益生菌菌株及其应用

摘要

益生菌与食品的结合有助于抑制人体病源菌的孳生和吸收特殊的营养。然而，这些益生菌在食品加工的过程中要在高温下生存，并且进入人体后必须通过胃酸和胆盐的考验，才能顺利到达肠道。因此，本发明提供一种具有可抵抗环境压力的耐受性的枯草杆菌(Bacillus subtilis)菌株BS139，包括耐酸、耐胆盐以及耐高温等特性，其保存于美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural ResearchService，NRRL)，保藏编号为NRRL NO.B-50347。并可进一步应用于食品产品、医药组成物及日常用品的制备方面。

权利要求

1.一种枯草杆菌(Bacillus subtilis)菌株，其微生物保藏号是：NRRL NO.B-50347，该菌株具有可抵抗环境压力的耐受性。

2.如权利要求1所述的枯草杆菌菌株，其中所述的枯草杆菌菌株的实施型态为菌液。

3.如权利要求1所述的枯草杆菌菌株，其中所述的枯草杆菌菌株的实施型态为菌粉。

4.如权利要求1所述的枯草杆菌菌株，其中所述的枯草杆菌菌株具有的耐受性为胆盐耐受性。

5.如权利要求1所述的枯草杆菌菌株，其中所述的枯草杆菌菌株具有的耐受性为温度耐受性。

6.如权利要求1所述的枯草杆菌菌株，其中所述的枯草杆菌菌株具有的耐受性为酸耐受性。

7.一种食品产品，包含可食性材料和如权利要求1所述的枯草杆菌菌株。

8.如权利要求7所述的食品产品，其中所述的食品产品是人类食品、动物食品、食品添加物中的一种或多种。

9.如权利要求8所述的食品产品，其中所述的人类食品是发酵乳、乳酸菌饮料、牛乳、豆奶、酸奶、酸乳、果汁、豆浆、茶包、茶叶、咖啡粉、可可粉、奶粉、豆粉、麦粉、矿泉水、瓶装水、鸡精中的一种或多种。

10.如权利要求8所述的食品产品，其中所述的人类食品是豆花、奶酪、干酪、冷冻优格、布丁、茶冻、仙草冰品、糖果、口含锭、西点、坚果、汤包、面条、面线、冬粉、饼干、冰淇淋、口香糖、谷类食品、烘焙原料中的一种或多种。

11.如权利要求8所述的食品产品，其中所述的动物食品是禽畜饲料、鱼饲料、宠物饲料添加剂、宠物用品中的一种或多种。

12.如权利要求8所述的食品产品，其中所述的食品添加物是中药包、调味包、调味品、食品配料、辛香油、麻油、橄榄油、食品添加剂、天然原料、健康原料中的一种或多种。

13.一种日常用品，包含如权利要求1所述的枯草杆菌菌株。

14.如权利要求13所述的日常用品，其中所述的日常用品是保健用品、清洁用品、美容用品、生活用品、农业用品中的一种或多种。

15.如权利要求14所述的日常用品，其中所述的保健用品是健康食品、保健食品、肠胃保护剂、生发液、护发剂中的一种或多种。

16.如权利要求14所述的日常用品，其中所述是清洁用品是洗发精、洗面奶、润发乳、沐浴乳、肥皂、香皂、洗衣粉、漱口水、牙膏、牙粉、阴部阴道冲洗液、尿布、卫生棉、棉垫、泡澡粉、泡澡包、泡脚粉、泡脚包、除屑剂中的一种或多种。

17.如权利要求14所述的日常用品，其中所述的美容用品是面霜、护手霜、润肤霜、香水、面膜、精油、化妆品原料添加剂中的一种或多种。

18.如权利要求14所述的日常用品，其中所述的生活用品是鞋垫、芳香剂、软膏、喷剂、喷雾剂、痱子粉、环境用喷剂、马桶除臭剂或水塔、饮水机内部添加剂中的一种或多种。

19.如权利要求14所述的日常用品，其中所述的农业用品是农业用微生物制剂、土壤活化剂、微生物肥料添加剂、微生物肥料发酵剂中的一种或多种。

说明书

益生菌菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明是关于一种新颖的益生菌(BS139)，特别是关于一种具有可抵抗环境压力的耐受性的枯草杆菌菌株。

背景技术

[0002] 在人体肠道内，具有种类约400种以上、总数约100兆的细菌(肠内菌)，其中80-85％是正常菌群，15-20％是有害菌。因此，维持菌群生态平衡非常重要，其作用包括能帮助食物残渣分解消化，还能制造维生素B群和K，益生菌产生乳酸和醋酸，能保持肠道微酸性，使有害菌无法生存。而现代人因物质丰富，饮食方面越来越精致、讲究，加上年纪增长，使肠内细菌产生极大变化，有益菌逐渐减少，有害菌大量增加，进而造成疲倦、焦虑、皮肤粗糙等现象，更甚者会影响养分正常吸收而产生疾病。

[0003] 所谓的益生菌(Probiotics)，有人译为原生物素、生菌素、生菌剂或原生保健性菌种。根据联合国世界卫生组织(WHO)对“益生菌”的定义，可定义为“适量的给予宿主，使其能产生健康效应的活菌”。亦可广义地解释为：应用至人类或其它动物，借由改善肠内微生物相平衡、有益于宿主的活菌。其作用包括可改善宿主肠内微生物的平衡，调整肠道菌落的组成，进而能帮助人类抵抗各种感染病原及抑制有害菌，并可改善泌尿生殖道菌群，预防 感染。

[0004] 益生菌种类繁多，包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、嗜乳 酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、双岐双叉杆菌(Bifidobacterium sp.)、龙根菌(Bifidobacterium Longum)、嗜热性链球菌(Streptococcusthermophilus)等，市面上常见的益生菌包括有酵母菌及乳酸菌等，而利用乳酸菌制造出的产品众多，其中以发酵乳、乳酸菌饮料、酸奶、优格、起司、胃肠药、泡菜、糖果、饼干等相关产品居多，整体而言，市售的产品多集中于发酵乳制品与锭剂胶囊型式的保健产品，是因其特性符合乳酸菌的生存环境，使乳酸菌可在乳制品存活一段期间，而一般乳酸菌在非乳制品如糖果、果冻内中则不易存活。

[0005] 此外，乳酸菌一般均强力代谢糖类，而且会产生乳酸，使产品具有酸味，产品口味因此被局限，因此目前市售产品通常添加许多食品添加物，如蔗糖、果糖等物质，有违养生健康的原则，为了使口感不被局限，市面上亦有药剂型的产品，但此类的产品，却难为儿童所接受。

[0006] 无论产品形式为何，乳酸菌要发挥功效必须为活菌，而人体的胃酸值介于pH值2～3之间，许多乳酸菌菌种无法在此酸性环境下生存，因此能真正在人体中产生作用的乳酸菌菌种十分稀少；同时，肠内的胆盐对乳酸菌也会产生破坏，可通过消化道抵达结肠的乳酸菌十分有限。

[0007] 再者，乳酸菌培养的条件须严格控管，须在特定温度之下乳酸菌才能生长良好，且乳酸菌不耐高温，成品无法利用高温杀菌， 使产品无法久放，易滋生杂菌。

[0008] 菌在不同环境压力下会以内孢子型态存在，以增加对环境的耐受性。内孢子，又称芽孢(endospore)、内生孢子，是某些特殊种群的细菌，主要是芽孢杆菌属Bacillus与梭菌属Clostridium中细菌产生的特殊休眠体，有极强的抗逆性，对热、碱、酸、高渗、有机溶剂(例如酒精)、家用清洁剂、以及辐射均有强耐受性。国际期刊JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Apr.2006，p.2692-2700证实Bacillus subtilis可于肠道中萌发，并且可由萌发态再次形成孢子。

[0009] 本案发明人针对已知技术中的不足，经过悉心试验与研究，并本着锲而不舍的精神，终构思出本案“新颖的益生菌菌株及其应用”，能够克服先前技术的不足，提供一种具有可抵抗环境压力的耐受性的枯草杆菌(Bacillus subtilis)菌株BS 139，包括耐酸、耐胆盐以及耐高温等特性，其保存于美国农业研究菌种保藏中心(Agriculture Agricultural Research Service，NRRL)，保藏编号为NRRL NO.B-50347。并可进一步应用于食品产品及医药组成物的制备方面。以下为本案的简要说明。

发明内容

[0010] 近来民众对于饮食健康非常看重，且生物技术逐渐提升，因此开始研究将益生菌与食品结合在一起，因为益生菌在人体内有助于抑制病源菌的孳生和吸收特殊的营养，因此在人体增加益生菌的菌数，有助于人体的健康。但是在经由饮食进入人体的菌，不管是益生菌还是病源菌，都必须通过胃酸和胆盐的考验，才能顺 利到达肠道，益生菌在食品加工的过程中，高温也是一个考验，因此如何使益生菌既可耐酸、耐胆盐、耐高温，又可长期存活于非乳制品中且不产酸，符合产品的制程、降低制作成本，将是一个非常重要的目标。 [0011] 本发明的菌株是由一豆腐乳制品中所分离取得的，豆腐乳为一种二次加工的豆制品，先将黄豆研磨成豆浆添加石膏，经过搅拌、固、压制成硬豆腐，表面干燥后，二次加工后才形成豆腐乳；二次加工的方法有两种：

[0012] (一)使用黄豆曲或黄豆米曲：黄豆、米等蒸煮于却后制曲；豆腐盐渍后混合黄豆曲熟成。

[0013] (二)接种毛霉菌：将表面干燥的豆腐接种毛霉菌培养成霉豆腐，再浸盐水、加调味料熟成。

[0014] 由于制作豆腐乳所使用的霉菌，必需选用驯化的人工培养菌种，本菌株是一天然菌株且微量存在于豆腐乳制品中，透过采样、分离并分析其生物特性后，经实验室鉴定为一新颖的枯草杆菌(Bacillussubtilis)分离株，且为一新颖的益生菌种，故给予该新颖之益生菌编号BS-139。

[0015] 因此，为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种具有可抵抗环境压力的耐受性的枯草杆菌(Bacillus subtilis)菌株，其微生物保藏号是：NRRL NO.B-50347；分类命名是：Bacillus subtilis；保藏时间：2010年2月1日；保藏地址：华盛顿特区西南独立大道1400号杰米湖惠滕大厦，20250(Jamie L.Whitten Building 1400Independence Ave.，S.W.Washington DC，20250)；保藏单位：美国 农业研究菌种保藏中心(Agriculture Agricultural Research Service，NRRL)。

[0016] 本发明枯草杆菌菌株的形态学特征：将菌体以划线分离方式，接种于Luria-Bertin琼脂平板培养基，经隔夜37℃有氧生长培养。革兰氏染色为阳性菌G(+)，为好氧性菌，可产生内孢子，在生长对数期时之菌体呈4μmx1μm杆状，具有周鞭毛，高游动性。于营养丰富的Luria-Bertini(LB)琼脂平板培养基生长时，菌落形状为圆形，浅乳白色，表面稍微突起，菌落周围平滑

[0017] 本发明的另一目的是提供一种食品产品，包含所述枯草杆菌即益生菌BS139。 [0018] 本发明之又一目的即是提供一种医药组成物，包含所述枯草杆菌即益生菌BS139。 [0019] 本发明的目的是为解决现有技术中存在的问题提供一种枯草杆菌(Bacillus subtilis)菌株即益生菌BS139，其保存于美国Agricultural Research Service(NRRL)，保藏编号为NRRL NO.B-50347，本发明枯草杆菌菌株(即益生菌BS139)具有可抵抗环境压力的耐受性，其实施型态包括菌液或菌粉型态。本发明益生菌BS 139的耐受性包括耐胆盐、温度以及酸性环境等类似于人体胃肠道的条件。

[0020] 本发明培养具有孢子的益生菌BS139，并利用溶氧因子控制、培养基浓度控制技术来提升其产孢率，并强化孢子对高温85℃～90℃的抗性，使益生菌BS139可耐酸、耐胆盐，且可耐高温，符合产品的制程，降低制作成本，培养出不产酸的益生菌BS139，亦 可长期存活于非乳制品中。

[0021] 同时，也可将本发明益生菌BS139应用于制备食品产品，食品产品包括饮品、食品、动物食品、食品添加物中的一种或多种。

[0022] 饮品例如：发酵乳、乳酸菌饮料、牛乳、乳饮料、豆奶、酸奶、酸乳、饮料、果汁、豆浆、茶包、茶叶、咖啡粉、可可粉、奶粉、豆粉、麦粉、矿泉水、瓶装水及鸡精。

[0023] 食品例如：豆花、奶酪、干酪、冷冻优格、布丁、茶冻、仙草冰品、糖果、口含锭、西点、蛋糕、面包、饼干、坚果、汤包、方便面、面条、面线、冬粉、饼干、冰淇淋、软糖、口香糖、谷类食品及烘焙原料。

[0024] 动物食品例如：禽畜饲料、鱼饲料、饲料、宠物饲料添加及宠物用品。 [0025] 食品添加物例如：中药包、调味包、调味品、辛香料、食品配料、辛香油、麻油、橄榄油、辣椒酱、酸辣酱、糖、盐、酱油、食品添加剂、饮用水添加剂、冰品添加、食品配料、天然原料及健康原料。

[0026] 同时，本发明益生菌BS139也可应用于制备医药组成物，以益生菌BS139与氧化镁MgO的共同作用为例：氧化镁MgO在医疗方面可用于治疗胃灼热、胃酸和酸性消化不良，也可用作短效轻泻剂(软便剂)。本发明益生菌BS139孢子的抗逆性使其可轻易进入肠道，萌发后在肠道中改善肠道菌群，使排泄状况恢复。其中所述的医药组成物可制成溶液、乳剂、粉末、锭剂或胶囊等剂型。

[0027] 另外，本发明益生菌BS139也可应用于制备日常用品，日常用品包括：保健用品、清洁用品、美容用品、生活用品、农业用品。

[0028] 所述的保健用品为健康食品、保健食品、肠胃保护剂、生发液及护发剂。 [0029] 本发明益生菌BS139加入清洁用品可增强清洁用品的抗菌能力，其中所述的清洁用品为洗发精、洗面奶、润发乳、沐浴乳、肥皂、香皂、洗衣粉、漱口水、牙膏、牙粉、阴部阴道冲洗液、尿布、卫生棉、棉垫、泡澡粉、泡澡包、泡脚粉、泡脚包及除屑剂。

[0030] 本发明益生菌BS139加入美容用品可形成保护膜，具有加强皮肤保湿、抗菌、代谢老化角质之功能，其中所述的美容用品为面霜、护手霜、润肤霜、香水、面膜、精油及化妆品原料添加剂。

[0031] 所述的生活用品为鞋垫、芳香剂、软膏、喷剂、喷雾剂痱子粉、环境用喷剂、马桶除臭剂或水塔或饮水机内部添加。

[0032] 所述的农业用品为农业用微生物制剂、土壤活化剂、微生物肥料添加剂或微生物肥料发酵剂。

[0033] 本发明的枯草杆菌菌株具有如下优点：

[0034] 经由本发明所采用的技术手段，可将本发明的益生菌BS139应用至食品产品的制作、加工或医药制备方面。利用本发明益生菌分离株具有对胆盐、温度及酸性环境耐受性的特性，可在食品加工的过程中可能遭遇的高温下，仍然保持其活性。亦可在人体肠胃道中酸性、胆盐等条件下，顺利存活到达肠道。以改善宿主 肠内微生物的平衡，调整肠道菌群的组成，进而能帮助人类抵抗各种感染病原及抑制有害菌等作用。

附图说明

[0035] 图1A：本发明益生菌BS139对数期生长时的光学显微照相；

[0036] 图1B：本发明益生菌BS139的菌落形态；

[0037] 图2：本发明益生菌BS139的生长曲线；

[0038] 图3A～3B：本发明益生菌BS139的类源关系树；

[0039] 图4：本发明益生菌BS139对酸的耐受性测试结果；

[0040] 图5：本发明益生菌BS139对温度的耐受性测试结果；

[0041] 图6：本发明益生菌BS139菌粉对胆盐的耐受性测试；

[0042] 图7：本发明益生菌BS139菌粉对温度的耐受性测试；

[0043] 图8：本发明益生菌BS139菌粉对酸的耐受性测试；

[0044] 图9A：在果冻食品中本发明益生菌BS139对温度的耐受性测试；

[0045] 图9B：本发明益生菌BS139在果冻食品中的生长情况。

具体实施方式

[0046] 下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。

[0047] 形态学特征

[0048] 参阅图1A，显示本发明益生菌BS139对数期生长时的光学显 微照片。将菌体悬浮于甘油中，悬滴于玻片上封片后，以倒立光学显微镜Leica DMI 3000，物镜为100×/NA1.25 oilimmersion，配合Photometrics CoolSNAP EZ CCD数字撷取菌体影像。

[0049] 图1B显示本发明益生菌BS139的菌落形态。将菌体以划线分离方式，接种于Luria-Bertin琼脂平板培养基，经隔夜37℃有氧生长培养。其形态学特征包括：革兰氏染色为阳性菌G(+)，为好氧性菌，可产生内孢子，在生长对数期时，菌体呈4μmx1μm杆状(参见图1A)，具有周鞭毛，高游动性。于营养丰富的Luria-Bertini(LB)琼脂平板培养基生长时，菌落形状为圆形，浅乳白色，表面稍微突起，菌落周围平滑(参阅图1B)。

[0050] 培养性状特征

[0051] 图2显示本发明益生菌BS139的生长曲线。将本发明菌体接种于Luria-Bertin液态培养基，经37℃有氧生长培养，记录其菌液混浊度(Optical density at 600nm)。 [0052] 生理特性

[0053] 另外，本发明益生菌BS139具有下列酵素活性：触酶(catalase)、氧化酶(oxidase)、淀粉分解酶(α-amylase)、蛋白质分解酶(protease)、纤维酶分解酶(cellulase)、纳豆激酶(nattokinase)。

[0054] 碱基序列分析

[0055] 利用本发明益生菌BS139抽取的染色体针对16S rDNA以及gyrase B基因(gyrB)片段进行PCR定序，Bacillus subtilis BS139菌株的16SrDNA的核苷酸序列、gyrase B基因的核苷酸序列见序 列表。结果显示本发明枯草杆菌菌株属于Bacillus subtilis一族，与实验室标准菌株B.subtilis strain 168(ATCC：23857)相近但不同。利用序列比对工具(BLAST)针对美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库进行分析比对，并绘制16S rDNA以及gyraseB基因的类源关系树(参阅图3A～3B)，结果显示可将本菌株归类为一新颖的Bacillus subtilis菌株，并命名为益生菌BS139。

[0056] 实施例1：益生菌BS139的发酵培养

[0057] 在发酵培养的之过程中，其重点步骤包括：(一)益生菌筛选：发酵时以碳源：葡萄糖(Glucose)、氮源：大豆蛋白与NaCl等生化试剂做菌种发酵，并于离心管与摇瓶处理；(二)好氧产孢子益生菌培养：置入5L槽培养，后再置入100L槽培养，之后培养液静置不供氧维持2日，增加微生物产孢率；(三)优势生长筛选技术：培养益生菌BS 139时，每小时取一次菌液，纪录其生长效率，计算其生长效率最高的时间点，约于6小时可达对数生长中期(mid-log phase)。

[0058] 实施例2：益生菌BS139孢子耐温、产率提升技术

[0059] 在提升孢子耐温及产率方面，利用溶氧因子控制：以大量曝气来提高溶氧，以供应培养液内细菌的需氧量，若降低培养液的溶氧，环境变化将使得微生物产孢，可提高产孢率，并利用培养基浓度控制：利用无菌水以体积比稀释培养液浓度，利用浓度控制得到最高产孢速率的最适培养基浓度(以稀释培养液为原浓度的50％与30％)，不同浓度下量测孢子产率。藉由不同测试发现以上技术可提升益生菌的产孢率、孢子耐温及产率，强化孢子对高温 85℃～90℃的抗性及提高其产孢率。

[0060] 实施例3：益生菌BS139对酸的耐受性测试

[0061] 样本的前制备

[0062] 首先将少许菌粉泡在培养液中，活化四小时后涂在培养基上放在37℃培养器(incubator)中进行隔夜培养(overnight)，并且用肠出血性大肠杆菌(EHEC)做同样方式制备。

[0063] 完成样本制备后，依照下列步骤进行：

[0064] 1.用牙签挑取平盘上的菌落少许加入离心管装的6ml培养液中，放在37℃培养器中(incubator)旋转培养16小时。

[0065] 2.将培养的菌液分装到无菌圆底培养管，分别是1-0、1-1、1-2、1-3以及1-1s、1-2s、1-3s共7管，每管0.8ml。

[0066] 3.将上述7管以7000rpm、2min离心，倒掉上清液，再迅速以7000rpm、10sec离心，再倒掉上清液只留下沉淀(pellets)。

[0067] 4.将1-1s、1-2s、1-3s分别加入0.8ml的PBS(pH 2.0)，其余4管加入0.8ml的PBS(pH 7.3)，震动(vortex)打散pellets。

[0068] 5.将1-0取出20μl做序列稀释(利用PBS pH7.3稀释)，取106、107稀释菌液0.1ml利用培养基进行涂盘隔夜计数，其余6管都放入37℃培养器中培养(150rpm)，每一小时取配对的2管序列稀释，取0.1ml的适当稀释倍数以培养基进行涂盘隔夜计数，即第1小时取1-1及1-1S稀释涂盘，以此类推接下来两小时进行的实验。

[0069] 6.以上述方式进行三重复实验，并纪录计数所得的数据。

[0070] 7.取肠道出血性大肠杆菌(EHEC)菌液采用同上述方式进行测试，所测得的数据当作实验的对照组。

[0071] 8.此实验需进行pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH7.3共4种酸性耐受性测试，因此须以pH3.0、pH4.0的PBS分别重复上述的实验。

[0072] 结果请参阅图4，显示BS139对酸之耐受性测试结果。根据实验的观察结果发现，BS139在pH 4.0环境下最多可存活2小时。

[0073] 实施例4：益生菌BS139对温度的耐受性测试

[0074] 本实施例中，首先进行如实施例3的样本前制备及以下步骤：

[0075] 1.用牙签挑取平盘上的菌落少许加入离心管装的6ml培养液中，放在37℃培养器中(incubator)旋转培养16小时。

[0076] 2.将培养之菌液分装到无菌圆底培养管，分别标记1-0、1-1、1-2共3管，每管0.8ml。

[0077] 3.将上述3管以7000rpm、2min离心，倒掉上清液迅速离心7000rpm、10sec再倒掉上清液只留下沉淀(pellets)。

[0078] 4.将上述3管加入0.8ml的PBS(pH 7.3)，震动打散pellets。

[0079] 5.将1-0管中取出20μl做序列稀释(利用PBS pH7.3稀释)，取0.1ml的106、7
10 稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数。

[0080] 6.将配对的2管(1-1、1-2)放入100℃干浴器中培养，每隔15分钟取1管菌液进行序列稀释，并取0.1ml适当稀释倍数的菌液进行培养基涂盘隔夜计书，亦即第15分钟取1-1，第30分钟取1-2稀释涂盘。

[0081] 7.以上述方式做三重复实验，并纪录计数所得的数据。

[0082] 8.取EHEC菌液采用同上述方式进行测试，所测得之数据当作实验的对照组。 [0083] 9.此实验需进行的温度测试有50℃、75℃、80℃、100℃，并且测试抗温时间有10分钟、15分钟、30分钟、1小时。因此比照上述方式，依测定目标调整干浴器的温度及放置时间，然后进行测试并纪录数据。

[0084] 结果参阅图5，显示BS139对温度的耐受性测试结果。根据实验的观察结果发现，BS139培养液于50℃作用30分钟时则约还有20％存活率。

[0085] 实施例5：益生菌BS139菌粉对胆盐的耐受性测试

[0086] 样本的前制备

[0087] 将要测试的菌粉用离心管(eppendorf tubes)先分装20管菌粉，以作为实验用的样本，每管菌粉重约0.1g，置于-20℃冰箱中。1.从-20℃冰箱中取1管0.1g菌粉，将此菌粉加入10ml的培养液(含3％胆盐，bile salt)中充分震动混匀。

[0088] 2.分装入4管无菌圆底培养管，每管1ml分别标示为1-0、1-1、1-2、1-3。 [0089] 3.将1-0培养管取出20μl进行序列稀释(利用PBS pH7.3稀释)，取0.1ml的5 6
10、10 稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数，其余3管(1-1、1-2、1-3)放入37℃培养器中旋转培养(150rpm)，每隔1小时取1管进行序列稀释，取0.1ml的适当稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数，亦即第1小时取1-1稀释涂盘，以此类推接下来两小时进行的实验。 [0090] 4.以上述方式进行三重复实验，并纪录计数所得的数据。

[0091] 5.完成3％胆盐抗性测试之后，改换成含有0.3％胆盐的培养液按上述方式进行抗性测试，并且纪录所得数据以做比较。

[0092] 结果参阅图6，显示BS139菌粉对胆盐的耐受性测试。实验结果显示BS 139在含有3％和0.3％之胆盐的环境下作用3小时，还有将近20％的存活率。

[0093] 实施例6：益生菌BS139菌粉对温度的耐受性测试

[0094] 本实施例中，首先进行如实施例5的样本前制备及以下步骤：1.从-20℃冰箱中取1管0.1g菌粉，将此菌粉加入10ml的培养液中充分震动混匀。

[0095] 2.分装入3管无菌圆底培养管，每管1ml分别标示为1-0、1-1、1-2。

[0096] 3.将1-0试管取出20μl进行序列稀释(利用PBS pH7.3稀释)，取0.1ml的105、6
10 稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数，其余2管(1-1、1-2)放100℃干浴器中培养，分别在第10分钟及第30分钟分别取1-1及1-2试管进行序列稀释，取0.1ml的适当稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数。

[0097] 4.以上述方式进行3重复实验，并纪录计数所得的数据。

[0098] 5.此实验测试的温度有50℃、75℃、80℃、100℃共4种，因此还必须更改干浴槽的温度重复上述实验，以测得各温度的存活数据。

[0099] 结果参阅图7，显示BS139菌粉对温度的耐受性测试。实验结果显示BS 139菌粉在100℃的温度下几乎没菌存活，在75℃、 80℃的温度作用30分钟内有80％以上存活率。 [0100] 实施例7：益生菌BS139菌粉对酸的耐受性测试

[0101] 本实施例中，首先进行如实施例5的样本前制备及下列步骤：1.从-20℃冰箱中取1管0.1g菌粉，将此菌粉加入10ml的PBS(pH4.0)中充分震动混匀。

[0102] 2.分装入4管无菌圆底培养管，每管1ml分别标示为1-0、1-1、1-2、1-3。 [0103] 3.将1-0培养管取出20μl进行序列稀释(利用PBS pH7.3稀释)，取0.1ml的5 6
10、10 稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数，其余3管(1-1、1-2、1-3)放入37℃培养器中旋转培养(150rpm)，每隔1小时取1管进行序列稀释，取0.1ml的适当稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数。

[0104] 4.以上述方式进行3重复实验，并纪录计数所得的数据。

[0105] 5.此实验要测试的pH有2.0、3.0、4.0、7.3共4种，因此还必须更改PBS的pH值重复上述实验方式，以测得数据。

[0106] 结果参阅图8，显示BS139菌粉对酸的耐受性测试。根据实验结果发现菌粉的BS139对于酸的耐受性明显的比营养态菌液较好，直到pH3.0培养3小时的后存活率才逐渐减少。

[0107] 根据以上实验结果，BS139菌粉在酸、胆盐或温度的耐受性明显优于BS139培养菌液，其原因在于BS139菌粉中的内孢子相当多，远高于BS139培养菌液中孢子的含量，而内孢子是BS139在恶劣环境下存活的方式，它可以提升BS139对外面压力的耐受性。 [0108] 实施例8：益生菌BS139在果冻食品中对温度的耐受性测试

[0109] 样本的前制备

[0110] 将盒装的含有益生菌BS139的果冻先分装到2支离心管(50ml)中，关紧后用parafilm封住开口，存放在4℃冰箱中。1.从4℃冰箱中取一管果冻出来，用灭菌过的汤匙取约2ml的果冻各装入15ml的离心管中，分别加入1ml的PBS(pH 7.3)，再加入玻璃珠震荡打碎果冻。

[0111] 2.用移液器(pipet)从中取2管各2ml置入离心管中，分别标示1-0、1-1。 [0112] 3.以PBS(pH 7.3)对1-0试管进行序列稀释，取0.1ml的103、104稀释菌液进行培养基涂盘隔夜计数，所得数值即表示存活数。

[0113] 4.将1-1试管90℃加热10分钟之后同样稀释涂盘隔夜计数，所得数值即表示存活孢子数。

[0114] 5.按上述方法进行三重复实验，并纪录计数所得数据。

[0115] 6.果冻储存于4℃冰箱不同时间后，以上述相同实验方式计数存活菌数以及孢子数。

[0116] 结果参阅图9A，显示在果冻中BS139对温度的耐受性测试。根据实验的结果显示，果冻中的BS139在置于90℃中10分钟后还有近70％以上的存活率。

[0117] 接着参阅图9B，其显示BS139在果冻中的生长情况。此实验数据是取上述实验中1-0三重复实验计数所得的菌落平均数，并将其换算成1ml中所含的菌落数。根据结果可以发现果冻中的BS139的菌数随着时间增加而逐渐减少。

[0118] 通过本实施例，可以了解益生菌BS139可通过各种加工的过 程，制造形成不同的食品或是附加食品，另外，本发明益生菌BS 139亦可应用于制备日常用品，例如：健康食品、保健食品、肠胃保护剂、保健用品、生发液及护发剂。

[0119] 实施例9：食品加工益生菌BS139掺菌制备技术

[0120] 基于BS139的特性，非常适于制作益菌果冻，其步骤包括(一)高温渗菌制作：于热融的果冻胶体混合物，于80℃高温中加入孢子菌粉搅拌，而后再降温至75℃中进行巴斯德灭菌，其后注入容器后再降温至10℃中冷凝成型；(二)成型低温处理技术：将降温后的成品置于10℃处理30分钟，此时可促使产品中活化的营养态细菌继续形成耐温耐酸孢子。8
并于储存时间内保持活性稳定，可达到一周内活菌数大于5x10cfu/100ml；低温4℃储存三
8
周后，活菌数大于3x10cfu/100ml。本实施例所制成的益菌果冻，其可食用测试系由阳明大学创新育成中心进驻厂商的台美检验科技公司进行食品微生物测试以及一般食品的安定性试验。

[0121] 由以上之实施例可知，本发明所提供的益生菌BS139具产业上的利用价值，故本发明符合专利的要件。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。