增强的启动子以及使用该启动子产生L-赖氨酸的方法

摘要

本发明提供了具有增强的启动子活性的核酸分子，所述核酸分子来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)并与编码天冬氨酸氨基转移酶的基因可操作地连接；本发明还提供了含有所述核酸分子的载体，被所述载体转化的转化子，以及使用所述转化子产生L-赖氨酸的方法。

权利要求

1.具有启动子活性的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO：2、3和4。

2.核酸分子，由权利要求1所述的核苷酸序列和与其可操作地连接的编码天冬氨酸氨基转移酶的基因组成。

3.载体，其包含权利要求1或2所述的核酸分子。

4.被权利要求3的载体转化的转化子。

5.如权利要求4所述的转化子，其中所述转化子属于棒杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)。

6.如权利要求4所述的转化子，其中所述转化子通过保藏号KCCM11061P识别。

7.如权利要求4所述的转化子，其中所述转化子通过保藏号KCCM11062P识别。

8.如权利要求4所述的转化子，其中所述转化子通过保藏号KCCM11063P识别。

9.如权利要求4所述的转化子，其中权利要求1或2所述的核酸分子通过同源重组被插入至染色体中。

10.如权利要求4所述的转化子，其中权利要求1或2所述的核酸分子被保持为质粒形式。

11.产生赖氨酸的方法，包括培养权利要求6-8中任一项所述的转化子的步骤。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括回收在上述培养步骤中所产生的赖氨酸的步骤。

说明书

增强的启动子以及使用该启动子产生L-赖氨酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及增强的启动子以及使用该启动子产生L-赖氨酸的方法。

背景技术

[0002] 棒状细菌是广泛应用于生产氨基酸和各种核酸的工业微生物。棒状细菌为革兰氏阳性细菌，用于生产在动物饲料、药物、食品加工等领域具有多种工业应用的化学物质，包括诸如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸和谷氨酸的氨基酸和各种核酸，棒状细菌的生长需要生物素。棒状细菌的特征为劈裂(snapping division)并且很少降解所产生的代谢物。这类棒状细菌的实例为：棒状细菌属，包括谷氨酸棒状细菌(Corynebacteriumglutamicum)；短杆菌属包括黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)；节杆菌属种(Arthrobacter sp.)和微杆菌属种(Microbacterium sp.)。

[0003] 作为L-氨基酸的一种，L-赖氨酸在商业上用作动物饲料添加剂，因为它能够通过增加其他氨基酸的吸收而改善饲料的质量；L-赖氨酸还用在人类的药物中，特别是作为输注溶液的成分；它还用于制药工业。因此，赖氨酸的工业生产已经成为经济上重要的工业过程。

[0004] 为了改进赖氨酸生产的效率，已经通过扩增赖氨酸合成途径中的个体基因或修饰它们的启动子以提高生物合成途径中的酶促活性。锚定有参与赖氨酸生物合成途径的增强的基因的棒杆菌菌株以及生产赖氨酸的方法在本领域中是公知的。例如，美国专利第6,746,855号公开了具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因)的棒杆菌菌株，在该菌株中还额外导入了选自dap A基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因，该文献还公开了通过培养所述菌株产生赖氨酸的方法。此外，美国专利第6,221,636号公开了带有重组DNA的棒状细菌，所述重组DNA包含编码天冬氨酸激酶的DNA序列(其中L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制活性被基本脱敏化)和编码二氨基庚酸脱羧酶的DNA序列。美国专利申请第20060003424号公开了使用棒状细菌产生L-氨基酸的方法，所述棒状细菌通过对GDH基因、CS基因、ICDH基因、pDH基因或产生ACO的基因的启动子进行修饰以使其接近共有序列，从而具有改进的酶促活性。

[0005] 为了通过基因工程或代谢工程方法从这类棒状细菌开发高效价的菌株，应该在棒状细菌中选择性地调节参与几种代谢途径的基因的表达。为此目的，重要的是调节启动子的活性，启动子是调节区域，它负责募集RNA聚合酶而启动DNA分子的转录。

[0006] 迄今为止，并没有通过改进天冬氨酸氨基转移酶(EC；2.6.1.1；aspB)基因的启动子而使棒状细菌具有高表达水平的报道，天冬氨酸氨基转移酶(EC；2.6.1.1；aspB)被认为在为赖氨酸生物合成途径提供赖氨酸前体——天冬氨酸的过程中起重要作用。

发明内容

[0007] 技术问题

[0008] 因此，本发明人致力于通过改进aspB基因的启动子来提高表达水平。最终，他们提供了属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，通过碱基置换改进在棒杆菌属染色体上的aspB启动子并导入所述改进的启动子，使得所述微生物的天冬氨酸氨基转移酶活性高于其内源性活性，由此完成了本发明。

[0009] 技术方案

[0010] 本发明的目的是提供具有增强的启动子活性的核酸分子，所述核酸分子来源于谷氨酸棒杆菌。

[0011] 本发明的另一目的是提供包含所述具有增强的启动子活性的核酸分子的载体。

[0012] 本发明的仍然另一目的是提供被所述载体转化的转化子。

[0013] 本发明的仍然另一目的是提供产生赖氨酸的方法，所述方法包括培养所述转化子的步骤。

[0014] 有益效果

[0015] 本发明的具有增强的启动子活性的核酸分子与aspB基因可操作地连接并且来源于谷氨酸棒杆菌，表现出比野生型更高的启动子活性，并且因此改进了天冬氨酸氨基转移酶活性，由此提高了赖氨酸的生产效率。

附图说明

[0016] 图1显示的是用于插入至棒杆菌染色体中的载体pDZ；

[0017] 图2显示的是用于将碱基置换入棒杆菌中的载体pDZ-aspBP1；

[0018] 图3显示的是用于将碱基置换入棒杆菌中的载体pDZ-aspBP2；和

[0019] 图4显示的是用于将碱基置换入棒杆菌中的载体pDZ-aspBP3。

[0020] 最佳方式

[0021] 在为实现上述目的的一个方面中，本发明涉及具有增强的启动子活性的核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO：2、3和4中任一种的碱基序列。

[0022] 在一个优选实施方案中，所述碱基序列可与编码天冬氨酸氨基转移酶的基因可操作地连接，并且可以来源于棒杆菌属。

[0023] 本文所使用的术语“启动子”表示DNA区域，聚合酶与该区域结合以启动基因转录，也就是说，它是不被翻译的核酸序列，通常发现于编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。

[0024] 本发明的具有启动子活性的谷氨酸棒杆菌核酸分子与编码天冬氨酸氨基转移酶的基因可操作地连接。所述编码天冬氨酸氨基转移酶的基因为aspB基因，它是参与棒杆菌属的赖氨酸生物合成途径的主要基因。天冬氨酸氨基转移酶通过催化将氨基从谷氨酸转移给草酰乙酸的反应而提供赖氨酸生物合成的前体——天冬氨酸。因此，当天冬氨酸氨基转移酶的活性提高时，赖氨酸生物合成的前体天冬氨酸也会增多，从而导致赖氨酸生物合成的提高。另外，本文所使用的术语“可操作地连接”意指本发明的具有启动子活性的核酸序列与编码天冬氨酸氨基转移酶的基因功能性连接，以启动和介导所述编码序列的转录，表明本发明的具有启动子活性的核酸序列与aspB基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。

[0025] 迄今为止，在aspB基因的启动子上启动基因转录的转录起始位点还未被识别。

[0026] 因此，在一个具体实例中，本发明人实施5’-RACE(5’cDNA末端快速扩增)技术(Sambrook，J.，Russell，D.W.Molecular Cloning：a laboratorymanual(分子克隆：实验室手册)3rd ed.8.54)以识别aspB基因的转录起始位点。5’-RACE是使用已知的mRNA克隆未知的5’上游区域的方法，该方法使用可获自Takara公司的5’-Full Race core set(Cat.No.6122)进行。结果，aspB基因的转录起始位点识别为发现于起始密码子ATG上游72bp处的G。

[0027] 将所识别的转录起始位点计数为+1，筛选了启动子共有序列区域以用于改进。

[0028] 本发明的具有启动子活性的核酸序列是改进的谷氨酸棒杆菌的aspB启动子，其特征在于它比野生型启动子具有更高的启动子活性。启动子活性的改进可以通过任何本领域已知的方法不加限制地实现。优选地，为了改进启动子，可以通过缺失、插入、非保守性置换和保守性置换，或者它们的组合来诱导谷氨酸棒杆菌的aspB基因的启动子序列中的突变。

[0029] 本发明的启动子核酸分子可以使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，可以使用合适的引物序列通过PCR来分离本发明的启动子核酸分子。此外，也可以使用自动DNA合成仪通过标准合成技术来制备本发明的启动子核酸分子。

[0030] 在一个具体实例中，本发明人基于美国国立卫生研究院(NIH)的GenBank获得了含有aspB基因(NCBI登记号No.NCgl0237)的启动子区域的碱基序列(SEQ ID NO：1)，然后，在此基础上，他们合成了八种引物(SEQ ID NO：10至17)。随后，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，并使用上述引物进行了PCR，以获得本发明的核酸分子，所述核酸分子中含有具有经修饰序列(SEQ ID NO：2、3和4)的启动子。

[0031] 本发明的具有谷氨酸棒杆菌启动子活性的核酸分子可以被用作原核细胞的基因表达的启动子，所述原核细胞特别地为大肠杆菌(E.coli)或棒状细菌。本文所使用的术语“棒状细菌”包括属于棒杆菌属或短杆菌属()、节杆菌属种和微杆菌属种的微生物。这样的棒状细菌包括谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539、黄色短杆菌ATCC 14067、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC 13869以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株，例如谷氨酸棒杆菌KFCC 10881和谷氨酸棒杆菌KFCC 11001，其中优选的是谷氨酸棒杆菌KFCC 10881，但并不限于上述菌株。

[0032] 在仍然另一方面，本发明涉及包含所述具有增强的启动子活性的核酸分子的载体。

[0033] 本文所使用的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达靶基因。这样的控制序列可包括用于指导转录的启动子，用于控制这类转录的某些操纵子序列，编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译的终止的序列。

[0034] 本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体可为质粒，噬菌体颗粒或简单地为潜在的基因组插入物，优选的载体为pECCG122载体(Kab-Su Noh et al.，Kor.Jour.Microbiol.July.1991p.149-154)，但是并不限于上述载体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。

[0035] 特别地，将本发明的载体导入宿主细胞，以使得在载体内的具有启动子活性的核酸分子序列与宿主基因组中的内源性aspB基因的启动子区域之间发生同源重组，这样所述载体可以整合至基因组中。因此，本发明的载体还可包括用于确保插入至染色体中的筛选标记。所述筛选标记用于筛选被转化的细胞，也就是用于确保靶基因的插入，所述筛选标记可包括提供可筛选表型的标记，所述可筛选表型例如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒剂的抗性或者表面蛋白的表达。只有表达所述筛选标记的细胞才能够在含有筛选物的环境下存活或表现出不同的表型，由此就可以筛选被转化的细胞。优选的，本发明的载体可包含lacZ基因。

[0036] 在本发明的一个具体实例中，本发明人构建了这样一种载体：它能够通过同源重组而用突变的启动子序列置换谷氨酸棒状细菌的aspB基因的启动子区域，从而改进启动子的活性。首先，使用限制性酶处理大肠杆菌克隆载体pACYC177以制备平端；为了插入lacZ基因，用PCR通过基因扩增从大肠杆菌E.coli K12 W3110的基因组DNA中制备lacZ基因，通过设计PCR以使得所述lacZ基因含有其启动子；然后再插入含有多个限制性酶识别位点的接合体序列，以构建用于插入至棒杆菌染色体中的载体pDZ(图1)。然后，如上所述，将所制备的在aspB基因的启动子中含有突变的具有高启动子活性的核酸分子插入至所述pDZ载体的接合体区域中，从而构建出含有SEQ ID NO：2(图2)的核酸序列的载体pDZ-aspBP1、含有SEQ ID NO：3(图3)的核酸序列的载体pDZ-aspBP2和含有SEQ ID NO：4(图4)的核酸序列的载体pDZ-aspBP3。

[0037] 在仍然另一方面，本发明涉及被所述载体转化的转化子。

[0038] 本文所使用的术语“转化”意为通过下述方式将DNA导入宿主，所述方式使得被导入的DNA能够以染色体外元件的形式进行复制或者通过染色体整合的方式进行复制。在一个优选实施方案中，在使用所述载体转化宿主细胞之后，所述载体内的具有启动子活性的核酸序列可通过与宿主基因组中的内源性aspB基因的启动子区域发生同源重组，从而整合至染色体内，或者所述核酸序列也可以保持为质粒形式。

[0039] 本发明载体的转化方法可包括任何将核酸导入细胞的方法，并且可以根据宿主细胞而使用本领域已知的合适的标准技术进行。所述方法的实例包括电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

[0040] 对于外源DNA具有高导入效率、并且对于所导入的DNA具有高表达水平的宿主细胞通常可被用作宿主细胞。可用的宿主细胞可为包括原核细胞或真核细胞的全部微生物，优选地为大肠杆菌或棒状细菌，更优选地为棒杆菌属或短杆菌属的细菌，再更优选地为谷氨酸棒杆菌KFCC10881。

[0041] 被本发明的载体转化的转化子的特征为：使用经过突变而具有增强的启动子活性的启动子序列通过同源重组置换了谷氨酸棒杆菌的asp基因的启动子区域，从而使得所述转化子具有带有增强的启动子的aspB基因，由此提供了比野生型更高的天冬氨酸氨基转移酶的活性。

[0042] 在本发明的一个具体实例中，将本发明的含有SEQ ID NO：2(图2)的具有启动子活性的核酸分子的载体pDZ-aspBP1、含有SEQ ID NO：3(图3)的具有启动子活性的核酸分子的载体pDZ-aspBP2和含有SEQ ID NO：4(图4)的具有启动子活性的核酸分子的载体pDZ-aspBP3的每一种转化至谷氨酸棒杆菌KFCC10881中，以制备每一种具有增强的aspB启动子活性的转化子。在本发明中，将被pDZ-aspBP1转化的转化子、pDZ-aspBP2转化的转化子和pDZ-aspBP3转化的转化子分别命名为KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3。将每一种转化子的天冬氨酸氨基转移酶的活性与亲本菌株KFCC10881的活性进行比较。发现各种转化子的活性分别为亲本菌株活性的2.1倍、2.6倍和1.8倍(表3)，表明本发明的增强的启动子改进了天冬氨酸氨基转移酶的活性。此外，由于所述转化子已被证明具有改进活性的效果，因此将KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3分别命名为CA01-773、CA01-774和CA01-775，并于2010年2月5日保藏于韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms，下文中简称为“KCCM”)，其保藏号分别为KCCM11061P、KCCM11062P和KCCM11063P。

[0043] 在仍然另一方面，本发明涉及产生赖氨酸的方法，包括培养所述转化子的步骤。

[0044] 在本发明中，所述转化子的培养可以根据本领域的常规方法进行，并可以合适地控制各种条件例如温度、时间和培养基的pH值。已知的培养方法在本领域的文献中有所描述[Chmiel；Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)， 和 Storhas；Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)]。此外，培养方法包括批次培养、连续培养和分批补料培养。优选地，可以通过批次工艺、分批补料工艺或重复分批补料工艺来连续地培养所述微生物，但是所述方法并不限于上述方法。

[0045] 培养中所使用的培养基需要满足具体菌株以合适方式生长所需要的要求。用于各种菌株的培养基公开于例如美国细菌学会(American Societyfor Bacteriology)出版的“Manual of Methods for General Bacteriology(普通细菌学方法手册)”(Washington D.C，USA，1981)中。培养基中使用的碳源可为糖类和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)，油和脂肪(例如豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)，脂肪酸(例如软脂酸、硬脂酸和亚麻酸)，醇(例如甘油和乙醇)以及有机酸(例如乙酸)。碳源可单独使用或以混合物的形式使用。氮源也可以为含氮的有机化合物(如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、尿素)或无机化合物(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。氮源可单独使用或以混合物的形式使用。磷源可以为磷酸二氢钾，磷酸氢二钾或它们的钠盐。此外，培养基应该含有生长必需的金属盐(如硫酸镁或硫酸铁)。最后，除了以上所述的物质之外，培养基还可包含生长必需的物质，例如氨基酸和维生素。还可以在所述培养基中添加合适的前体。这些培养基的组分可以在一批中加入或者在培养过程中连续加入。

[0046] 可以使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)来调节培养基的pH值。可以添加消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来防止气泡的形成。可以通过将氧气或含氧气体(例如空气)注入到培养基中以维持有氧状态。当培养生物体时，培养基通常被维持在20至45℃的温度范围内，优选地在25至40℃的范围内。所述培养一直持续到L-氨基酸的产量达到最大值。为此目的，需要花费10至160小时以获得最大量的L-赖氨酸。这种氨基酸可能被释放到培养基中或可能还保留在细胞内。

[0047] 同时，包括培养本发明的转化子的步骤的用于产生赖氨酸的方法还可包括回收在上述培养步骤中所产生的赖氨酸的步骤。从细胞或培养基中回收L-赖氨酸的方法是本领域公知的。L-赖氨酸回收方法的实例包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC。实施例

[0048] 在本发明的实施例中，识别了aspB基因的转录起始位点，以便进行增强的启动子的构建，并且构建了重组载体，以便通过同源重组用所述增强的启动子置换产生赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC 10881中的aspB启动子。将所述载体转化至谷氨酸棒杆菌KFCC10881中，以获得在染色体中带有增强的启动子的菌株，由此所述菌株能够以高效率产生赖氨酸。

[0049] 在本发明中使用的谷氨酸棒杆菌KFCC 10881菌株是带有S-(2-氨基乙基)半胱氨酸(AEC)抗性和高丝氨酸营养缺陷特征的菌株，该菌株是以野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)为亲本，通过人工突变而制备的(参见韩国专利第0159812号和第0397322号)。

[0050] 下面，将参照下述实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并不意欲以这些实施例限制本发明。

[0051] 实施例1：aspB基因的转录起始位点的识别

[0052] 在本实施例中，识别了aspB基因的未知转录起始位点。

[0053] 为了识别aspB基因的转录起始位点，使用了5’-RACE(5’cDNA末端快速扩增)技术(Sambrook，J.，Russell，D.W.Molecular Cloning：a laboratorymanual(分子克隆：实rd验室手册)3 ed.8.54)。5’-RACE是使用已知的mRNA克隆未知的5’上游区域的方法，该方法使用获自Takara公司的5’-Full Race core set(Cat.No.6122)进行。

[0054] 为了进行5’-RACE实验，基于美国国立卫生研究院(NIH)的GenBank中登记的aspB基因(NCBI登记号No.NCgl0237)的碱基序列合成了5种引物(表1，SEQ ID NO：5至9)。

[0055] 表1

[0056]引物 碱基序列 SEQ ID NO：
aspB(race)/RT P-ccaagacctgctcc(5’磷酸化的) 5
aspB(race)/F1 Tactcgcggtaagccttcg 6
aspB(race)/R1 Cttgagctcatcaaacttgc 7
aspB(race)/F2 Gatttcgctgatgagttgttg 8
aspB(race)/R2 Gcttaatgtcctcgtggaac 9

[0057] 首先，从ATCC 13032菌株中提取mRNA，然后使用特异性针对aspB基因mRNA的5’末端磷酸化RT引物(SEQ ID NO：5)通过逆转录反应合成第一链cDNA。然后，通过RNaseH处理降解杂合DNA-RNA中的RNA链，再用将RNA连接酶将单链cDNA环化(或连接为多联体形式)。

[0058] 在连接完成后，使用所述样品作为模板、SEQ ID NO：6和7作为引物进行PCR，以获得初级PCR产物。然后再使用初级PCR产物作为模板、SEQ ID NO：8和9作为引物进行PCR，以获得次级PCR产物。PCR在下述条件下进行：(95℃变性30秒；55℃退火30秒；以及72℃聚合1分钟)×30个循环。对最终的PCR产物进行纯化，并通过测序来进行碱基序列分析。

[0059] 作为碱基序列分析的结果，发现于起始密码子ATG上游的72bp处的G被识别为aspB基因的转录起始位点。将所识别到的转录起始位点计数为+1，筛选了启动子共有序列区域以用于改进。

[0060] 实施例2：用于启动子改进的重组载体的构建

[0061] <2-1>用于染色体插入的载体(pDZ)的构建

[0062] 在本实施例中，在大肠杆菌克隆载体pACYC177(New England Biolab，GenBank登录号#X06402)的基础上构建了用于插入至棒杆菌染色体中的载体pDZ。

[0063] 使用限制性酶AcuI和BanI处理pACYC177载体，然后进行克列诺(klenow)处理以获得平端。通过PCR从大肠杆菌K12W3110的基因组DNA中扩增用作筛选标记的大肠杆菌来源的lacZ基因，设计所述PCR以使得扩增出的片段包括该基因的启动子，用T4 DNA聚合酶和多核苷酸激酶进行处理以产生平端和5’端的磷酸化。将上述两种DNA片段彼此连接以生成环状DNA分子，然后在所述环状DNA分子的BamHI限制性位点处插入人工合成的含有多个限制性位点的接合体序列，以构建用于插入至棒杆菌染色体中的载体pDZ。图1是显示用于插入至棒杆菌染色体中的载体pDZ的示意图。

[0064] <2-2>用于改进aspB启动子的重组载体的构建

[0065] 在本实施例中，构建了一个重组载体，以便改进来源于产生赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌的aspB基因的启动子。

[0066] 首先，基于美国国立卫生研究院(NIH)的GenBank，获得了含有aspB基因(NCBI登记号No.NCgl0237)的启动子区域的碱基序列(SEQ ID NO：1)，并且获得了含有经修饰的启动子序列的DNA片段(SEQ ID NO：2、3和4)。每种经修饰的启动子均是基于一般微生物中已知的启动子共有序列而设计的。

[0067] 此外，基于上述碱基序列，合成了用于制备经修饰的启动子序列的八种引物(表2，SEQ ID NOs.10至17)。

[0068] 表2

[0069]引物 碱基序列 SEQ ID NO：
aspB/PF c cgg gga tcc tct aga ataggggatttgaacccctgag 10
aspB/PR g cag gtc gac tct aga gccatagttacggacatcag 11
aspB/P1R ag ccactatactaga cgttttaggggatccc 12
aspB/P1F TCTA G TATAGT GG cttgaggtcactgctc 13
aspB/P2R ag ccactatacCaCa cgttttaggggatccc 14
aspB/P2F TGTG G TATAGT GG cttgaggtcactgctc 15
aspB/P3R ag ccattatacCaCa cgttttaggggatccc 16
aspB/P3F TGTG G TATAAT GG cttgaggtcactgctc 17
aspB/mut1 CccctaaaacgtGtG 18
aspB/mut2 CcctaaaacgtctagT 19

[0070] 为了获得来源于谷氨酸棒杆菌的aspB基因的启动子序列，使用谷氨酸棒杆菌TMKFCC10881染色体DNA作为模板、表2中的寡核苷酸对作为引物进行PCR。使用PfuUltra高保真DNA聚合酶作为聚合酶，PCR条件如下：(95℃变性30秒；55℃退火30秒；以及72℃聚合1分钟)×30个循环。结果获得了在一端含有被置换区域的300bp的DNA片段。使用SEQ ID NO：10和12作为引物扩增得到aspBP1-1；使用SEQ ID NO：11和13作为引物扩增得到aspBP1-2。将pDZ载体预先用XbaI限制性酶进行消化，再与上述扩增产物相混合，然后使用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA)进行克隆，以获得pDZ-aspBP1载体。

[0071] 按照与制备pDZ-aspBP1相同的方式，还构建了pDZ-aspBP2和pDZ-aspBP3载体，区别仅在于：在扩增插入片段时，使用SEQ ID NO：10和14作为引物扩增得到aspBP2-1；使用SEQ ID NO：11和15作为引物扩增得到aspBP2-2，并由此制备pDZ-aspBP2；使用SEQ ID NO：10和16作为引物扩增得到aspBP3-1；使用SEQ ID NO：11和17作为引物扩增得到aspBP3-2，并由此制备pDZ-aspBP3。图2、3和4显示了用于将碱基置换入棒杆菌的载体pDZ-aspBP1、pDZ-aspBP2和pDZ-aspBP3，它们各自分别含有对应于SEQ ID NO：2、3和4的aspBP1、aspBP2和aspBP3。

[0072] 实施例3：将重组载体插入至谷氨酸棒杆菌菌株中

[0073] 在本实施例中，为了改进棒杆菌染色体上的aspB启动子，将所构建的重组载体转化入产生赖氨酸的谷氨酸棒杆菌KFCC10881中，通过同源重组用载体的启动子序列替换了染色体上的启动子序列，使得增强的启动子序列被插入至染色体中。

[0074] 用于在棒杆菌中进行碱基置换的重组载体pDZ-aspBP1、pDZ-aspBP2和pDZ-aspBP3中的每一个均被设计为包括具有实施例2中的增强启动子序列的DNA片段，通过电脉冲法将上述载体转化入谷氨酸棒杆菌KFCC10881中(根据Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545进行转化)，在含有25mg/L卡那霉素的培养基上筛选转化子，以筛选出其中由于同源性而使目的基因插入至染色体中的转化子。

[0075] 在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的固体培养基上出现蓝色则表明基因已经成功地通过载体插入至核DNA中。将插入染色体的原代菌株在营养肉汤中-4 -10振荡培养(30℃，8hrs)，然后系列稀释为10 至10 浓度，再涂抹在含有X-gal的固体培养基上。所生长的大部分菌落都出现蓝色染色。选出占所生长菌落小部分的白色菌落。通过次级传代筛选出在aspB启动子中含有碱基置换的菌株。在最后筛选之前，通过PCR对这些菌株的相应区域内的碱基置换和碱基序列进行分析。

[0076] 通过PCR对启动子中的碱基置换进行分析，所使用的引物如下：针对aspBP1使用SEQ ID NO：11和19；针对aspBP2使用SEQ ID NO：11和18；针对aspBP3使用SEQ ID NO：11和18；通过碱基序列分析对靶区域进行最后测试。

[0077] 最后，通过次级传代获得了在染色体上的aspB启动子中含有碱基置换的产生赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3，将它们分别命名为CA01-773、CA01-774和CA01-775。并于2010年2约5日保藏于韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms)，保藏号分别为KCCM11061P、KCCM11062P和KCCM11063P.

[0078] 实施例4：含有增强的aspB启动子的菌株中天冬氨酸氨基转移酶活性的评估[0079] 为了评估亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881和实施例3中最终制备的产生L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3的天冬氨酸氨基转移酶的活性，按照下述方式进行培养并从培养基中分离蛋白以评估天冬氨酸氨基转移酶活性。

[0080] 将每种菌株培养至对数生长期，然后将培养基以OD600为0.3的密度接种于25ml的种子培养基中，然后培养至OD600值约为15。通过离心(5,000rpm，10min)从培养基中收集细胞，用0.1％的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗涤两次，然后悬浮于相同的缓冲液中使其在600nm处的光密度为160。向1.5ml悬液中加入1.25g玻璃珠，然后使用珠磨式研磨器破碎细胞6分钟。通过离心(13,000rpm，30min)收集上清液，并用Bradford方法(M.M 1976.Anal.Biochem.72：248-254)测定蛋白浓度，将所述上清液用作粗蛋白溶液进行天冬氨酸氨基转移酶活性的评估。

[0081] 天冬氨酸氨基转移酶的评估按下述方式进行：将0.1ml粗蛋白溶液加入至含有0.24M天冬氨酸、0.09M Tris(pH7.8)、0.64mM NADH、0.11mM磷酸吡哆醛、0.93kU/l MDH和
0.42kU/l LDH的反应溶液中，在30℃反应10分钟，然后加入12mM的2-酮戊二酸。在340nm处检测光吸收值的减少5分钟，然后计算天冬氨酸氨基转移酶活性。1单位(U)的天冬氨酸氨基转移酶活性被定义为1mg蛋白每分钟造成的NADH的减少量(nmole)。

[0082] 将 谷 氨 酸 棒 杆 菌 菌 株 KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2 和KFCC10881-aspBP3每种的天冬氨酸氨基转移酶活性与亲本谷氨酸棒杆菌菌株KFCC10881的活性进行比较。从结果中发现，KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3菌株的天冬氨酸氨基转移酶活性分别为亲本菌株的2.1倍、2.6倍和1.8倍(表3)。

[0083] 表3

[0084]菌株 天冬氨酸氨基转移酶活性(U) 倍数
KFCC10881P 196.5 1
KFCC10881P-aspBP1 417.3 2.1
KFCC10881P-aspBP2 517.1 2.6
KFCC10881P-aspBP3 359.8 1.8

[0085] *种子培养基(pH 7.0)

[0086] 粗糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO44g，K2HPO48g，MgSO4·7H2O0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(溶于1升蒸馏水)。

[0087] 实施例5：具有增强的aspB启动子的菌株中的赖氨酸产量

[0088] 为了产生L-赖氨酸，将用作亲本菌株的谷氨酸棒杆菌和实施例3中最终制备的产生L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3按照下述方式培养。

[0089] 将亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881和KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3接种于包含含有25ml下述组成的种子培养基的250ml角形挡板烧瓶中，然后在200rpm的搅拌条件下于30℃培养20小时。将1mL种子培养物接种于包含含有24ml下述组分的生产培养基的250ml角形挡板烧瓶中，然后在200rpm的搅拌条件下于30℃培养120小时。

[0090] 待培养结束后，通过HPLC检测L-赖氨酸产量。谷氨酸棒杆菌KFCC10881和KFCC10881-aspBP1、KFCC10881-aspBP2和KFCC10881-aspBP3的培养基中的L-赖氨酸产量示于下表4。

[0091] 表4

[0092]

[0093] *种子培养基(pH 7.0)

[0094] 粗糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO44g，K2HPO48g，MgSO4·7H2O0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(溶于1升蒸馏水)。

[0095] *生产培养基(pH 7.0)

[0096] 葡萄糖100g，(NH4)2SO440g，大豆蛋白2.5g，固体玉米浆5g，尿素3g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺3000μg，CaCO330g(溶于1升蒸馏水)。

[0097] 如上表4所示，发现具有的天冬氨酸氨基转移酶活性为亲本菌株KFCC10881的2.6倍的KFCC10881-aspBP2菌株所表现的赖氨酸产量比亲本菌株KFCC10881提高了5％。还发现具有的天冬氨酸氨基转移酶活性为亲本菌株的2.1倍的KFCC10881-aspBP1菌株和天冬氨酸氨基转移酶活性为亲本菌株的1.8倍的KFCC10881-aspBP3菌株所表现的赖氨酸产量比亲本菌株提高了3％。

[0098] 工业实用性

[0099] 本发明的来源于谷氨酸棒杆菌的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，由此改进了天冬氨酸氨基转移酶活性和赖氨酸生物合成的效率。因此，能够以高效率生产在工业上有用的L-氨基酸之一的L-赖氨酸。