杨梅突发性枝叶凋萎病病原菌鉴定方法

摘要

本发明提供一种杨梅突发性枝叶凋萎病病原菌鉴定方法，它包括：用解剖刀小心分离发病杨梅枝干的木质部和韧皮部，韧皮部和木质部分别剪成小块组织，不需要表面消毒，放置到PDA平板上，在25℃恒温箱培养2d后，挑取绒毛状真菌菌丝，转接到一个新的PDA平板上，25℃恒温箱继续培养5d后，取0.5cm2的纯化菌丝块用来做致病性接种实验。离体检测杨梅突发性枝叶凋萎病的病原菌方法可靠，速度快，不需要昂贵的材料，步骤简单，准确率高。

权利要求

1.一种杨梅突发性枝叶凋萎病病原菌鉴定方法，其特征在于它包括：(1)、用解剖刀小2

心分离发病杨梅枝干的木质部和韧皮部，韧皮部和木质部分别剪成3-4mm 的小块组织，不需要表面消毒，轻轻放置到PDA平板上，在25℃恒温箱培养2d后，挑取绒毛状真菌菌丝，转2

接到一个新的PDA平板上，25℃恒温箱继续培养5d后，取0.5cm 的纯化菌丝块用来做致病性接种实验；(2)、在培养皿内平铺好滤纸，用无菌水浸湿，取新生的杨梅嫩梢，剪成5-6cm长的短枝，使9cm的培养皿能水平放置2根短枝；每根短枝上撕掉两个叶片并露出叶痕，用2

步骤1中获得的0.5cm 的纯化菌丝块轻轻放置到露出的叶痕位置，在短枝的两端用脱脂棉吸水保湿；置于25℃的培养箱内，12h光照和12h黑暗；培养4天后调查杨梅嫩梢的发病情况；如果接种的叶痕位置变黑即为拟盘多毛孢属致病症状。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法还包括在田间进一步的验证实验，包括如下步骤：在自然条件下，把吸有无菌水的适当大小的脱脂棉缠到嫩梢顶端下的第102

片叶位置的枝条上，撕掉距杨梅树嫩梢顶端的第3或4片叶，把0.5cm 的纯化菌丝块轻轻放置到露出的叶痕位置，用保鲜膜条轻轻固定菌块，用保鲜袋保湿；接种后4天调查杨梅嫩梢的发病情况；如果接种的叶痕位置变黑即为拟盘多毛孢属致病症状；如果症状为沿着枝干慢慢延伸，到叶柄位置会沿着叶柄位置延伸到整个叶片变黑更为确定为拟盘多毛孢属致病症状。

说明书

杨梅突发性枝叶凋萎病病原菌鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物病害鉴定领域，具体涉及一种杨梅突发性枝叶凋萎病的鉴定方法。

背景技术

[0002] 杨梅(Myrica rubra)是我国南方特有水果，果实甜酸适口，风味独特，在国内外享有盛誉，因其显著的经济与生态效益，目前全国杨梅栽培已达300万亩以上。2008年我省杨梅栽培面积已近120万亩，产量35余万吨，总产值达20多亿元。在杨梅产业对山区农民脱贫致富发挥越来越重要作用之际，近年发生的新型病害杨梅突发性枝叶凋萎病已在我省仙居、瑞安、临海、黄岩等地大面积发生，据不完全统计，仅仙居一地濒临枯死的面积就已达5000余亩，可见杨梅突发性枝叶凋萎病具有广泛性、暴发性与毁灭性，已对我省杨梅产业造成了严重影响，并将成为杨梅产业健康发展的一个重大隐患，从而阻碍我省杨梅产业的持续稳定发展。

发明内容

[0003] 为了尽快找出造成这一病害的原因，本发明提供一种室内离体实验快速鉴定该病害并分离致病菌的方法。该方法包括：(1)、用解剖刀小心分离发病杨梅枝干的木质部和韧2
皮部，韧皮部和木质部分别剪成3-4mm 的小块组织，不需要表面消毒，轻轻放置到PDA平板上，在25℃恒温箱培养2d后，挑取绒毛状真菌菌丝，转接到一个新的PDA平板上，25℃恒温
2
箱继续培养5d后，取0.5cm 的纯化菌丝块用来做致病性接种实验。

[0004] 在一个优选的方法中，该方法还包括以下步骤2：在培养皿内平铺好滤纸，用无菌水浸湿，取新生的杨梅嫩梢，剪成5-6cm长的短枝，使9cm的培养皿能水平放置2根短枝；每2
根短枝上撕掉两个叶片并露出叶痕，用步骤1中获得的0.5cm 的纯化菌丝块轻轻放置到露出的叶痕位置，把短枝的两端用脱脂棉吸水保湿；置于25℃的培养箱内，12h光照和12h黑暗；培养4天后调查杨梅嫩梢的发病情况；如果接种的叶痕位置变黑即为拟盘多毛孢属致病症状。如果症状为然后沿着枝干慢慢延伸，到叶柄位置会沿着叶柄位置延伸到整个叶片变黑更为确定为拟盘多毛孢属致病症状。

[0005] 在另一个优选的方式中，还包括以下步骤3：在自然条件下，把步骤1中获得的适当大小的脱脂棉吸无菌水缠到嫩梢顶端下的第10片叶位置的枝条上，撕掉距杨梅树嫩梢2
顶端的第3或4片叶，把0.5cm 的纯化菌丝块轻轻放置到露出的叶痕位置，用保鲜膜条轻轻固定菌块，用保鲜袋保湿；接种后4天调查杨梅嫩梢的发病情况；如果接种的叶痕位置变黑即为拟盘多毛孢属致病症状。如果症状为然后沿着枝干慢慢延伸，到叶柄位置会沿着叶柄位置延伸到整个叶片变黑更为确定为拟盘多毛孢属致病症状。

[0006] 有益效果

[0007] 离体检测杨梅突发性枝叶凋萎病的病原菌方法可靠，速度快，不需要昂贵的材料，步骤简单，准确率高。

附图说明

[0008] 图1杨梅突发性枝叶凋萎病病症在实际田间不同部位的症状。A为枝梢叶片急性青枯图，B为叶片渐渐呈枯黄而不落叶；C典型的顶枝枯黄；D顶枝和内膛枝同时发生；E整株枯死；F幼树枯死；G幼树枝干韧皮部开裂；H根系枯死；I成片发生；J全树落叶枯死。

[0009] 图2分离菌株接种杨梅的致病性接种实验。A和B是离体接种实验。A为对照实验(CK)不接种菌块；B接种菌块。C和D是活体接种实验。C为接种后7天发病症状。D接种后15天发病症状。

[0010] 图3病原菌形态。A和B是分离菌株在PDA平板上25℃暗培养5天菌落正面。C和D是分离菌株在PDA平板上25℃暗培养5天，然后12h光照12h黑暗培养5天的菌落正面。E分离菌株在PDA平板上25℃暗培养5天菌落背面。F是分离菌株在PDA平板上25℃暗培养5天，然后12h光照12h黑暗培养5天的菌落背面。G分生孢子。H分生孢子梗。

具体实施方式

[0011] 通过以下具体实施例，对本发明作进一步的具体说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限止。

[0012] 实验1病害田间症状调查

[0013] 杨梅突发性“枝叶凋萎”症主要集中爆发在10月至翌年的3-4月份，始现症状为当年生枝梢急性“凋萎”，即杨梅枝梢叶片首先急性青枯(图1A)，后渐渐呈枯黄(图1B)、褐黄直至枯死(图1E)，症状初现时不落叶，1-2个月后才渐渐落叶；无论顶枝还是内膛枝均有不同程度的发生(图1C和1D)，先零星后发生后渐渐增多，逐渐扩大呈成片发生(图1I)，山脚往往比山顶严重；幼树发生后在1-2月内地上部分就渐渐枯死(图1F)，并伴随枝干韧皮部开裂(图1G)，根系枯死(图1H)；大树发病当年枝梢枯死而枝杆正常，严重影响树势，树冠逐年减小，2～3年后杨梅果树林连片整株枯死(图1J)，发病当年产量一般损失达20～40％，严重的达80％以上，病势有逐年加重的趋向，直至绝收，树木枯死。

[0014] 实验2真菌分离

[0015] 2008-2010年分别从浙江仙居、黄岩、瑞安杨梅果园采集发病枝并随即进行病菌分离。分离方法如下：

[0016] 用PDA培养基(含氨苄青霉素钠100μg/mL，抑制细菌的生长)进行组织分离，用2
解剖刀小心分离枝干的木质部和韧皮部，韧皮部和木质部分别剪成3-4mm 的小块组织，不需要表面消毒，就轻轻放置到PDA平板上，在25℃恒温箱培养2d后，挑取纯化的绒毛状真菌
2
菌丝，转接到一个新的PDA平板上，25℃恒温箱继续培养5d后，取0.5cm 的纯化菌丝块用来做致病性接种实验。

[0017] 实验结果

[0018] 总共分离到真菌菌株259个，所有这些真菌菌株都用来首先做室内离体实验测定其对杨梅嫩梢的致病性。

[0019] 实验3离体接种试验

[0020] 培养皿内平铺好滤纸，用无菌水浸湿，取新生的杨梅嫩梢，剪成5-6cm长的短枝，叶片稍加修剪，使9cm的培养皿能水平放置2根短枝。每根短枝上撕掉两个叶片并露出叶2
痕，0.5cm 的纯化菌丝块轻轻放置到露出的叶痕位置，把短枝的两端用脱脂棉吸水保湿。置于25℃的培养箱内，12h光照和12h黑暗。培养4天后调查杨梅嫩梢的发病情况。不接种菌块同样处理的杨梅短枝做对照。选择幼嫩枝梢的叶痕位置接种是为了让发病速度较快并且操作方便，不用使用刀具创造伤口。

[0021] 实验结果

[0022] 经室内离体接种发现，95％的分离真菌菌株能对杨梅嫩梢致病，其余5％对杨梅嫩梢没影响，跟对照一样。与对照(图2A)相比，致病菌株对嫩梢致病情况(图2B)，首先接种的叶痕位置变黑，然后沿着枝干慢慢延伸，到叶柄位置会沿着叶柄位置延伸到整个叶片变黑。4天调查时在枝干以及叶柄、叶片等都会出现少量小黑点，是分生孢子器，时间越长，孢子器越多。

[0023] 同样，我们用同样与实验2的方法分离病株的叶片和根部的组织来分析目标致病菌，经过最后的分析鉴定，获得300个真菌菌株，其中大约有20％的分离真菌对杨梅嫩梢致病，其余80％对杨梅嫩梢没影响，跟对照一样。所以采用枝干的木质部和韧皮部的组织可以获得大量的致病菌，为接种鉴定提供了大量的样本。

[0024] 实验4果园接种

[0025] 针对室内离体实验对杨梅嫩梢致病的菌株在杨梅树上做致病性活体检测实验。本试验在浙江省农业科学院园艺研究所的大棚内5年生杨梅树、仙居和瑞安的10年生杨梅树上分别进行。适当太小的脱脂棉吸无菌水缠到嫩梢顶端下的第10片叶位置的枝条上，撕掉距杨梅树嫩梢顶端的第3或4片叶，把0.5cm2的纯化菌丝块轻轻放置到露出的叶痕位置，用保鲜膜条轻轻固定菌块，用保鲜袋保湿。接种后4天、7天和15天分别解开保鲜袋，并在不同时间进行调查拍照。不接种菌块同样处理的杨梅嫩梢做对照。

[0026] 实验结果

[0027] 接种结果见图2C和图2D，接种后4天观察，接种位置已经变黑(图片省略)，接种后7天，病已经沿着枝干蔓延到叶片上，叶片开始表现失水症状，到接种后15天嫩梢已经有多片叶片失水青枯，但是不脱落，发病症状与田间观察到的相同。

[0028] 实验5病菌分类鉴定

[0029] PDA平板25℃培养致病菌，观察菌落形态。分生孢子显微镜观察形态。参考中国真菌志进行病菌的分类鉴定。

[0030] 实验结果

[0031] 对杨梅致病的菌株，我们进行生长性状观察，发现有两类病菌，一类菌丝旺盛，白色，绒状(图3A)；另一类菌株气生菌丝聚集隆起，形成波浪状的同心轮纹(图3B)。黑色分生孢子堆在菌落上不规则散生(图3C)或者轮纹状(图3D)，边缘整齐。平板背面一般呈暗黄色(图3E)或者由于分生孢子堆的颜色掺杂有黑色(图3F)。分生孢子由5个细胞组成，多呈纺锤形，直立或弯曲，中间细胞褐色或黑褐色，顶端无色胞常着生2-5根附属丝，基部无色胞着生1根中生的柄，一般比顶端附属丝短而直(图3G)。分生孢子梗无色，有分枝，有分隔(图3H)。

[0032] 经过分类学的形态鉴定，引起杨梅突发性枝叶凋萎病的2类病菌都属于拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis Steyaert)。

[0033] 实验6病菌回分离

[0034] 将室内离体和植株活体发病的枝梢进行常规组织分离，分离方法和材料与同实验2。

[0035] 实验结果

[0036] 再次获得与接种菌株一致的病原菌，仍然属于拟盘多毛孢属真菌。