一株具有抗菌作用的细黄链霉菌株及其应用转让专利
申请号 : CN201110094517.8
文献号 : CN102191204B
文献日 : 2013-01-02
发明人 : 孙晗笑 , 王磊 , 莫雪梅 , 李秀英 , 张光
申请人 : 暨南大学
摘要 :
本发明涉及一株新筛选的具有抗菌作用的细黄链霉菌及其应用。该菌株为细黄链霉菌GNF1（StreptomycesmicroflavusGNF1），2011年3月13日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO：M2011061。该菌株以市售的复合微生物有机肥作为菌源，经筛选分离得到。其代谢产物含有较强的抑菌活性物质，不仅可以抑制土壤固有细菌，还能抑制人体的一些原核病原微生物。
权利要求 :
1.一株具有抗菌作用的细黄链霉菌（Streptomyces microflavus ）GNF1，2011年3月
13日保藏于“ 中国典型培养物保藏中心”，保藏号为 CCTCC NO:M2011061。
2.如权利要求1所述的GNF1菌株或其发酵液在制备抗菌微生态制剂中的应用。
3.如权利要求1所述的GNF1菌株或其发酵液在制备抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌或植物根际促生菌制剂中的应用。
说明书 :
一株具有抗菌作用的细黄链霉菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株新筛选的具有抗菌作用的细黄链霉菌株及其应用。
背景技术
[0002] 植物根际土壤中含有大量的具有固氮、解磷、解钾及分泌植物激素等功能的微生物，通过不同的方式达到促进植物生长的作用，植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)就是其中一类能定殖于根系并促进植物生长的细菌，可被用来作为生物有机肥料的良好菌株。已有研究表明，多种菌株混合培养时个菌株之间存在着复杂的相互作用。一类微生物可以为另一类的生长提供重要的物质，或为其创造更有利的条件，有的甚至依赖其他微生物而存活。各菌株之间可能进行直接或间接的相互作用，互相提供所需的营养，转移或消除抑制物质，或通过一些物理或生化机制刺激彼此之间的生理活动。谢应先报道的土壤习居菌—固氮菌和解磷解钾菌相互之间没有抑制作用或者只有微弱的抑制作用。饶正华和常慧萍等也都研究过固氮菌、解磷菌和解钾菌之间的相互作用，显示这几种根际促生菌确实能共同发挥作用促进植物生长。夏觅真在其研究中发现有的解磷菌可能会抑制解钾菌的生长，但当固氮菌、解磷菌解钾菌共同培养时有助于磷钾的释放。当前的生物有机肥中所含的菌种数量众多，大都包含有酵母菌、固氮菌、解磷解钾菌、放线菌和霉菌等，这些不同菌种、不同菌株之间的互相作用更为复杂多变，单纯的研究固氮菌和解磷解钾菌之间的相互作用显得较为薄弱，更为重要的是前人的研究很少去关注肥料中的菌种和土壤固有的菌株之间的相互作用。因此，了解这些不同类微生物之间的作用，对合理选择菌剂的最优组合，对于开发相关的微生物有机肥和微生态制剂具有重大的研究价值。 发明内容
[0003] 发明人在对复合微生物有机肥中的菌种与土壤固有微生物之间的相互作用的研究中筛选了一株具有较强抑菌作用的细黄链霉菌株，初步鉴定其为链霉菌属。其代谢产物中存在抑菌活性物质，不仅可以抑制土壤固有细菌，还能抑制人体的一些原核病原微生物。
[0004] 由此，本发明提供了一株具有抗菌作用的细黄链霉菌GNF1（Streptomyces microflavus GNF1），2011年3月13日保藏于“ 中国典型培养物保藏中心”，保藏号为 CCTCCNO:M2011061。此菌株以下简称为“GNF1”。
[0005] 本发明涉及的菌株基内菌丝多分枝，不断裂，气生菌丝丰富，孢子链直且长，偶有波曲，孢子呈柱状；菌株在多数培养基上生长良好，气高氏淀粉琼脂上气生菌丝体白至杏仁黄色，成熟时粉红发紫；基内菌丝体玳瑁黄风帆黄色，可溶性色素微染；克氏合成1号琼脂、察氏琼脂、淀粉铵盐琼脂：气丝粉红色或粉红秸草色，毛状和粉状；基丝好，无色或略微黄色、秸草色、浅棕色或微黄褐色，无可溶色素。
[0006] 所述细黄链霉菌GNF1的生长温度范围为10～40℃；生长pH 范围为6.0～8.5； 能在含0～1.5 mol／L NaCl的ISP2和MBA琼脂上生长；明胶液化、淀粉水解、硫化氢产生阴性；不能水解Tween20和酪素；黑色素产生、牛奶胨化、纤维素水解和硝酸盐还原阴性；菌株全细胞水解产物中含氨基酸和糖类。
[0007] 所述细黄链霉菌GNF1,G+C含量为71.2％，16SrRNA扩增序列长度为1458 bp；与细黄链霉菌（Streptomyces microflavus Krainsky）的16S rRNA序列仅相差6个碱基，同源性达99.6％。
[0008] 所述细黄链霉菌GNF1及其发酵液具有较强的抗菌作用，包括与连霉素做对照，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌或植物根际促生菌都表现了良好的抑制作用。所述菌株GNF1的抑菌物质具有较强的脂溶性，及良好的光稳定性和热稳定性。发酵液在紫外灯下照射30 min后，抑菌活性基本没变；在30℃～45℃之间抑菌活性稳定。
[0009] 根据对其形态培养特征、生理生化特性和系统发育分析的研究结果，细黄链霉菌菌株GNF1具有链霉菌(Streptomyces)菌株典型的特征，应归属于此属。GNF1菌株虽然同细黄链霉菌的16S rRNA扩增序列同源性达99.6％ ，但仅依据16SrRNA确定其种的分类地位存在一定的局限性。其最终的分类地位仍需与模式种 Streptomyces microflavus 进行DNA分子杂交，并结合两菌株的生理生化特性才能确定。因此，本发明涉及的菌株为新菌株。
附图说明
[0010] 图1是细黄链霉菌GNF1发酵上清液对GNW、HP2和 E.coli生长的抑制作用的曲线图。
[0011] 图2是细黄链霉菌GNF1的16S rDNA电泳图。
[0012] 图3是细黄链霉菌GNF1的系统发育树图。
具体实施方式
[0013] 本发明以市售的复合微生物有机肥作为菌源，分离出一系列不同的菌株，与实验室保存的菌株GNW为自生固氮菌（以下简称“GNW”）和HP2为解磷菌（以下简称“HP2”）混合接种培养，检测具有抑菌作用的目的菌株细黄链霉菌GNF1。根据其形态学特征、生理生化特征和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果，对目的菌株进行鉴定。具体如下：
[0014] 一、实验材料与方法。
[0015] （一）实验材料 。
[0016] 细黄链霉菌GNF1菌株（以下简称“GNF1”）、GNW和HP2由本实验室前期用选择性培养基分离、编号并保存。
[0017] （二）实验方法。
[0018] 1.抑菌作用菌株的初步筛选，将GNW、HP2和GNF1三者混合培养，检测相关指标，初步找到具有抑菌作用的菌株。培养基：葡萄糖10 g，NaH2 PO4 ·2H2O 2.0 g，MgSO4·7H2O0.5 g，FeCl3 0.005 g，(NH4 ) 2SO4 0.2 g，CaCO3 0.1 g，磷矿粉5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH
7. 0～7. 5。于200 mL三角瓶中加入上述培养基50 ml，高压灭菌备用。实验共设5个处理：（1）对照（无菌水3 mL）；（2）接种1 mL HP2菌液+无菌水2 mL；(3)接种1 mLGNW菌液+无菌水2 mL；(4) 1 mL GNF1菌液+HP2菌液+无菌水1mL；（5）1 mL GNF1菌液+GNW菌液+无菌水1 mL（6）三株菌混合培养，同时接种3种菌液各1 mL，每组重复3次。各处理以相同的细胞数接种，30 ℃、120 r/min，培养72 h后，培养液进行消煮测全N含量。同时用稀释平板法在无氮培养基和无机磷培养基上测定三种菌的数量。其中N含量采用凯氏定氮仪测定，P含量的测定采用钼锑抗比色法，K含量的测定用离子火焰分光光度计法。上述的测定方法可以参考夏觅真等的发表的论文，（论文见夏觅真等、棉花根际固氮菌、解磷菌及解钾菌的相互作用[J].Chinese Journal of Microecology ,Feb.2010,22(2):102-105.）。
7. 0～7. 5。于200 mL三角瓶中加入上述培养基50 ml，高压灭菌备用。实验共设5个处理：（1）对照（无菌水3 mL）；（2）接种1 mL HP2菌液+无菌水2 mL；(3)接种1 mLGNW菌液+无菌水2 mL；(4) 1 mL GNF1菌液+HP2菌液+无菌水1mL；（5）1 mL GNF1菌液+GNW菌液+无菌水1 mL（6）三株菌混合培养，同时接种3种菌液各1 mL，每组重复3次。各处理以相同的细胞数接种，30 ℃、120 r/min，培养72 h后，培养液进行消煮测全N含量。同时用稀释平板法在无氮培养基和无机磷培养基上测定三种菌的数量。其中N含量采用凯氏定氮仪测定，P含量的测定采用钼锑抗比色法，K含量的测定用离子火焰分光光度计法。上述的测定方法可以参考夏觅真等的发表的论文，（论文见夏觅真等、棉花根际固氮菌、解磷菌及解钾菌的相互作用[J].Chinese Journal of Microecology ,Feb.2010,22(2):102-105.）。
[0019] 结果见表1，显示GNF1与GNW混合培养时，GNW的数量较单独培养时下降了26.2 %，培养液中的氮含量也明显减低；同样，HP2细胞数量混合培养比单独培养的低38.3 %。三株菌混合培养时，抑菌效果相仿。在氮磷含量方面，混合培养时培养液中的氮含量和磷含量较单独培养时也减少。推测这种现象的原因可能有两种情况：一是由于三种菌混合培养时，生长空间有限所致，另一方面来就可能自于GNF1的抑菌活性物质的作用。
[0020] 表1 固氮菌GNW、解磷菌HP2和GNF1混合培养的相互作用结果。
[0021]处理 N（mg/L） P（mg/L） HP2(108CFU/mL) GNW(108CFU/m)
不接种 37.24±1.59 273.51±3.68 0 0
HP2 26.66±2.43 331.45±3.42 14.72±0.69 0
GNW 28.34±3.57 214.72±2.56 0 3.24±0.37
GNF1+GNW 27.79±2.83 193.46±4.42 0 2.39±0.83
GNF1+HP2 20.96±1.21 227.06±3.51 9.07±0.65 0
GNF1+GNW+HP2 14.11±2.48 231.47±1.96 9.49±0.68 2.04±0.26
不接种 37.24±1.59 273.51±3.68 0 0
HP2 26.66±2.43 331.45±3.42 14.72±0.69 0
GNW 28.34±3.57 214.72±2.56 0 3.24±0.37
GNF1+GNW 27.79±2.83 193.46±4.42 0 2.39±0.83
GNF1+HP2 20.96±1.21 227.06±3.51 9.07±0.65 0
GNF1+GNW+HP2 14.11±2.48 231.47±1.96 9.49±0.68 2.04±0.26
[0022] 2.GNF1抑菌作用的验证。
[0023] 2.1 GNF1的发酵培养液，经10000 r/min离心5 min，得到上清液经微孔滤膜过滤后，分别加入HP1和GNW已灭菌好的培养基中，28℃培养48h，按照（发酵液/mL+蒸馏水/mL）0+1000、10+990、20+980、40+960、80+920，分五组培养，重复3次。同时用稀释平板法在无氮培养基和无机磷培养基上测定GNW和HP2的数量，同时增加考查发酵液对大肠杆菌E.coli 的抗菌作用。
[0024] 经过发酵培养之后分别涂板计数，得到结果如图1所示。实验结果显示HP2、GNW和大肠杆菌的细胞数量随着GNF1发酵液添加量的增加而下降，呈现一定的量效关系，推测GNF1代谢产物或分泌物中一定含有某种抑菌活性成分。
[0025] 2.2 用营养琼脂培养基培养指示菌GNW和HP2，用管碟法[10]直接测定摇瓶发酵液抗菌活性，用30 pg/mL的链霉素做对照，每管加试液20μL。方法同上，除GNW和HP2之外，另选大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球(Staphylococcus aureaus)、和变形杆菌(Proteus vulgaris)等原核病原微生物作为受试菌株。
[0026] 结果见表2,显示发酵液对GNW和HP2土壤根际促生菌有抑制作用，并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌等原核病原菌也具有很好的抑制作用。提示其抑菌活性成分可应用到动物或人体皮肤肠道等，开发具有抗菌作用或者调节菌群的微生态制剂。
[0027] 表2 菌株GNF1发酵液的抑菌活性结果
[0028]
[0029] [0026] 3.形态学特征，菌株GNF1具有典型的链霉菌属(Streptomyces)的特征：基内菌丝多分枝，不断裂，气生菌丝丰富，孢子链直且长，偶有波曲，孢子呈柱状。菌株在多数培养基上生长良好，气高氏淀粉琼脂上气生菌丝体白至杏仁黄色，成熟时粉红发紫。基内菌丝体玳瑁黄风帆黄色。可溶性色素微染；克氏合成1号琼脂、察氏琼脂、淀粉铵盐琼脂：
气丝粉红色或粉红秸草色，毛状和粉状。基丝好，无色或略微黄色、秸草色、浅棕色或微黄褐色。无可溶色素。
气丝粉红色或粉红秸草色，毛状和粉状。基丝好，无色或略微黄色、秸草色、浅棕色或微黄褐色。无可溶色素。
[0030] 4.生理生化特征，实验菌株GNF1的生长温度范围为10～40℃，最适温度为28℃。生长pH 范围为6.0～8.5，最适pH 7.0 能在含0～1.5 mol／L NaCl的ISP2和MBA琼脂上生长，最适生长盐浓度为0.2～0.5 mol／L NaCl。明胶液化、淀粉水解、硫化氢产生阴性；不能水解Tween20和酪素(Casein)；黑色素产生、牛奶胨化、纤维素水解和硝酸盐还原阴性。菌株GNF1能利用多种物质做碳源和氮源(表3)。菌株GNF1全细胞水解产物中含甘氨酸、天门冬氨酸等氨基酸，含葡萄糖、半乳糖、木糖和核糖等糖类。上述这些结果与链霉菌属特征相符。
[0031] 表3 GNF1的生理生化特性。
[0032]碳源 结果 碳源 结果碳源 结果 氮源 结果
葡萄糖 + 麦芽糖 + 蔗糖 + 丙氨酸 +
果糖 + 甘露醇 + 山梨醇l + 甘氨酸 +
淀粉 + 甘露糖 + 海藻糖 + 苏氨酸 +
半乳糖 + 棉子糖 + 木糖 _ 谷氨酸 _
乳糖 _ 鼠李糖 + 木糖醇 + 酪氨酸 _
丙三醇 _ 核糖 + 甲硫氨酸 +
肌醇 + 醋酸钠 + 天冬酰胺 +
阿拉伯糖 + 纤维二糖 _ 天门冬氨酸 _
葡萄糖 + 麦芽糖 + 蔗糖 + 丙氨酸 +
果糖 + 甘露醇 + 山梨醇l + 甘氨酸 +
淀粉 + 甘露糖 + 海藻糖 + 苏氨酸 +
半乳糖 + 棉子糖 + 木糖 _ 谷氨酸 _
乳糖 _ 鼠李糖 + 木糖醇 + 酪氨酸 _
丙三醇 _ 核糖 + 甲硫氨酸 +
肌醇 + 醋酸钠 + 天冬酰胺 +
阿拉伯糖 + 纤维二糖 _ 天门冬氨酸 _
[0033] 注：结果“+”表示阳性；“—”表示阴性。
[0034] 5.GNF1菌株分子分析与鉴定。
[0035] GNF1菌株DNA的G+C含量测定参照Marnut方法进行（该方法见：Marmur J,Doty P.Determination of base composition of deoxyribonucleic acid from its denaturation temperature.Journal of Molecular Biology,1962,5:109-ll8.），以大肠杆菌DNA的G+C含量为对照。选用天根生化科技公司试剂盒提取菌株基因组DNA作为PCR的扩增模板，采用细菌16S rDNA通用引物27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′1492r5′-TACGGT TACCTTGTTACGACTT-3′进行16S rDNA的扩增。扩增体系采用上海生物工程公司PCR扩增试剂盒。PCR产物测序后，利用相关软件进16SrDNA扩增序列分析，获得菌株聚类分析结果。
[0036] 结果发现，菌株G+C含量为71.2％，16SrRNA扩增序列长度为1458 bp，电泳结果在1500bp附近有明显的条带出现，如图2所示。进一步的Blast与聚类分析显示，与GNF1菌株16SrRNA同源性较高的菌株均为链霉(Streptomyces)放线菌。选择12条同源性较高的16SrRNA序列来构建系统发育树发现,GNF1菌株与细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）的16S rRNA序列仅相差6个碱基，同源性达99.6％，如图3所示。结合菌株的形态和生理生化特征，初步鉴定将GNF1菌株暂定为Streptomyces microflavus。
[0037] 6.发酵液抗菌活性测定，对菌株GNF1的发酵液分别用氯仿和正丁醇萃取，有机相合并，于45℃蒸干，用等体积甲醇或二甲基氯化亚砜溶解，测定其抑菌活性，用水相做对照。按常规方法，通测定处理后抑菌圈的直径，进行发酵液中有效抑菌物质的溶解性和紫外线、热和酸碱稳定性试验，受试菌株为HP2。
[0038] 结果表明，抑菌物质具有较强的脂溶性，易溶于氯仿、正丁醇等有机溶剂，也显示出良好的抑菌效果，而萃取后的水相没有抑菌活性。用紫外线、高温和强酸强碱对发酵液进行处理，测定其抗菌活性。另外初步研究结果表明抑菌活性物质具有良好的光稳定性和热稳定性。发酵液在紫外灯下照射30 min后，抑菌活性基本没变；在30℃～45℃之间抑菌活性稳定，在45℃～60℃之间有些许下降，大于60℃后处理1h其抑菌活性逐渐降低；可是抗菌活性物质的酸碱稳定性较差，只在pH 5.0～7.5的条件下有较强抑菌活性，在低于4.8或高于8.0的环境下活性大为降低。活性物质的分离、纯化和结构解析等研究正在进行中。
[0039] 综合以上实验结果显示，菌株GNF1具有链霉菌(Streptomyces)菌株典型的特征，应归属于此属。形态学与分子生物学分类鉴定结果表明，GNF1菌株虽然同细黄链霉菌的16S rRNA扩增序列同源性达99.6％ ，但仅依据16SrRNA确定其种的分类地位存在一定的局限性。其最终的分类地位仍需与模式种 Streptomyces microflavus 进行DNA分子杂交，并结合两菌株的生理生化特性才能确定。因此认为该菌株是新株。该菌株在液体发酵条件产生抗菌物质，对多种微生物有拮抗作用。而且抗菌谱较广，对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)以及一些植物根际促生菌都有较强的抑制作用。该活性物质成分可能是GNF1分泌的，也可能是其代谢产物的某种成分与培养液中的诸多成分之间的复杂作用，转变成了具有抑菌作用的物质。
[0040] 我们推测，该菌株是同种的某些具有刺激作物生长作用的细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）菌株经过长期的发酵、繁殖，发生了突变等效应，从而表现出较强的抑菌作用。因此，复合微生物有机肥应对其菌株做定期的观测，以减少此类菌株的存在。关于该菌株对植物根际促生菌的抑制作用的报道，国内外尚属首次。