜0.01，p＜0.05；与对照组2比较：P＜0.05[0183] 试验结果表明：本发明的骨肽组合物和吗啡组均有镇痛作用，本发明的骨肽组合物与生理盐水组相比差异极显著，与对比药物2相比差异显著。证实本发明的骨肽组合物的生物活性高于对比药物。

[0184] 采用本发明其他实施例的骨肽组合物进行试验，取得了相同的效果。

[0185] 实验例3镇痛试验

[0186] 采用本领域技术人员公知的扭体法对本发明的骨肽组合物的镇痛作用进行试验。

[0187] 1.实验材料：

[0188] 实验动物：体重雌性小白鼠40只，随机分成4组，每组10只：

[0189] 供试药品：实施例5制备的骨肽组合物的粉针，以及实验例1中制备的对比药物1。

[0190] 2.实验分组

[0191] 共4个给药组

[0192] 实验组：给予实施例5的骨肽组合物的粉针10mg/kg；

[0193] 阳性药组：腹腔注射安痛定0.1mg/kg；

[0194] 对照组1给等量的生理盐水溶液；

[0195] 对照组2给等量的实验例1制备的对比药物1：10mg/kg。

[0196] 3.实验步骤和结果

[0197] 将分组动物腹腔注射0.6％的醋酸生理盐水溶液，观察扭体反应。平均安排观察人员，统一扭体标准，得到实验数据如表3所示。

[0198] 表3骨肽组合物对小鼠扭体反应的影响

[0199]组别 动物个数 剂量(mg/kg) 15min扭体次数(x±s)
阳性对照组：安痛定 10 0.01 2.6±0.9*Δ
实验组 10 10 1.8±1.3*Δ
对照组1：生理盐水 10 10 14.3±3.1
对照组2：对比药物1 10 10 3.2±2.3

[0200] 注：与生理盐水组比较，**p＜0.01，*p＜0.05；与对照组2比较：ΔP＜0.05[0201] 统计结果表明，安痛定组和实验组与对照组1比较，有显著差异，说明本发明的骨肽组合物具有一定的镇痛作用，实验组与对照组2比较，数据均有显著差异，说明本发明的骨肽组合物的活性要高于对比药物1，差异显著。证实本发明的骨肽组合物的生物活性高于对比药物。

[0202] 采用本发明其他实施例制备的制剂进行试验，取得了相同的效果。

[0203] 实验例4促进骨折愈合试验：

[0204] 将实验大鼠分为2组(1个实验组，一个对照组)，将其小腿人为造成闭合性人工骨折，每组分别隔天腹腔注射实施例7的骨肽组合物水针，对照组隔天腹腔注射生理盐水，然后分别于给药后的第10天和第20天处死实验大鼠，观察骨折愈合处情况。

[0205] 结果给药后10天：

[0206] 生理盐水组：大鼠骨折断端仅有少量纤维成骨，仍可见碎骨片，骨折断端明显不连续；

[0207] 骨肽组合物组：均可见大量纤维成骨，可见新生骨质；

[0208] 给药后20天；

[0209] 生理盐水组：可见中等量纤维成骨，有大量肉芽组织爬行替代骨折断端骨质缺损，但新生骨质不明显；

[0210] 骨肽组合物组：均可见大量新生骨质，且新生骨质排列规则，骨折线已不可见。

[0211] 试验结果表明：本发明的骨肽组合物具有明显的促进骨折愈合作用。

[0212] 实验例5细胞实验

[0213] 1.制备对比药物，按照实施例2中的制备方法，每组对比中仅修改一个步骤条件，其他的反应条件与实施例2相同，具体如表4所示：

[0214] 表4

[0215]

[0216] 2.进行细胞培养检测：

[0217] 用含10％的小牛血清MEM-aa培养液常规培养MG-63细胞，0.05％胰蛋白酶-0.08％EDTA的消化传代培养，消化后收集到的细胞用含10％的小牛血清的MEM-aa培4
养液调整细胞密度的至5×10，接种到96孔细胞培养板，每孔100μL；

[0218] 其中10孔加含10％的小牛血清的MEM-aa培养液100μL不加细胞作为空白对照，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养过夜，弃培养液，加入实施例4的骨肽组合物200μL(0.1mg/ml)、对比药物a200μL(0.1mg/ml)、对比药物b200μL(0.1mg/ml)、对比药物c200μL(0.1mg/ml)、对比药物d200μL(0.1mg/ml；每个供试品做10孔(n＝10)；

[0219] 细胞对照组和空白对照组每孔分别加入MEM-aa培养基200μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，结束培养前4小时，弃培养液，每孔加入0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.3)洗涤两次，每孔加入100μL、0.1％的Triton X-100溶液，放置在-20℃冰箱中反-3 -1复冻融2次以完全裂解细胞，每孔加入3×10 mol·L 对硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)溶液及-1
DEA缓冲液各50μL，于37℃温箱内反应30min后，每孔加入0.2mol·L 的NaOH 50μL终止反应，于酶标仪405nm处测定OD值。

[0220] 比较各组药物与细胞对照间的统计学差异并按照下列公式计算刺激指数。

[0221] 公式为：

[0222]

[0223] 经过计算，各待测药物的刺激指数如表7所示：

[0224] 表7：

[0225]待测药物 刺激指数
实施例2的骨肽组合物 4.87
对比药物a 3.18
对比药物b 3.25
对比药物c 3.08
对比药物d 3.45

[0226] 从实验结果可以看出，本发明的实施例2的骨肽组合物的刺激指数高于对比药物，说明本发明对工艺的改进可提高骨肽组合物的生物活性。